JPH0242980A - ピラノースオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１上立■ユニ１ 本発明はピラノースオキシダーゼおよびその製造法に関
する。

支未至且」 ピラノースオキシダーゼはグルコースをグルコソンに酸
化する反応を触媒する酵素であり、酸化の際に酸素を吸
収し、過酸化水素を生成する。そのためピラノースオキ
シダーゼは生体試料中、または食品中のグルコースの量
の迅速な測定用試薬として用いられる。また反応生成物
であるＤ−グルコソンはＤ−フラクトースや２−ケト−
グルコン酸合成の中間体として有用である。

ピラノースオキシダーゼ生産菌としては、ポリポラス属
微生物、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　ｖ
ｏｌ　ＸＬＩ、ｐ１７０．１９７５）コリオラス属、ダ
エダレオブシス属、プロイロタス属、またはグロエオフ
イルム属微生物（特開昭５８−４３７８５号公報）、イ
ルペックス属、オウリキュラリア属、コプリナス属また
はトラメテス属微生物（特開昭６１−１７７９８６号公
報）、などが知られている。

が　　しよ　と　る口　占 しかしながら上記の方法によって得られたピラノースオ
キシダーゼは第１鉄イオン（Ｆｅ”″）によって阻害作
用を受けるため、たとえば生体試料中のグルコースの定
量に用いる場合にはＦｅ−を除去するために試料の前処
理が必要である。また従来より使用されているグルコー
スオキシダーゼは、１０％濃度のＮａＣｌによってもか
なり反応が阻害されており、高濃度の食塩含有試料中の
グルコースの定量に用いる場合にも同様に試料の前処理
が必要であった。また最高活性を示すｐＨの範囲が必ず
しも広（なかったので、定量試薬としての用途、特に食
品の分析用途が制限されていた。

発明者らは上記の欠点を除き、定量試薬等に広範囲に且
つ、簡便に用いられるピラノースオキシダーゼを効率よ
（生産する微生物を探索するため自然界よりスクリーニ
ングを行った結果、ピラノースオキシダーゼ生産能を有
する公知の微生物とは異なる担子菌の菌株を分離するこ
とに成功した。そしてこの菌株が生産するピラノースオ
キシダーゼが従来公知のピラノースオキシダーゼとは異
なるものであることを見出し本発明に到達したものであ
る。

１次および２次スクリーニングの結果、京都地方の土壌
から分離された最も活性の高いピラノースオキシダーゼ
生産能を有する真菌の菌株は囲ｄｉｏｍ　ｃｅｔｏｕｓ
　（ｕ」ｊＮｏ、５２と命名され、昭和６３年６月２７
日付工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
０１０６号として寄託された。

（以下本菌株を単にＮｏ、　５２株と呼ぶことがある。

本発明の真菌Ｎｏ、　５２株の菌学的性質は次のとおり
である。

（１）各培地における生育状況 ■麦芽エキス寒天培地 コロニーは円型、コロニーの表面は羊毛状、のち圧着性
を示し、白色を呈する。生育は良好である。

■ＹＰＳＳ寒天培地 コロニーは円型、コロニーの表面は羊毛状、のち綿毛状
で白色を呈する。生育はきわめて旺盛である。

■合成ムコール寒天培地 コロニーは円型、コロニーの表面は羊毛状、のち圧着性
を示し、白色を呈する。生育は良好である。

■ツアペック寒天培地 コロニーは円型１、コロニーの表面は薄層状に菌がのび
る。生育は遅い。

（２）形態 本発明の真菌Ｎｏ、５２株の顕微鏡写真は第１図のとお
りであり、これを人工培地、天然培地（木片、麦わら　
、穀物など）で培養したが分生子などの無性胞子、担子
胞子などの有性胞子は観察できなかった。

（３）生理的、生態的性質 ■最適生育条件 ｐＨ６で好気性を示す。最適生育温度は３０’Ｃである
。

■生育の範囲 ｐＨ３〜８で好気性で生育し、生育しつる温度は１５℃
〜３９℃である。

■ベノミル試験（参考文献Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ
　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　　Ｖｏｌ、５ｇ、Ｎｏ、１０．ｐ
９０２．１９７４　　）麦芽エキス・酵母エキス（ＭＹ
）寒天培地、ジャガイモ、ブドウ糖（ＰＤＡ）培地に農
薬ベノミルを５　ｐｐｍ加えた培地および無添加培地の
両方について生育状況を調べた。第２図は両培地におけ
る生育状況を示す写真であり、左がベノミル添加、右が
無添加培地であるが、両方とも同等な生育を示した。

本発明の真菌Ｎｏ、５２株は、以上述べたとおり、分生
子などの無性胞子、担子胞子などの有性胞子は見られな
かったが、ベノミル試験においてベノミル添加培地でも
生育してくることから、担子菌であると判断される。

ピラノースオキシダーゼ生産菌として知られているもの
には、ポリポラス属、コリオラス属、ダエダレオブシス
属、ブロイロタス属、グロエオフイルム属、イルペック
ス属、オウリキュラリア属、コプリナス属またはトラメ
テス属などに属する担子菌がある。本発明者らは本発明
の担子菌Ｎｏ、５２株とこれらの既知のピラノースオキ
シダーゼ生産菌とを、その形態学、生理学および生態学
的性質について詳細に比較検討した。その結果を第１表
に示す。

以下余白 ！：！　ｇ １へ ゴ駅１１．智′１−健一ω ｍ１哩ｔ！観世傳ヤ州ｚ２ 駆澹テテゴ＠健＋〇− ＋羅州榊　　・・ ・・　・・　、＋十へ　・・　・・　・・＋＋１＋＋、
＋ｌｌ　　ｌ　　＋１＋＋ 八 へ 第１表の結果を考察してみると、本発明の担子菌Ｎｏ、
５２は第１図に示すとおり菌糸にかすがい連結（クラン
プコネクション）を持たないことから、Ｃｏｒｉｏｌｕ
ｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　ＩＦＯ４９３７，Ｄａｅｄ
ａｌｅｏｐｓｉｓｓｔｙｒａｃｉｎａ　ＩＦＯ４９１０
，Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｓｅｐｉａｒｉｕｍ　Ｎ
ＲＲＬ１２５０６　、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅ
ａｔｕｓ　ＮＲＲＬ１２５０７．　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　
ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ　ＩＦＯ６１３９とは明らか
に異なるものである。またＩｒｐｅｘ　１ａｃｔｅｕｓ
　ＩＦＯ５３６７は菌糸にかすがい連結を持たず、ラッ
カーゼ反応も本発明の担子菌Ｎｏ、５２株と似ているが
、菌叢が全く異なっている。またＡｕｒｉｃｕｌａｒｉ
ａ　ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ　ＩＦＯ３０７７８はタンニ
ン酸含有培地に生育しない点で本発明の担子菌Ｎｏ、　
５２株と異なるものである。

次に本発明の担子菌Ｎｏ、５２株と公知の担子菌とを免
疫学的測定法を用いて比較し、免疫学的な面から菌の同
定を行った。その結果本発明のＮｏ、５２株は先行技術
に記載の菌のうち、現在までに入手した６属の菌株とは
免疫学的にも異なるものであると判断された。

江足」 オクテルロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）の免疫二
重拡散法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、０．　Ｐｒｏｇ、
Ａｌｌｅｒｇｙ、Ｖｏｌ、３０．１９６２）を用い、寒
天ゲル内沈降反応で、２次元の平板内を抗原及び抗体が
拡散して反応し、最適比のところに沈降線かつ（られる
のを観察した。

髭１盪ユ滅ユ 体重約３Ｋｇのウサギを用い、Ｎｏ、５２株の精製酵素
３ｍｇをＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔを混合し
、１週問おきに３回皮下注射し、最後の注射より１０日
後に抗体があることを確認後、採血することにより抗血
清を調製した。

Ｌ１旦立ユ」 中央の穴に上記の方法で作成したＮｏ、　５２株由来の
精製ピラノースオキシダーゼに対する抗血清を、その周
囲に各種の抗原を置き、抗原と抗体との間にできた沈降
線を第３図に示した。抗原として用いられた担子菌菌株
は、先行技術に開示され、入手可能の７種の担子菌菌株
由来の無細胞抽出液の他に、市販品ビラノースオキシダ
ーゼニ種（宝酒造（株）および協和醗酵工業（株））を
加えた次の９種の酵素である。

Ａ　；　Ｎｏ、５２株由来の精製ピラノースオキシダー
ゼ第３図−（１） １　；　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ
　ＩＦＯ６１３９２；　Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｓ
ｅｐｉａｒｉｕｍ　ＮＲＲＬ１２５０６３　・Ａｕｒｉ
ｃｕｌａｒｉａ　ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ　ＩＦＯ３０７
７８第３図−（２） ４；宝酒造（株）市販酵素 ５；協和醗酵工業（株）市販酵素 ６　；　Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　Ｉ
ＦＯ４９３７第３図−（３） ７　；　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ　Ｎ
ＲＲＬ１２５０７８　；　Ｉｒｐｅｘ　１ａｃｔｅｕｓ
　ＩＦＯ５３６７９；　Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ　５
ｔｙｒａｃｉｎａ　ＩＦＯ４９１０第３図から明らかな
ように、本発明のＮｏ、５２株由来の酵素より作成した
抗血清と公知の担子菌由来の無細胞抽出液ならびに市販
品酵素とは沈降線の融合、交差現象はみられなかった。

さらに上記の各酵素濃度を５〜１０倍に上げた酵素溶液
を用いても沈降線はみられなかった。以上の結果および
各種ピラノースオキシダーゼ生産菌、市販酵素の比活性
を第２表に示した。

第２表 各種ピラノースオキシダーゼ生産菌、市販酵素の活性と
ａｎｔｉ　−Ｎｏ、５２株由来のピラノースオキシダー
ゼとの免疫学的反応比活性　Ｎ、Ｄ、、活性認められず 沈降線　＋；影形 成：形成せず 以上のことからも、本発明のＮｏ、　５２株は公知の担
子菌および市販品酵素生産の担子菌とは全く異なる菌株
である。

また後で述べるごとく、本発明の担子菌Ｎｏ、　５２株
が生産するピラノースオキシダーゼは公知の微生物を用
いて生産されたピラノースオキシダーゼとは至適ｐ）（
、耐熱性、阻害剤特異性、分子量、等電点などの点にお
いて異なる特異な性質を持っている。

以上の結果から本発明の担子菌菌株Ｂａｓｉｄｉｏｍ　
ｃｅｔｏｕｓ　ム胆幻、Ｎｏ、　５２株は既知のピラノ
ースオキシダーゼ生産菌のいずれとも明確に区別される
新菌である。

土壌からのピラノースオキシダーゼ生産菌のスクリーニ
ングは１次スクリーニング法として、Ｌ−ソルボースを
炭素源とし、クロラムフェニコールを加えたｐＨ４の寒
天培地に土壌を塗布し２０〜３０℃で培養を行ない過酸
化水素指示薬ＡＢＴＳ−パーオキシダーゼ指示薬により
、過酸化水素の生成が検出された集落の菌株を分離した
。　次にこれを２次スクリーニングするために酵素生産
培地で培養し、培養液を濾過または遠心分離して菌体を
集め、摩砕して粗酵素抽出後、酵素活性の測定および酵
素反応生成物であるＤ−グルコソンの定性分析を行ない
、ピラノースオキシダーゼ生産菌であることを確認した
。

Ｄ−グルコソンの定性分析は粗酵素液を含む下記の反応
組成液 ２％　Ｄ−グルコース　　　　　　１ｌｍ１００Ｉリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　０．４５ｍ１カタラ
ーゼ（１３００Ｕ）　　　　　　０．０５ｍ１粗酵素液
　　　　　　　　　　　　　１ｍｌを３０℃、１２時間
反応させ、薄層クロマトグラフィーにより分析する。展
開溶媒はフェノール：水＝４＝１、発色剤は硫酸または
ジフェニル−アニリン−リン酸−酢酸エチルを用いた。

酵素活性の測定は下記の組成 ＬＭ　　　Ｄ−グルコース　　　　　　０．１ｍ１２４
．６ｍＭ　　４−アミノアンチピリン溶液０．４２Ｍ　
　フェノール溶液　　　　　　０．１ｍｌペルオキシダ
ーゼ溶液（２４０単位／　ｍｌ）０．１ｍＩＯ１ＩＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　　１．５ｍｌ水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．０ｍｌ酵素液　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍ
ｌよりなる全量３．０ｍｌの液を３７℃で反応させ、Ｄ
−グルコース溶液の代わりに水を０９１ｍ１加えた液を
対照液とし、５００ｎｍの吸光度の増加を測定する。こ
の条件下で１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する
酵素量を１単位とする。ピラノースオキシダーゼ活性は 但し　ΔＯＤ、。。；１分間当りの５００ｎｍの吸光度
増加量 ５．３３．上記条件下で生成するキ ノンイミン色素の５００ ｎｍにおけるミリモル分子 ０．１ｍｌ 吸光係数 （ｃｍ３／マイクロモル） として表示される。

本発明によれば上記のＢａｓｉｄｉｏｍ　ｃｅｔｏｕｓ
　０旦〔Ｎｏ、　５２菌株を栄養培地に培養し、該培養
物からピラノースオキシダーゼを採取することができる
が、本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素源、無
機物を含有するカビの培地であれば合成培地、天然培地
のいずれも使用できるが特に液体培地を用いるのが好ま
しい。

炭素源としてはグルコース、ガラクトース、キシロース
、マルトース、Ｌ−ソルボースなどが用いられる。

窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
ペプトン、カザミノ酸、麦芽エキス、酵母エキスなどの
無機または有機窒素が有効である。

無機物としてはカリウム、マグネシウム、鉄（ＩＴ）な
どの塩が好適であり、特にこれらのリン酸塩が好ましい
。

培養は振盪培養または通気撹拌培養が望ましい。

培養温度は２０〜３７℃が好適であり、特に好ましい温
度は２５〜３０℃である。

培地のｐＨは３〜８、特に好ましいｐＨは５〜７である
。

培養期間は２〜１０日であるが、ピラノースオキシダー
ゼが培養物中に最高の活性を示す時期に培養を終了する
。生成した酵素は培養物中の主として菌体中にあるので
、菌体からピラノースオキシダーゼを精製する。精製は
通常下記の如き方法で行なわれる。

充分に活性を示す培養液を濾過して得た菌体を超音波破
砕などのような装置を用いて破砕した後、遠心分離機な
どで上澄液を分離し、通常の酵素精製に用いられる方法
、例えば塩析分別法、有機溶媒沈殿法、限外濾過透析法
、イオン交換樹脂法、ゲル濾過法などの方法で精製する
ことができる。

か（して得られた酵素の性質は次のとおりである。

（１）基質特異性： 本発明酵素の基質として、第２表に示した各種の糖溶液
（３００ｍＭ）Ｏ，１ｍｌを使用し、活性測定法と同組
成の反応液を用いて活性を測定した。活性は相対活性で
示した。

第　　３　　表 本発明のピラノースオキシダーゼはＤ−グルコースに対
する特異性が最も高いが、６−デオキシＤ−グルコース
、δ−Ｄ−グルコノラクトン、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キ
シロースにも作用する。

Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロースに対する基質特異性は
、特開昭５８−４３７８５号公報に開示されたコリオラ
ス属微生物および特開昭６１−２３９８８６号公報に開
示されたポリポラス属微生物など、これまでに知られて
いる微生物から得られたピラノースオキシダーゼに比べ
て２〜３倍高い。

（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性： クエン酸、リン酸カリウム、はう酸の各種緩衝液を用い
、酸素電極法による酸素吸収量により至適ｐＨを測定し
た結果は第４図のとおりであり、本発明の至適ｐＨは５
．５〜８．０であった。

また上記の各種緩衝液を５０℃、３０分保持し、残存活
性を測定した結果は第５図のとおりであり、本発明のピ
ラノースオキシダーゼは５０℃、３０分処理でｐＨ５，
５〜９．０の間で安定である。

本発明のピラノースオキシダーゼは広いｐＨ範囲で最高
活性を示し、またｐＨ安定性も高い。このため公知のピ
ラノースオキシダーゼに比べてグルコースの定量試薬と
しての用途の拡大が期待される。

（３）至適温度および熱安定性： 各温度での活性を測定した結果は第６図のとおりであり
、至適温度が６０℃である。

６０℃、３０分間処理後、残存活性を測定した結果は第
７図のとおりであり、本発明のピラノースオキシダーゼ
は６０℃、３０分間処理後も９０％以上、７０℃、３０
分間処理後においても、５０％以上の残存活性を有する
きわめて耐熱性の高い酵素である。

（４）分子量： セルロファインＧＣＬ−２０００，５ｕｐｅｒｆｉｎｅ
（生化学工業株式会社製）、を用い分子量ゲル濾過法に
より測定した分子量は約３０万である。

（５）等電点： アンフオライン（ｐＨ３，５〜１０．ＬＫＢＢｒｏｍｍ
ａ）を用いた焦点電気泳動法により求めた等電点は６．
２である。

（６）阻害剤特異性： 至適ｐ）１測定と同様に酸素電極法によって測定した。

その結果を第４表に示す。本発明酵素はＡｇ”　、Ｃｕ
＋＋、Ｈｇ＋＋、Ｎｉ＋＋、ＰＣＭＢによって阻害され
る。

第　　４　　表 しかし本発明のピラノースオキシダーゼはＦ　ｅ　”イ
オン添加による相対活性がきわめて特異的である。すな
わち硫酸第１鉄を添加した場合の相対活性は１６０％に
上昇している。特開昭６１−２３９８８６号公報に開示
されたポリポラス属微生物の場合には硫酸第１鉄が阻害
剤として働（のに比べ活性増大の効果を示すことは驚く
べきことである。Ｆｅ〜イオンが阻害剤として働（ピラ
ノースオキシダーゼに対しては酵素活性を維持するため
に、予めＦｅ”イオンの除去操作が必要とする場合もあ
るが、本発明によって得られたピラノースオキシダーゼ
はこのような特異性により、Ｆｅ〜イオンの除去を必要
とせず、むしろＦｅ−の添加によって活性を増大せしめ
ることができ、ピラノースオキシダーゼを合成反応の触
媒として用いる場合にはきわめて有利である。

また比較的高濃度のＮａＣｌ存在下における相対活性も
極めて特異的である。すなわち本発明のＮｏ、　５２株
のＮａＣｌ存在下における相対活性は第８図に示すとお
りであり、２０％もの高濃度ＮａＣｌによっても殆んど
影響を受けない。従来、比較的ＮａＣｌに対する耐性が
強いグルコースオキシダーゼにおいても、４％のＮａＣ
ｌ濃度において５０％の相対活性低下を示すという報告
があるが（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ　３
９．Ｎｏ、９．ｐ１８０３、１９７５）、これに比べて
本発明のピラノースオキシダーゼはＮａＣｌに対する耐
性が極めて強い酵素であり、食品分野での用途には非常
に有利である。

（７）Ｋｍ値： ラインライ−バー・パーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂ
ｕｒｋ）プロットにより本酵素のＤ−グルコースに対す
るＫｍ値を測定したところ３．１ｍＭであった。

本酵素を電気泳動後、ＰＡＳ染色法をおこなったところ
、赤紫に染色されたので、本酵素は糖タンパク質である
ことが判明した。

本発明のピラノースオキシダーゼが公知のピラノースオ
キシダーゼに比べて特異性を有するのは本発明酵素が糖
タンパク質であることにも由来している。

本発明によって得られたピラノースオキシダーゼは上記
の如く公知の方法によって得られたピラノースオキシダ
ーゼに比べて特異な性質を有しており、新規、かつ有用
な酵素である。

ｌ亙五公課 本発明によって見出された担子菌Ｂａｓｉｄｉｏｍ　ｃ
ｅｔｏｕｓ　負立己Ｎｏ、５２株はこれまでに知られて
いるピラノースオキシダーゼ生産菌とは異なる新菌であ
り、その培養物よりピラノースオキシダーゼを効率よ（
採取することができ、また得られたピラノースオキシダ
ーゼは従来公知のものに比べて、広いｐＨ範囲で最高活
性を有するため、定量試薬として広範囲な用途に使用す
ることができ、耐熱性にも優れ、また鉄や食塩による阻
害効果がないのでグルコースの定量の際に特別な前処理
を必要としないなどの優れた性質を有するものである。

以下に本発明を実施例によって説明する。

支施上 Ｌ−ソルボース２％、ポリペプトン１％、ＮａＦｏ、０
０４２％、クロラムフェニコール０．００２％の寒天培
地（ｐＨ４，０）（寒天２％添加）、のシャーレに土壌
を塗布し、２８°Ｃ１３日間静置培養後、生じた集落に
２．７％ＡＢＴＳ　［２，２°−アジノービス（３−エ
チルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸アンモニウム
］溶液２部、１００Ｕ／ｍｌ西洋わさび製パーオキシダ
ーゼ溶液３部を混合した過酸化水素指示薬を噴霧した。

再びシャーレを２８℃、１２時間静置培養後、集落の周
囲が紫色に発色した菌株Ｂａｓｉｄｉｏｍ　ｃｅｔｏｕ
ｓ　加工Ｎｏ、５２　　（微工研国寄第１０１０６）を
寒天培地より分離した。

本菌株を麦芽エキスを２％、ポリペプトン０゜１％およ
び寒天２％（麦芽エキス寒天培地）の斜面培地に接種し
、２８℃４日間静置培養して種菌とした。次にグルコー
ス０．５％、酵母エキス０．４％、麦芽エキス１．０％
、塩化第２鉄０゜００１％よりなる種培地（ｐＨ６，０
）５ｍｌを１５ｍｍφＸ１６５ｍｍの試験管に入れ、１
２０℃、２０分間殺菌した。この培地にＢａ５ｉｄｉ比
ホフ」加用Ｎｏ。５２株を１白金耳摺種し、２８℃、５
日間振盪培養した。得られた種培養液５ｍｌを前記と同
じ組成培地４００ｍ１を入れた容量２１の培養フラスコ
に接種し、２８℃日間ロータリーシェーカーで振盪培養
した。培養物中のピラノースオキシダーゼ活性は培養液
１ｍｌ当たり２８０ｍＵであった。

培養終了後、培養液を吸引濾過し湿菌体１５ｇを得た。

この菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）　３０ｍ　ｌに懸濁したのち、摩砕装置Ｄｙｎｏ−ｍ
１ｌｌで菌体を破砕した。遠心分離して得た上澄み３５
ｍ１に酸を添加してｐＨ７，０に調節した後、あらかじ
め０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したＨＰＡ−７５（三菱化成製）の２０ｍ１カラム
に流した。活性画分はカラムに吸着せず、溶出した。０
．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ７，０）で活性画分をカラム中より押し出した後
、活性画分を集め、限外濾過で濃縮し、脱塩後０．０２
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）と平衡化させ、
０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡
化したＨ　Ｐ　Ａ−−７５の１０ｍ１に流し、同濃度の
リン酸カリウム緩衝液で洗浄し、酵素を０．０５Ｍ硫酸
アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）で溶出させ活性画分を集めた。次にこの活
性画分を１５％飽和硫酸アンモニウム液（ｐＨ７，０）
になるように調整後、０．０５Ｍ硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化させたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ　（ファル
マシア製）の１０ｍ１に流し、同組成の緩衝液で洗浄後
、０．０５Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）から０．０５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７，０）へのグラジェント溶出法を
行なった。

溶出された活性画分を集め、その酵素液を８０％硫酸ア
ンモニウム飽和とし、−昼夜放置後遠心分離によって沈
殿物を得た。沈殿を０．５ｍｌの０．０５Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、セルロファインＧ
ＣＬ−２０００゜５ｕｐｅｒ　　ｆｉｎｅの２５０ｍ１
のカラムに流し、同組成の緩衝液で溶出し、活性画分を
集めた。

活性画分を凍結乾燥し、精製酵素１．２ｍｇを得た。こ
の粉末の比活性は２１．ＯＵ／ｍｇタンパク質であった
。またこの酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動的に単一であり、ＰＡＳ　（過ヨウ素−シッフ
試薬）染色法によっても単一に赤紫色に染色された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の担子菌Ｎｏ、５２株の顕微鏡写真であ
る。 第２図は本発明の担子菌Ｎｏ、　５２株のベノミル添加
および無添加培地での生育状態を示した写真である。 第３図は本発明のＮｏ、５２株由来の酵素より作成した
抗血清と、各種の担子菌由来の酵素および市販品酵素と
の沈降線を示す。 第４図は本発明のピラノースオキシダーゼの作用ｐＨ曲
線を示したものである。 第５図は本発明のピラノースオキシダーゼのｐＨ安定曲
線を示したものである。 第６図は本発明のピラノースオキシダーゼの作用温度曲
線を示したものである。 第７図は本発明のピラノースオキシダーゼの熱安定曲線
を示したものである。 第８図はＮａＣｌ存在下における本発明のピラノースオ
キシダーゼの相対活性を示したものである。 第　１　［さ 第３：ぶ１（１） 第２　訓 第′、３　刃　（２） 第３図（３） 第６図 イ′ト月弓二昌４バｊＥＩｌ秀鈎し 艶安定曲線 」」鷹 （０Ｃ） 作用ｐＨ曲線 第５図 ｐＨ Ｎａｄイレ在千〇木１文ゴ５古性 Ｎａｃｊ濃度（％） 手続補正書　（１発） 昭和６３年１１月弘日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有し、糖タンパク質からなるピ
   ラノースオキシダーゼ。 （１）基質特異性： Ｄ−グルコースに対し最高の特異性を示し、６−デオキ
   シＤ−グルコース、δ−Ｄ−グルコノラクトン、Ｌ−ソ
   ルボース、Ｄ−キシロースにも作用する。 （２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性： ｐＨ５．５〜８．０の範囲で最高活性を有し、５０℃、
   ３０分処理後、ｐＨ５．５〜９．０の間で安定である。 （３）至適温度および熱安定性： 至適温度が６０℃であり５０℃までは失活が認められず
   、６０℃、３０分間処理後９０％以上、７０℃、３０分
   間処理後５０％以上の残存活性を有する。 （４）分子量 ゲル濾過法により測定した分子量が約３０万である。 （５）等電点６．２ （６）阻害剤特異性 Ａｇ＾＋、Ｃｕ＾＋＾＋、Ｈｇ＾＋＾＋、Ｎｉ＾＋＾＋
   、ＰＣＭＢによって阻害される。 Ｆｅ＾＋＾＋によっては阻害されない。 高濃度ＮａＣｌによって阻害されない。 （７）Ｋｍ値：３．１ｍＭ ２、ピラノースオキシダーゼ生産能を有する担子菌に属
   するバシジオマイセタウス、フンギ（￥Ｂａｓｉｄｉｏ
   ｍｙｃｅｔｏｕｓ￥￥ｆｕｎｇｉ￥）Ｎｏ．５２を培養
   し、その培養物よりピラノースオキシダーゼを採取する
   ことを特徴とするピラノースオキシダーゼの製造法。