JPH0870862A - ペルオキシダーゼおよびその生産方法 - Google Patents
ペルオキシダーゼおよびその生産方法Info
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- JPH0870862A JPH0870862A JP21028994A JP21028994A JPH0870862A JP H0870862 A JPH0870862 A JP H0870862A JP 21028994 A JP21028994 A JP 21028994A JP 21028994 A JP21028994 A JP 21028994A JP H0870862 A JPH0870862 A JP H0870862A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アニリン系化合物等の芳香族アミンに対して
高い基質親和性を有するペルオキシダーゼＩおよびＩＩ
およびその安価で大量な生産方法を提供する。 【構成】 ホウロクタケ属に属する新菌株から得られ
る、以下の特性：(1)分子量：約４８,０００；(2)作用
適温の範囲：至適温度は約５５℃；(3)熱安定性：ｐＨ
５.７で３０分間保持した場合、約４５℃まで安定；(4)
至適ｐＨ：約５.７；(5)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時
間処理する場合、ｐＨ４.３〜６.３；(6)等電点：約４.
５；および(7)プロトヘムを有する単量体；を有するペ
ルオキシダーゼＩ、ならびに、以下の特性：(1)作用適
温の範囲：至適温度は約５０℃；(2)熱安定性：ｐＨ５.
７で３０分間保持した場合、約４５℃まで安定；(3)至
適ｐＨ：約５.７；および(4)安定ｐＨ範囲：３０℃で１
６時間処理する場合、ｐＨ５.３〜６.３；を有するペル
オキシダーゼＩＩ。
高い基質親和性を有するペルオキシダーゼＩおよびＩＩ
およびその安価で大量な生産方法を提供する。 【構成】 ホウロクタケ属に属する新菌株から得られ
る、以下の特性：(1)分子量：約４８,０００；(2)作用
適温の範囲：至適温度は約５５℃；(3)熱安定性：ｐＨ
５.７で３０分間保持した場合、約４５℃まで安定；(4)
至適ｐＨ：約５.７；(5)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時
間処理する場合、ｐＨ４.３〜６.３；(6)等電点：約４.
５；および(7)プロトヘムを有する単量体；を有するペ
ルオキシダーゼＩ、ならびに、以下の特性：(1)作用適
温の範囲：至適温度は約５０℃；(2)熱安定性：ｐＨ５.
７で３０分間保持した場合、約４５℃まで安定；(3)至
適ｐＨ：約５.７；および(4)安定ｐＨ範囲：３０℃で１
６時間処理する場合、ｐＨ５.３〜６.３；を有するペル
オキシダーゼＩＩ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、芳香族アミン及びフェ
ノール化合物に対して広い基質特異性を有し、特にアニ
リン系化合物に対して基質親和性の高いペルオキシダー
ゼおよびこのようなペルオキシダーゼを担子菌培養物か
ら生産する方法に関する。
ノール化合物に対して広い基質特異性を有し、特にアニ
リン系化合物に対して基質親和性の高いペルオキシダー
ゼおよびこのようなペルオキシダーゼを担子菌培養物か
ら生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼは、過酸化酵素ともよ
ばれ、過酸化水素の存在下、種々の化合物を酸化する酵
素であり、動物・植物・微生物界に広く分布することが
知られている。ペルオキシダーゼは、既に臨床検査試
薬、酵素標識免疫測定などに実用化されており、更に、
工場廃液中の有毒成分の無毒化および除去、パルプ廃液
の脱色、洗濯物の色移り防止、フェノール樹脂の合成、
食品の劣化防止などの幅広い用途が期待されている。特
に、工場廃液、例えば、化学工業および染色工業などの
廃液、ならびに農薬関連物質に含まれ、一般に有毒であ
ることが知られている芳香族アミンの無毒化および除去
処理には、芳香族アミンに対して基質親和性の高いペル
オキシダーゼが必要である（上島、バイオサイエンスと
インダストリー、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ．１２、（１９９
３））。さらに、上記処理を屋外で夏期に実施する場合
には、高温となるため、耐熱性に優れるペルオキシダー
ゼが望まれる。
ばれ、過酸化水素の存在下、種々の化合物を酸化する酵
素であり、動物・植物・微生物界に広く分布することが
知られている。ペルオキシダーゼは、既に臨床検査試
薬、酵素標識免疫測定などに実用化されており、更に、
工場廃液中の有毒成分の無毒化および除去、パルプ廃液
の脱色、洗濯物の色移り防止、フェノール樹脂の合成、
食品の劣化防止などの幅広い用途が期待されている。特
に、工場廃液、例えば、化学工業および染色工業などの
廃液、ならびに農薬関連物質に含まれ、一般に有毒であ
ることが知られている芳香族アミンの無毒化および除去
処理には、芳香族アミンに対して基質親和性の高いペル
オキシダーゼが必要である（上島、バイオサイエンスと
インダストリー、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ．１２、（１９９
３））。さらに、上記処理を屋外で夏期に実施する場合
には、高温となるため、耐熱性に優れるペルオキシダー
ゼが望まれる。
【０００３】従来から西洋ワサビペルオキシダーゼが、
臨床診断などの用途に用いられてきた。しかし、上記酵
素は、植物由来であるため大量生産に適さず、また、多
くのアイソザイムを含むため、収穫時期によりそれらの
組成比が変動するという欠点を有する。
臨床診断などの用途に用いられてきた。しかし、上記酵
素は、植物由来であるため大量生産に適さず、また、多
くのアイソザイムを含むため、収穫時期によりそれらの
組成比が変動するという欠点を有する。
【０００４】近年、微生物由来のペルオキダーゼが、種
々の菌類において探索されてきた。例えば、担子菌のコ
プリヌス・シネリウス（特開平３−１９４９号公報）、
糸状菌のアルスロマイセス・ラモスス（Ａｇｒｉｃ. Ｂ
ｉｏｌ. Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．５０、２４７、（１９８
６））、不完全菌類のフザリウム・オキシスポルム、フ
ミコラ・インソレンスなどの菌類に由来するペルオキシ
ダーゼが知られている。
々の菌類において探索されてきた。例えば、担子菌のコ
プリヌス・シネリウス（特開平３−１９４９号公報）、
糸状菌のアルスロマイセス・ラモスス（Ａｇｒｉｃ. Ｂ
ｉｏｌ. Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．５０、２４７、（１９８
６））、不完全菌類のフザリウム・オキシスポルム、フ
ミコラ・インソレンスなどの菌類に由来するペルオキシ
ダーゼが知られている。
【０００５】しかし、いずれのペルオキシダーゼも芳香
族アミンに対する基質親和性が低いこと、熱的に不安定
であることなどから、工場廃液からの有害物質除去に関
して、実用化がなされていないのが現状である。
族アミンに対する基質親和性が低いこと、熱的に不安定
であることなどから、工場廃液からの有害物質除去に関
して、実用化がなされていないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
芳香族アミンに対する基質親和性に優れ、芳香族アミン
及びフェノール化合物に対して広い基質特異性を有する
ペルオキシダーゼ、ならびに耐熱性に優れたペルオキシ
ダーゼ、その生産方法および生産菌を提供することであ
る。これまで芳香族アミンに対する高い特異性を有し、
かつ耐熱性に優れるペルオキシダーゼを生産する菌類は
知られていない。
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
芳香族アミンに対する基質親和性に優れ、芳香族アミン
及びフェノール化合物に対して広い基質特異性を有する
ペルオキシダーゼ、ならびに耐熱性に優れたペルオキシ
ダーゼ、その生産方法および生産菌を提供することであ
る。これまで芳香族アミンに対する高い特異性を有し、
かつ耐熱性に優れるペルオキシダーゼを生産する菌類は
知られていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ホウロク
タケ（Trametes）属に属する、新たに単離した担子菌か
ら、新規なペルオキシダーゼ数種を見いだし、本発明を
完成するに至った。
タケ（Trametes）属に属する、新たに単離した担子菌か
ら、新規なペルオキシダーゼ数種を見いだし、本発明を
完成するに至った。
【０００８】本発明のペルオキシダーゼＩは、次の特性
を有する。 (1)分子量：約４８,０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る）； (2)作用適温の範囲：至適温度は約５５℃である； (3)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (4)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７； (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ４.３〜６.３； (6)等電点：約４.５；および (7)プロトヘムを有する単量体である。 このことによって、上記目的が達成される。
を有する。 (1)分子量：約４８,０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る）； (2)作用適温の範囲：至適温度は約５５℃である； (3)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (4)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７； (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ４.３〜６.３； (6)等電点：約４.５；および (7)プロトヘムを有する単量体である。 このことによって、上記目的が達成される。
【０００９】本発明のペルオキシダーゼＩＩは、次の特
性を有する。 (1)作用適温の範囲：至適温度は約５０℃である； (2)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (3)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７；および (4)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ５.３〜６.３；を有する。 このことによって、上記目的が達成される。
性を有する。 (1)作用適温の範囲：至適温度は約５０℃である； (2)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (3)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７；および (4)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ５.３〜６.３；を有する。 このことによって、上記目的が達成される。
【００１０】本発明のペルオキシダーゼＩおよびＩＩ
は、ホウロクタケ属の担子菌、特に平成６年８月１２日
に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称す
る）に寄託したTrametes sp. Ha1株（生命研菌寄第１４
４７２号；FERM P-１４４７２）により生産される。こ
のことによって上記目的が達成される。
は、ホウロクタケ属の担子菌、特に平成６年８月１２日
に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称す
る）に寄託したTrametes sp. Ha1株（生命研菌寄第１４
４７２号；FERM P-１４４７２）により生産される。こ
のことによって上記目的が達成される。
【００１１】上記ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、実
施例２に詳述するように、同一菌から単離される。
施例２に詳述するように、同一菌から単離される。
【００１２】上記担子菌より生産される本発明のペルオ
キシダーゼＩおよびＩＩの種々の特性を、それぞれ表１
および表２に示す。
キシダーゼＩおよびＩＩの種々の特性を、それぞれ表１
および表２に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】上記特性を有する、ホウロクタケ属担子菌
由来のペルオキシダーゼは、これまで知られていない。
由来のペルオキシダーゼは、これまで知られていない。
【００１６】本発明のペルオキシダーゼＩおよびＩＩの
生産方法は、上記生産菌を培養し、培養物より該ペルオ
キシダーゼＩおよびＩＩを分離精製する工程を包含す
る。このことによって上記目的が達成される。
生産方法は、上記生産菌を培養し、培養物より該ペルオ
キシダーゼＩおよびＩＩを分離精製する工程を包含す
る。このことによって上記目的が達成される。
【００１７】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】本発明のペルオキシダーゼＩおよびＩＩ
は、ホウロクタケ属の担子菌、特にTrametes sp. Ha1株
（生命研菌寄第１４４７２号；FERM P-１４４７２）に
より生産される。この菌株は、発明者らが土壌、海水お
よび淡水、ならびに腐朽物からペルオキシダーゼを生産
する菌類を広くスクリーニングした結果、新たに竹の枯
葉から単離された新菌株である。
は、ホウロクタケ属の担子菌、特にTrametes sp. Ha1株
（生命研菌寄第１４４７２号；FERM P-１４４７２）に
より生産される。この菌株は、発明者らが土壌、海水お
よび淡水、ならびに腐朽物からペルオキシダーゼを生産
する菌類を広くスクリーニングした結果、新たに竹の枯
葉から単離された新菌株である。
【００１９】（１）形態および培養 本発明のペルオキシダーゼＩおよびＩＩ生産菌（以下、
本菌という）は、リグニン分解能を有する白色腐朽菌で
あること、培養菌糸に骨格菌糸およびかすがい連結（cl
amp connection）を有するがシスチジアおよび剛毛状菌
糸などの異形細胞は存在しないこと、ならびに培養菌糸
に分生胞子が形成されないこと、等の菌学的性質を有す
ることにより、ホウロクタケ（Trametes）属に属する担
子菌と同定され、Trametes sp. Ha1と命名した。本菌
は、フェノールオキシダーゼ（ラッカーゼ）を産生する
ことが認められた。
本菌という）は、リグニン分解能を有する白色腐朽菌で
あること、培養菌糸に骨格菌糸およびかすがい連結（cl
amp connection）を有するがシスチジアおよび剛毛状菌
糸などの異形細胞は存在しないこと、ならびに培養菌糸
に分生胞子が形成されないこと、等の菌学的性質を有す
ることにより、ホウロクタケ（Trametes）属に属する担
子菌と同定され、Trametes sp. Ha1と命名した。本菌
は、フェノールオキシダーゼ（ラッカーゼ）を産生する
ことが認められた。
【００２０】本菌のさらに詳細な菌学的性質は、以下の
通りである。
通りである。
【００２１】（ポテト・グルコース寒天培地）培養開始
後７日目において、コロニーの表面および裏面は共に白
色であり、直径５〜１０ｍｍに成長し、気中菌糸は短く
密で綿毛状である。菌糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、
少数の骨格菌糸が認められ、かすがい連結を有する。菌
糸の表面は、平坦であり、幅は２〜６μｍである。シス
チジアおよび剛毛状菌糸は認められない。分生胞子の形
成は認められない。
後７日目において、コロニーの表面および裏面は共に白
色であり、直径５〜１０ｍｍに成長し、気中菌糸は短く
密で綿毛状である。菌糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、
少数の骨格菌糸が認められ、かすがい連結を有する。菌
糸の表面は、平坦であり、幅は２〜６μｍである。シス
チジアおよび剛毛状菌糸は認められない。分生胞子の形
成は認められない。
【００２２】（サブロー寒天培地）培養開始後７日目に
おいて、コロニーの表面は白色、裏面は薄茶色であり、
直径３〜７ｍｍに成長し、気中菌糸は短く疎である。菌
糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、少数の骨格菌糸が認め
られ、かすがい連結を有する。菌糸の表面は、平坦であ
り、幅１〜４μｍである。分生胞子の形成は認められな
い。
おいて、コロニーの表面は白色、裏面は薄茶色であり、
直径３〜７ｍｍに成長し、気中菌糸は短く疎である。菌
糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、少数の骨格菌糸が認め
られ、かすがい連結を有する。菌糸の表面は、平坦であ
り、幅１〜４μｍである。分生胞子の形成は認められな
い。
【００２３】（フェノールオキシダーゼ反応）０.５％
の没食子酸または０.５％のタンニン酸を含むサブロー
寒天培地に本菌を接種し、３０℃で培養条件下、菌体の
周囲が褐変する反応陽性が認められる。従って、本菌は
リグニン分解性木材腐朽菌（白色腐朽菌）の一種であ
る。
の没食子酸または０.５％のタンニン酸を含むサブロー
寒天培地に本菌を接種し、３０℃で培養条件下、菌体の
周囲が褐変する反応陽性が認められる。従って、本菌は
リグニン分解性木材腐朽菌（白色腐朽菌）の一種であ
る。
【００２４】本菌の生育範囲は、ポテトグルコース寒天
培地（ポテトエキス末４.０g、ブドウ糖２０g、寒天２
０gを、１リットルの蒸留水に溶解する。）において、
約４〜４０℃、ｐＨは約２〜１２であり、生育好適温度
は２５〜３５℃、生育好適ｐＨは４.０〜８.０である。
特に好ましい生育条件は、３０℃でｐＨが約５.５であ
る。
培地（ポテトエキス末４.０g、ブドウ糖２０g、寒天２
０gを、１リットルの蒸留水に溶解する。）において、
約４〜４０℃、ｐＨは約２〜１２であり、生育好適温度
は２５〜３５℃、生育好適ｐＨは４.０〜８.０である。
特に好ましい生育条件は、３０℃でｐＨが約５.５であ
る。
【００２５】次に、本菌から本発明のペルオキシダーゼ
ＩおよびＩＩを生産するための条件について説明する。
ＩおよびＩＩを生産するための条件について説明する。
【００２６】本菌は、液体培養または固体培養のいずれ
でも培養し得る。本菌を生育させる培地としては、特に
限定されず、通常の液体培地または固体培地が用いられ
る。炭素源としては、本菌が同化し得るものならいずれ
も使用し得、例えばグルコース、ショ糖、糖蜜等の糖
類、澱粉、木粉などが用いられ得る。窒素源としては、
ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆分
解物、尿素などの有機窒素源の他、硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム等の無機窒素源も使用し得る。必要に応
じてリン酸塩、硫酸マグネシウム、カリウム、カルシウ
ム、銅、ナトリウム、マンガン、亜鉛等の無機塩類、ビ
タミン類等が添加され得る。これら培地成分は、本菌の
生育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は０.１〜
２０重量％、好ましくは５〜１０重量％、窒素源は０.
０１〜５重量％、好ましくは０.１〜２重量％である。
でも培養し得る。本菌を生育させる培地としては、特に
限定されず、通常の液体培地または固体培地が用いられ
る。炭素源としては、本菌が同化し得るものならいずれ
も使用し得、例えばグルコース、ショ糖、糖蜜等の糖
類、澱粉、木粉などが用いられ得る。窒素源としては、
ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆分
解物、尿素などの有機窒素源の他、硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム等の無機窒素源も使用し得る。必要に応
じてリン酸塩、硫酸マグネシウム、カリウム、カルシウ
ム、銅、ナトリウム、マンガン、亜鉛等の無機塩類、ビ
タミン類等が添加され得る。これら培地成分は、本菌の
生育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は０.１〜
２０重量％、好ましくは５〜１０重量％、窒素源は０.
０１〜５重量％、好ましくは０.１〜２重量％である。
【００２７】培地のｐＨを、２.０〜１２.０、好ましく
は４.０〜８.０に調製し、滅菌して使用する。培養温度
は、担子菌類が生育し得る温度であればよく、実用上、
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。本菌を
液体培養する場合は、通気培養または振盪培養が好まし
い。培養時間は、培養条件によって異なるが、通気また
は振盪培養の場合は、通常２〜１０日間が好ましい。
は４.０〜８.０に調製し、滅菌して使用する。培養温度
は、担子菌類が生育し得る温度であればよく、実用上、
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。本菌を
液体培養する場合は、通気培養または振盪培養が好まし
い。培養時間は、培養条件によって異なるが、通気また
は振盪培養の場合は、通常２〜１０日間が好ましい。
【００２８】（２）培養液からのペルオキシダーゼＩお
よびＩＩの分離精製 本菌の培養液から本発明のペルオキシダーゼＩおよびＩ
Ｉ（以下、本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩという）を
分離精製するには、既知の精製法、例えば透析、塩析、
各種カラムクロマトグラフィー、等電点沈澱、ゲル濾過
が単独もしくは併用して利用され得る。
よびＩＩの分離精製 本菌の培養液から本発明のペルオキシダーゼＩおよびＩ
Ｉ（以下、本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩという）を
分離精製するには、既知の精製法、例えば透析、塩析、
各種カラムクロマトグラフィー、等電点沈澱、ゲル濾過
が単独もしくは併用して利用され得る。
【００２９】本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、菌体
外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。従って、培
養後、菌体等の不溶物を遠心分離、濾紙または濾布など
による濾過等により除去し、本ペルオキシダーゼＩおよ
びＩＩを含有する粗酵素液を回収する。得られた粗酵素
液を、濃縮、硫安分画（塩析）、透析、各種クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過などの一般的に用いられる酵素の精
製方法により、本ペルオキシダーゼＩが精製され得る。
例えば、上記得られた粗酵素液を硫安分画後、透析、各
種クロマトグラフィー、限外濾過に順次供試することに
より、精製された高活性の本ペルオキシダーゼＩおよび
／またはＩＩを含有する画分が得られる。
外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。従って、培
養後、菌体等の不溶物を遠心分離、濾紙または濾布など
による濾過等により除去し、本ペルオキシダーゼＩおよ
びＩＩを含有する粗酵素液を回収する。得られた粗酵素
液を、濃縮、硫安分画（塩析）、透析、各種クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過などの一般的に用いられる酵素の精
製方法により、本ペルオキシダーゼＩが精製され得る。
例えば、上記得られた粗酵素液を硫安分画後、透析、各
種クロマトグラフィー、限外濾過に順次供試することに
より、精製された高活性の本ペルオキシダーゼＩおよび
／またはＩＩを含有する画分が得られる。
【００３０】（３）本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ活
性の測定 本発明において本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ活性
は、過酸化水素の存在下、本ペルオキシダーゼＩおよび
ＩＩが触媒する、4-アミノアンチピリンと、水素供与体
との酸化縮合による発色反応で測定する。水素供与体と
しては、例えば、フェノール、N,N-ジエチルアニリン
（DEA）、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピ
ル）-3-メチルアニリン（TOOS）、N,N-ジメチルアニリ
ン（DMA）があげられる。酸化縮合による発色反応系に
おいて、用いた基質に応じて、５０５ｎｍ（フェノー
ル）または５５５ｎｍ（DEA、TOOS、DMA）における吸光
度を測定する。本願においては、別に記載がない限り、
４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５.７）に、０.５マイク
ロモルの4-アミノアンチピリンおよび３マイクロモルの
N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メ
チルアニリンを含んだ溶液５００μｌへ、１マイクロモ
ルの過酸化水素を添加し、３０℃で１分間プレインキュ
ベートし、次いで、酵素液２０μｌを加え、反応液の最
終液量を６００μｌとする。これを、５５５ｎｍの波長
で吸光度を測定し、酵素液２０μｌの代わりに蒸留水２
０μｌを加え、同様に測定したブランク値を差し引いた
後、１分間に吸光度を０.０１増加させる酵素活性を１
単位（Ｕ；ユニット）とする。
性の測定 本発明において本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ活性
は、過酸化水素の存在下、本ペルオキシダーゼＩおよび
ＩＩが触媒する、4-アミノアンチピリンと、水素供与体
との酸化縮合による発色反応で測定する。水素供与体と
しては、例えば、フェノール、N,N-ジエチルアニリン
（DEA）、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピ
ル）-3-メチルアニリン（TOOS）、N,N-ジメチルアニリ
ン（DMA）があげられる。酸化縮合による発色反応系に
おいて、用いた基質に応じて、５０５ｎｍ（フェノー
ル）または５５５ｎｍ（DEA、TOOS、DMA）における吸光
度を測定する。本願においては、別に記載がない限り、
４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５.７）に、０.５マイク
ロモルの4-アミノアンチピリンおよび３マイクロモルの
N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メ
チルアニリンを含んだ溶液５００μｌへ、１マイクロモ
ルの過酸化水素を添加し、３０℃で１分間プレインキュ
ベートし、次いで、酵素液２０μｌを加え、反応液の最
終液量を６００μｌとする。これを、５５５ｎｍの波長
で吸光度を測定し、酵素液２０μｌの代わりに蒸留水２
０μｌを加え、同様に測定したブランク値を差し引いた
後、１分間に吸光度を０.０１増加させる酵素活性を１
単位（Ｕ；ユニット）とする。
【００３１】以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
【００３２】
【実施例】実施例１ （Trametes sp. Ha1の培養）１０ｍｌの培地（５％グル
コース、０.５％ペプトン、０.１％酵母エキス、０.２
％KH2PO4、０.１％K2HPO4、０.０２％MgSO4・7H2O、ｐＨ
６.０）を含む６０ｍｌ容試験管にTrametes sp. Ha1の
一白金耳を接種し、２８℃で４日間、振盪培養した。次
いでこの培養液２０ｍｌを、２.５ｌの上記培地を含む
５ｌ容ミニジャーファーメンターに植菌し、２８℃で７
日間、通気撹拌培養した。
コース、０.５％ペプトン、０.１％酵母エキス、０.２
％KH2PO4、０.１％K2HPO4、０.０２％MgSO4・7H2O、ｐＨ
６.０）を含む６０ｍｌ容試験管にTrametes sp. Ha1の
一白金耳を接種し、２８℃で４日間、振盪培養した。次
いでこの培養液２０ｍｌを、２.５ｌの上記培地を含む
５ｌ容ミニジャーファーメンターに植菌し、２８℃で７
日間、通気撹拌培養した。
【００３３】実施例２ （本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの精製）上記実施例
１で得られた培養液を濾紙で濾過して除菌し、回収した
濾液を粗酵素液とした。
１で得られた培養液を濾紙で濾過して除菌し、回収した
濾液を粗酵素液とした。
【００３４】この粗酵素液を限外濾過により濃縮後、
０.５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７.５）で透析し、同緩衝液で平衡化したコン
カナバリンＡセファロースカラム（4.4×5.1cm、Pharma
cia社製）に供試した。同緩衝液で非吸着物質を洗浄溶
出後、０.２Ｍメチル-α-D-グルコピラノシドを含む同
緩衝液（ｐＨ７.５）により、本ペルオキシダーゼＩお
よびＩＩを溶出した。溶出液を１０ｍＭ塩化ナトリウム
を含有する２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５.５）で
透析し、透析内液を得た。
０.５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７.５）で透析し、同緩衝液で平衡化したコン
カナバリンＡセファロースカラム（4.4×5.1cm、Pharma
cia社製）に供試した。同緩衝液で非吸着物質を洗浄溶
出後、０.２Ｍメチル-α-D-グルコピラノシドを含む同
緩衝液（ｐＨ７.５）により、本ペルオキシダーゼＩお
よびＩＩを溶出した。溶出液を１０ｍＭ塩化ナトリウム
を含有する２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５.５）で
透析し、透析内液を得た。
【００３５】上記透析内液を、上記緩衝液で平衡化した
モノＱカラム（0.5×5.0cm、Pharmacia社製）に供試し
た。非吸着物質を上記カラムより同緩衝液で洗浄、溶出
させた後、同緩衝液に塩化ナトリウムを加え、塩化ナト
リウムの１０ｍＭから３００ｍＭへの濃度勾配をかけ
て、上記カラムに吸着された本ペルオキシダーゼＩおよ
びＩＩを溶出し、分画回収した。本ペルオキシダーゼＩ
およびＩＩは、それぞれ約４０ｍＭおよび約１５０ｍＭ
で、溶出した。
モノＱカラム（0.5×5.0cm、Pharmacia社製）に供試し
た。非吸着物質を上記カラムより同緩衝液で洗浄、溶出
させた後、同緩衝液に塩化ナトリウムを加え、塩化ナト
リウムの１０ｍＭから３００ｍＭへの濃度勾配をかけ
て、上記カラムに吸着された本ペルオキシダーゼＩおよ
びＩＩを溶出し、分画回収した。本ペルオキシダーゼＩ
およびＩＩは、それぞれ約４０ｍＭおよび約１５０ｍＭ
で、溶出した。
【００３６】各ペルオキシダーゼ溶出液を１０ｍＭ塩化
ナトリウムを含む４０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ４.
８）で透析後、同緩衝液で平衡化したモノＰカラム（0.
5×20.0cm、Pharmacia社製）に供試し、非吸着物質を同
緩衝液で洗浄溶出した。次いで、５％ポリバッファー７
４（ｐＨ２.８、Pharmacia社製）で、本ペルオキシダー
ゼを溶出し、分画回収した。
ナトリウムを含む４０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ４.
８）で透析後、同緩衝液で平衡化したモノＰカラム（0.
5×20.0cm、Pharmacia社製）に供試し、非吸着物質を同
緩衝液で洗浄溶出した。次いで、５％ポリバッファー７
４（ｐＨ２.８、Pharmacia社製）で、本ペルオキシダー
ゼを溶出し、分画回収した。
【００３７】各ペルオキシダーゼの回収画分の一部を、
ポリアクリルアミド電気泳動に供試し均一なことを確認
した。本ペルオキシダーゼＩは、さらにＳＤＳを含むポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供試して、単量体であ
ることを確認した。
ポリアクリルアミド電気泳動に供試し均一なことを確認
した。本ペルオキシダーゼＩは、さらにＳＤＳを含むポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供試して、単量体であ
ることを確認した。
【００３８】アルカリ-ピリジン-ヘモクロム法（生化学
辞典第２版、１２１４頁；東京化学同人刊）により、本
ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、プロトヘムを有する
ことが明らかになった。
辞典第２版、１２１４頁；東京化学同人刊）により、本
ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、プロトヘムを有する
ことが明らかになった。
【００３９】実施例３ （本ペルオキシダーゼＩの分子量）ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）法（Laemmli,U.K.、Na
ture、227、680(1970)）で本ペルオキシダーゼＩの分子
量を測定した。
アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）法（Laemmli,U.K.、Na
ture、227、680(1970)）で本ペルオキシダーゼＩの分子
量を測定した。
【００４０】上記実施例２で得られた精製ペルオキシダ
ーゼＩおよび分子量マーカーとして既知の６種のタンパ
ク質（分子量約97,400、66,300、42,400、30,000、20,1
00および14,400）を同時に泳動した。泳動終了後、クー
マシーブリリアントブルーで染色し、本ペルオキシダー
ゼＩと各分子量マーカーとの相対泳動距離より、本ペル
オキシダーゼＩの分子量を測定した。
ーゼＩおよび分子量マーカーとして既知の６種のタンパ
ク質（分子量約97,400、66,300、42,400、30,000、20,1
00および14,400）を同時に泳動した。泳動終了後、クー
マシーブリリアントブルーで染色し、本ペルオキシダー
ゼＩと各分子量マーカーとの相対泳動距離より、本ペル
オキシダーゼＩの分子量を測定した。
【００４１】本SDS-PAGEにより、本ペルオキシダーゼＩ
は、単一バンドを示した。本ペルオキシダーゼＩのSDS-
PAGEにおける分子量は、約４８,０００である。
は、単一バンドを示した。本ペルオキシダーゼＩのSDS-
PAGEにおける分子量は、約４８,０００である。
【００４２】実施例４ （本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの作用適温範囲およ
び熱安定性） （１）作用適温の範囲 上記実施例２で得られた精製された本ペルオキシダーゼ
ＩおよびＩＩの活性を、上記発色反応系において種々の
温度条件（20、30、40、45、50、55、60、70℃）下で測
定した。結果をそれぞれ図１および図２に示す。それぞ
れの図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は最大活
性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本ペル
オキシダーゼＩおよびＩＩの至適温度は、それぞれ約５
５℃および約５０℃である。
び熱安定性） （１）作用適温の範囲 上記実施例２で得られた精製された本ペルオキシダーゼ
ＩおよびＩＩの活性を、上記発色反応系において種々の
温度条件（20、30、40、45、50、55、60、70℃）下で測
定した。結果をそれぞれ図１および図２に示す。それぞ
れの図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は最大活
性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本ペル
オキシダーゼＩおよびＩＩの至適温度は、それぞれ約５
５℃および約５０℃である。
【００４３】（２）熱安定性 上記実施例２で得られた精製された本ペルオキシダーゼ
ＩおよびＩＩを種々の温度条件（0、30、40、45、50、5
5、60、70、80、95℃）下、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５.７）１９０μｌ中に、酵素液１０μｌを加えて、
３０分間インキュベートした後、直ちに氷冷して１０分
後に活性を測定した。結果をそれぞれ図３および図４に
示す。それぞれの図中の横軸は処理温度（℃）を表し、
縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対残存活性
（％）を表す。
ＩおよびＩＩを種々の温度条件（0、30、40、45、50、5
5、60、70、80、95℃）下、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５.７）１９０μｌ中に、酵素液１０μｌを加えて、
３０分間インキュベートした後、直ちに氷冷して１０分
後に活性を測定した。結果をそれぞれ図３および図４に
示す。それぞれの図中の横軸は処理温度（℃）を表し、
縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対残存活性
（％）を表す。
【００４４】本ペルオキシダーゼＩは、約４５℃まで安
定であり、温度処理条件が５０℃においても、酵素活性
が６０％以上保持される。本ペルオキシダーゼＩＩは、
約４５℃まで安定であり、温度処理条件が５０℃におい
ても、酵素活性が６０％以上保持される。
定であり、温度処理条件が５０℃においても、酵素活性
が６０％以上保持される。本ペルオキシダーゼＩＩは、
約４５℃まで安定であり、温度処理条件が５０℃におい
ても、酵素活性が６０％以上保持される。
【００４５】実施例５ （本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの至適ｐＨおよび安
定ｐＨ範囲） （１）至適ｐＨ ｐＨ領域に応じて、１／３０Ｍ酢酸緩衝液、１／３０Ｍ
リン酸緩衝液、または１／３０Ｍトリス-塩酸緩衝液を
用いてｐＨを１.７〜７.９（1.7、3.5、4.3、5.7、6.
1、6.5、7.3、7.9）に調整した各緩衝液をつくり、上記
実施例２で得られた精製された本ペルオキシダーゼＩお
よびＩＩの活性を測定した。
定ｐＨ範囲） （１）至適ｐＨ ｐＨ領域に応じて、１／３０Ｍ酢酸緩衝液、１／３０Ｍ
リン酸緩衝液、または１／３０Ｍトリス-塩酸緩衝液を
用いてｐＨを１.７〜７.９（1.7、3.5、4.3、5.7、6.
1、6.5、7.3、7.9）に調整した各緩衝液をつくり、上記
実施例２で得られた精製された本ペルオキシダーゼＩお
よびＩＩの活性を測定した。
【００４６】結果を図５および図６に示す。それぞれの
図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は最大活性値を１０
０とした場合の相対活性（％）を表す。本ペルオキシダ
ーゼＩおよびＩＩの至適ｐＨは、いずれも約５.７であ
る。
図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は最大活性値を１０
０とした場合の相対活性（％）を表す。本ペルオキシダ
ーゼＩおよびＩＩの至適ｐＨは、いずれも約５.７であ
る。
【００４７】（２）安定pH範囲 ｐＨ領域に応じて、１００ｍＭ酢酸ナトリウム-塩酸緩
衝液、１００ｍＭ酢酸緩衝液、１００ｍＭリン酸緩衝
液、１００ｍＭトリス-塩酸緩衝液および１００ｍＭグ
リシン-水酸化ナトリウム緩衝液を用いてｐＨを１.０〜
９.４（1.0、2.5、3.4、4.3、5.3、6.3、7.4、7.9、9.
0、9.4）に調整した各緩衝液をつくり、上記実施例２で
得られた精製された本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ
を、３０℃で１６時間、上記ｐＨを有する各緩衝液中で
インキュベートした。次いで、各pH処理液を、０.０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）で１０倍に希釈した後、
ペルオキシダーゼ活性を測定した。それぞれの結果を図
７および図８に示す。各図中の横軸は処理pHを表し、縦
軸は、最大活性値を100とした場合の相対残存活性
（％）を表す。本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの安定
pH範囲は、それぞれ４.３〜６.３および５.３〜６.３で
ある。
衝液、１００ｍＭ酢酸緩衝液、１００ｍＭリン酸緩衝
液、１００ｍＭトリス-塩酸緩衝液および１００ｍＭグ
リシン-水酸化ナトリウム緩衝液を用いてｐＨを１.０〜
９.４（1.0、2.5、3.4、4.3、5.3、6.3、7.4、7.9、9.
0、9.4）に調整した各緩衝液をつくり、上記実施例２で
得られた精製された本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ
を、３０℃で１６時間、上記ｐＨを有する各緩衝液中で
インキュベートした。次いで、各pH処理液を、０.０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）で１０倍に希釈した後、
ペルオキシダーゼ活性を測定した。それぞれの結果を図
７および図８に示す。各図中の横軸は処理pHを表し、縦
軸は、最大活性値を100とした場合の相対残存活性
（％）を表す。本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの安定
pH範囲は、それぞれ４.３〜６.３および５.３〜６.３で
ある。
【００４８】実施例６ （本ペルオキシダーゼＩの等電点）クロマトフォーカシ
ング法により本ペルオキシダーゼＩの等電点を測定し
た。測定の結果、本ペルオキシダーゼＩの等電点は、約
４.５であった。
ング法により本ペルオキシダーゼＩの等電点を測定し
た。測定の結果、本ペルオキシダーゼＩの等電点は、約
４.５であった。
【００４９】実施例７ （本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの基質特異性）フェ
ノール、カテコール、ｏ−クロロフェノール、ｍ−クロ
ロフェノール、ｐ−クロロフェノール、2,4-ジクロロフ
ェノール、2,5-ジクロロフェノール、4-クロロ-2-メチ
ルフェノール、2,6-キシレノール、アニリン、N-エチル
-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニ
リン（ＴＯＯＳ）、N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジメチ
ル-O-メチルアニリン、およびｐ−メチルアニリンを基
質として供試し、上記と同様の方法で、上記実施例２で
精製された本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの基質特異
性を調べた。比較のために、西洋ワサビペルオキシダー
ゼおよびアルスロマイセス由来のペルオキシダーゼにつ
いても同様に調べた。フェノールを基質とした場合の測
定値を１００として各基質についての相対値（％）を表
３に示す。
ノール、カテコール、ｏ−クロロフェノール、ｍ−クロ
ロフェノール、ｐ−クロロフェノール、2,4-ジクロロフ
ェノール、2,5-ジクロロフェノール、4-クロロ-2-メチ
ルフェノール、2,6-キシレノール、アニリン、N-エチル
-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニ
リン（ＴＯＯＳ）、N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジメチ
ル-O-メチルアニリン、およびｐ−メチルアニリンを基
質として供試し、上記と同様の方法で、上記実施例２で
精製された本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの基質特異
性を調べた。比較のために、西洋ワサビペルオキシダー
ゼおよびアルスロマイセス由来のペルオキシダーゼにつ
いても同様に調べた。フェノールを基質とした場合の測
定値を１００として各基質についての相対値（％）を表
３に示す。
【００５０】反応条件は、４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５.７）５００μｌ中に、０.５マイクロモルの4-アミ
ノアンチピリン、１.０マイクロモルの過酸化水素を含
む溶液へ、３マイクロモルの上記基質を加え、３０℃で
１分間プレインキュベートした後、２０μｌの本ペルオ
キシダーゼＩまたはＩＩ液を添加し、反応液の最終液量
を６００μｌとした。この反応液の５０５ｎｍにおける
吸光度の変化を測定した。
Ｈ５.７）５００μｌ中に、０.５マイクロモルの4-アミ
ノアンチピリン、１.０マイクロモルの過酸化水素を含
む溶液へ、３マイクロモルの上記基質を加え、３０℃で
１分間プレインキュベートした後、２０μｌの本ペルオ
キシダーゼＩまたはＩＩ液を添加し、反応液の最終液量
を６００μｌとした。この反応液の５０５ｎｍにおける
吸光度の変化を測定した。
【００５１】
【表３】
【００５２】本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、芳香
族アミン類に対して高い基質親和性を示す。
族アミン類に対して高い基質親和性を示す。
【００５３】実施例８ （培養条件の検討）綿栓をした６０ｍｌ容試験管と５０
０ｍｌ容フラスコとを用い、培地液量を少しずつ変え
て、酸素供給量の変化によるペルオキシダーゼＩおよび
ＩＩの生産性の変動を調べた。培地液量は、６０ｍｌ容
試験管では、５、１０および１５ｍｌ、５００ｍｌ容フ
ラスコでは、２５、５０、７５および１００ｍｌとし
た。
０ｍｌ容フラスコとを用い、培地液量を少しずつ変え
て、酸素供給量の変化によるペルオキシダーゼＩおよび
ＩＩの生産性の変動を調べた。培地液量は、６０ｍｌ容
試験管では、５、１０および１５ｍｌ、５００ｍｌ容フ
ラスコでは、２５、５０、７５および１００ｍｌとし
た。
【００５４】ペルオキシダーゼＩおよびＩＩの生産量
は、１９０ｍＭのトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.６）５２
０μｌ中に、７.５マイクロモルのフェノール、１.２５
マイクロモルの4-アミノアンチピリンおよび５.０マイ
クロモルの過酸化水素を含んだ溶液を、３０℃で１分間
プレインキュベートし、２０μｌのペルオキシダーゼＩ
およびＩＩを含む粗酵素液を添加後、５０５ｎｍにおけ
る吸光度の変化を測定して行った。
は、１９０ｍＭのトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.６）５２
０μｌ中に、７.５マイクロモルのフェノール、１.２５
マイクロモルの4-アミノアンチピリンおよび５.０マイ
クロモルの過酸化水素を含んだ溶液を、３０℃で１分間
プレインキュベートし、２０μｌのペルオキシダーゼＩ
およびＩＩを含む粗酵素液を添加後、５０５ｎｍにおけ
る吸光度の変化を測定して行った。
【００５５】ラッカーゼの生産量は、１９０ｍＭの酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.５）５２０μｌ中に、７.５
マイクロモルのフェノールおよび１.２５マイクロモル
の4-アミノアンチピリンを含んだ溶液を、３０℃で１分
間プレインキュベートし、２０μｌのラッカーゼを含む
粗酵素液を添加後、５０５ｎｍにおける吸光度の変化を
測定して行った。
ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.５）５２０μｌ中に、７.５
マイクロモルのフェノールおよび１.２５マイクロモル
の4-アミノアンチピリンを含んだ溶液を、３０℃で１分
間プレインキュベートし、２０μｌのラッカーゼを含む
粗酵素液を添加後、５０５ｎｍにおける吸光度の変化を
測定して行った。
【００５６】それぞれの結果を、図９および図１０中に
縦線のバーで示す。なお、斜線のバーは同一の培地での
ラッカーゼの生産量を示す。
縦線のバーで示す。なお、斜線のバーは同一の培地での
ラッカーゼの生産量を示す。
【００５７】いずれの容器を用いた場合も、培地液量を
増加させることで、酸素供給量を減少させるとペルオキ
シダーゼＩおよびＩＩの生産量が低下した。２リットル
容のフラスコを用いた実験でも、同様の結果が得られ
た。
増加させることで、酸素供給量を減少させるとペルオキ
シダーゼＩおよびＩＩの生産量が低下した。２リットル
容のフラスコを用いた実験でも、同様の結果が得られ
た。
【００５８】これらの培養結果から、Ha1菌のペルオキ
シダーゼの生産は、菌体への酸素供給量により変動する
ことが示唆された。特に、ペルオキシダーゼの生産は、
ラッカーゼの生産よりも酸素供給量に影響されやすい。
シダーゼの生産は、菌体への酸素供給量により変動する
ことが示唆された。特に、ペルオキシダーゼの生産は、
ラッカーゼの生産よりも酸素供給量に影響されやすい。
【００５９】
【発明の効果】本発明によれば、広い基質特異性を有す
る新規ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ、およびその生産
方法が提供される。本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは
従来のペルオキシダーゼに比べ、芳香族アミンに対して
高い基質親和性を示し、耐熱性に優れるため、芳香族ア
ミンを含む工場廃液の処理、農薬関連物質の無毒化等に
有用である。本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、担子
菌の培養によって生産されるため、安価に大量に本ペル
オキシダーゼＩおよびＩＩを提供することができ、試薬
または工業用途にも広く利用され得る。
る新規ペルオキシダーゼＩおよびＩＩ、およびその生産
方法が提供される。本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは
従来のペルオキシダーゼに比べ、芳香族アミンに対して
高い基質親和性を示し、耐熱性に優れるため、芳香族ア
ミンを含む工場廃液の処理、農薬関連物質の無毒化等に
有用である。本ペルオキシダーゼＩおよびＩＩは、担子
菌の培養によって生産されるため、安価に大量に本ペル
オキシダーゼＩおよびＩＩを提供することができ、試薬
または工業用途にも広く利用され得る。
【図１】20〜70℃の範囲で本ペルオキシダーゼＩの活性
を測定した場合の相対活性を示す。
を測定した場合の相対活性を示す。
【図２】20〜70℃の範囲で本ペルオキシダーゼＩＩの活
性を測定した場合の相対活性を示す。
性を測定した場合の相対活性を示す。
【図３】本ペルオキシダーゼＩを０〜95℃の条件下、30
分インキュベーション後に測定した相対残存活性を示
す。
分インキュベーション後に測定した相対残存活性を示
す。
【図４】本ペルオキシダーゼＩＩを０〜95℃の条件下、
30分インキュベーション後に測定した相対残存活性を示
す。
30分インキュベーション後に測定した相対残存活性を示
す。
【図５】pH1.7〜7.9の範囲で本ペルオキシダーゼＩの活
性を測定した場合の相対活性を示す。
性を測定した場合の相対活性を示す。
【図６】pH1.7〜7.9の範囲で本ペルオキシダーゼＩＩの
活性を測定した場合の相対活性を示す。
活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図７】本ペルオキシダーゼＩをpH1.0〜9.4の条件下、
30℃で１６時間インキュベーション後に測定した相対残
存活性を示す。
30℃で１６時間インキュベーション後に測定した相対残
存活性を示す。
【図８】本ペルオキシダーゼＩＩをpH1.0〜9.4の条件
下、30℃で１６時間インキュベーション後に測定した相
対残存活性を示す。
下、30℃で１６時間インキュベーション後に測定した相
対残存活性を示す。
【図９】60ｍｌ容試験管による本菌培養時の本ペルオキ
シダーゼＩおよびＩＩ生産量に対する酸素供給効果を示
す。
シダーゼＩおよびＩＩ生産量に対する酸素供給効果を示
す。
【図１０】500ｍｌ容フラスコによる本菌培養時の本ペ
ルオキシダーゼＩおよびＩＩ生産量に対する酸素供給効
果を示す。
ルオキシダーゼＩおよびＩＩ生産量に対する酸素供給効
果を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 以下の特性： (1)分子量：約４８,０００； (2)作用適温の範囲：至適温度は約５５℃である； (3)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (4)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７； (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ４.３〜６.３； (6)等電点：約４.５；および (7)プロトヘムを有する単量体である；を有する、ペル
オキシダーゼＩ。 - 【請求項２】 ホウロクタケ（Trametes）属に属する担
子菌、Trametes sp.Ha1株（生命研菌寄第１４４７２
号）が生産する、請求項１に記載のペルオキシダーゼ
Ｉ。 - 【請求項３】 以下の特性： (1)分子量：約４８,０００； (2)作用適温の範囲：至適温度は約５５℃である； (3)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (4)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７； (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ４.３〜６.３； (6)等電点：約４.５；および (7)プロトヘムを有する単量体である；を有するペルオ
キシダーゼＩを生産する方法であって、該ペルオキシダ
ーゼＩを生産するホウロクタケ属に属する担子菌を培養
する工程、および培養物より該ペルオキシダーゼＩを分
離精製する工程を包含する、方法。 - 【請求項４】 以下の特性： (1)作用適温の範囲：至適温度は約５０℃である； (2)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (3)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７；および (4)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ５.３〜６.３；を、有するペルオキシダーゼ
ＩＩ。 - 【請求項５】 ホウロクタケ（Trametes）属に属する担
子菌、Trametes sp.Ha1株（生命研菌寄第１４４７２
号）が生産する、請求項４に記載のペルオキシダーゼＩ
Ｉ。 - 【請求項６】 以下の特性： (1)作用適温の範囲：至適温度は約５０℃である； (2)熱安定性：ｐＨ５.７で３０分間保持した場合に、約
４５℃まで安定である； (3)至適ｐＨ：N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプ
ロピル）-3-メチルアニリンを基質に用いた場合に、約
５.７；および (4)安定ｐＨ範囲：３０℃で１６時間処理する場合にお
いて、ｐＨ５.３〜６.３；を、有するペルオキシダーゼ
ＩＩを生産する方法であって、該ペルオキシダーゼＩＩ
を生産するホウロクタケ属に属する担子菌を培養する工
程、および培養物より該ペルオキシダーゼＩＩを分離精
製する工程を包含する、方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21028994A JPH0870862A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | ペルオキシダーゼおよびその生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21028994A JPH0870862A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | ペルオキシダーゼおよびその生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870862A true JPH0870862A (ja) | 1996-03-19 |
Family
ID=16586938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21028994A Pending JPH0870862A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | ペルオキシダーゼおよびその生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0870862A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006124386A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-05-18 | Geol Kagaku Kk | 美白剤および抗酸化剤ならびに活性酸素除去剤 |
| JP2011507867A (ja) * | 2007-12-19 | 2011-03-10 | イーエルシー マネージメント エルエルシー | トラメテス属の抽出物を用いた皮膚処置用組成物および方法 |
-
1994
- 1994-09-02 JP JP21028994A patent/JPH0870862A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006124386A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-05-18 | Geol Kagaku Kk | 美白剤および抗酸化剤ならびに活性酸素除去剤 |
| JP2011507867A (ja) * | 2007-12-19 | 2011-03-10 | イーエルシー マネージメント エルエルシー | トラメテス属の抽出物を用いた皮膚処置用組成物および方法 |
| US8956624B2 (en) | 2007-12-19 | 2015-02-17 | Elc Management, Llc | Compositions and methods for treating skin with extract from Trametes |
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