JP3161213B2 - マンガンパーオキシダーゼｃｈ−１及びその製造方法 - Google Patents
マンガンパーオキシダーゼｃｈ−１及びその製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なリグニン分解酵
素であるマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１およびその
製造方法に関するものである。本発明の酵素はリグニン
に作用して、これを低分子化または分解する性質を有す
るため、木材等のリグノセルロース材料を原料とする紙
パルプ製造工程における種々の工程で利用できるもので
ある。即ちパルプ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工
程など、リグニンを低分子化または分解する工程に利用
できるものである。さらに木材の糖化において、糖化の
前段の処理としてリグニンを分解することによって、セ
ルラーゼ作用を高めるといういわゆるセルロース系バイ
オマス利用の分野にも適用できるものである。
素であるマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１およびその
製造方法に関するものである。本発明の酵素はリグニン
に作用して、これを低分子化または分解する性質を有す
るため、木材等のリグノセルロース材料を原料とする紙
パルプ製造工程における種々の工程で利用できるもので
ある。即ちパルプ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工
程など、リグニンを低分子化または分解する工程に利用
できるものである。さらに木材の糖化において、糖化の
前段の処理としてリグニンを分解することによって、セ
ルラーゼ作用を高めるといういわゆるセルロース系バイ
オマス利用の分野にも適用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から木材パルプの製造は、木材を化
学的に処理して製造する方法が広く行われているが、環
境問題等の面から、木材等のリグノセルロース物質に白
色腐朽菌を接種、培養することによってリグニンを分解
し、セルロースパルプを製造する試みがなされている
（特開昭５０−４６９０３号）。しかしながら、この方
法で用いる白色腐朽菌は共存する炭水化物をも分解して
しまい、またセルラーゼ欠損変異株を用いた場合には、
本来のリグニン分解力が弱まってしまうこと等の問題点
があり、実用化されるに至っていない。
学的に処理して製造する方法が広く行われているが、環
境問題等の面から、木材等のリグノセルロース物質に白
色腐朽菌を接種、培養することによってリグニンを分解
し、セルロースパルプを製造する試みがなされている
（特開昭５０−４６９０３号）。しかしながら、この方
法で用いる白色腐朽菌は共存する炭水化物をも分解して
しまい、またセルラーゼ欠損変異株を用いた場合には、
本来のリグニン分解力が弱まってしまうこと等の問題点
があり、実用化されるに至っていない。
【０００３】このような問題点を解決するために、白色
腐朽菌のリグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作
用させ、リグニンのみを選択的に分解させようとする試
みがなされている（Science, 221巻, 661-662 (198
3)）。この報告は、主としてリグニンモデル化合物を基
質としたものであるが、世界で最初にリグニン分解酵素
を単離、精製したものである。この酵素はファネロケー
テ・クリソスポリウムが生産する菌体外酵素であり、主
な特徴は至適ｐＨが３．０であること、鉄含有酵素であ
ること、分子量が41,000〜42,000であること、酵素作用
に過酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合物
の４位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった化
合物に対して作用することが確認されていること等であ
る。この酵素はリグニンパーオキシダーゼであり複数の
アイソザイムの存在が知られている（FEBS Lett., 169
巻, 247-250(1984)）。リグニンパーオキシダーゼはそ
の他カワラタケ、ヤケイロタケ等多くの木材腐朽菌から
見い出され、一部のものは精製されている。
腐朽菌のリグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作
用させ、リグニンのみを選択的に分解させようとする試
みがなされている（Science, 221巻, 661-662 (198
3)）。この報告は、主としてリグニンモデル化合物を基
質としたものであるが、世界で最初にリグニン分解酵素
を単離、精製したものである。この酵素はファネロケー
テ・クリソスポリウムが生産する菌体外酵素であり、主
な特徴は至適ｐＨが３．０であること、鉄含有酵素であ
ること、分子量が41,000〜42,000であること、酵素作用
に過酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合物
の４位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった化
合物に対して作用することが確認されていること等であ
る。この酵素はリグニンパーオキシダーゼであり複数の
アイソザイムの存在が知られている（FEBS Lett., 169
巻, 247-250(1984)）。リグニンパーオキシダーゼはそ
の他カワラタケ、ヤケイロタケ等多くの木材腐朽菌から
見い出され、一部のものは精製されている。
【０００４】一方、アラゲカワラタケ、カイガラタケが
生産するリグニン分解酵素が知られているが（特開昭６
２−２２０１９０号、６２−２２０１８９号）、これら
はフェノールオキシダーゼであり、主な特徴は至適ｐＨ
が４．５であること、銅含有酵素であること、分子量が
約63,000または、約65,000であること、等電点が３．５
付近であること、酵素作用に酸素が必要であること、リ
グニンモデル化合物の４位のフェノール性水酸基がメト
キシル基になった化合物に対しては作用せずフェノール
性のリグニンモデルに対して作用すること等である。
生産するリグニン分解酵素が知られているが（特開昭６
２−２２０１９０号、６２−２２０１８９号）、これら
はフェノールオキシダーゼであり、主な特徴は至適ｐＨ
が４．５であること、銅含有酵素であること、分子量が
約63,000または、約65,000であること、等電点が３．５
付近であること、酵素作用に酸素が必要であること、リ
グニンモデル化合物の４位のフェノール性水酸基がメト
キシル基になった化合物に対しては作用せずフェノール
性のリグニンモデルに対して作用すること等である。
【０００５】また、マンガンパーオキシダーゼも代表的
なリグニン分解酵素の一つであり、分子量が46,000以下
であること、鉄含有酵素であると推定されていること、
酵素作用に過酸化水素が必要であること、酵素反応がＭ
ｎ（II）依存性であること、リグニンモデル化合物の４
位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった化合物
に対しては作用せず、フェノール性のリグニンモデルに
対して作用することが確認されていること等が主な特徴
であり、リグニンパーオキシダーゼとは全く性質の異な
る酵素である。
なリグニン分解酵素の一つであり、分子量が46,000以下
であること、鉄含有酵素であると推定されていること、
酵素作用に過酸化水素が必要であること、酵素反応がＭ
ｎ（II）依存性であること、リグニンモデル化合物の４
位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった化合物
に対しては作用せず、フェノール性のリグニンモデルに
対して作用することが確認されていること等が主な特徴
であり、リグニンパーオキシダーゼとは全く性質の異な
る酵素である。
【０００６】マンガンパーオキシダーゼは二価のマンガ
ンを三価に酸化する活性を有し、また、この反応を介し
てグアヤコールやリグニンのモデル化合物を酸化分解す
る活性を持っている（J. Biol. Chem., 264巻, No.6, 3
335-3340(1989)）。白色腐朽菌のリグニン分解酵素を木
材に作用させる場合、マンガンパーオキシダーゼによっ
て酸化された三価のマンガンは、いずれの酵素よりも分
子量が小さいために木材組織に侵入しやすく、木材組織
中を自由に移動しリグニンと反応できるためリグニン分
解に重要な働きをする酵素と考えられている。
ンを三価に酸化する活性を有し、また、この反応を介し
てグアヤコールやリグニンのモデル化合物を酸化分解す
る活性を持っている（J. Biol. Chem., 264巻, No.6, 3
335-3340(1989)）。白色腐朽菌のリグニン分解酵素を木
材に作用させる場合、マンガンパーオキシダーゼによっ
て酸化された三価のマンガンは、いずれの酵素よりも分
子量が小さいために木材組織に侵入しやすく、木材組織
中を自由に移動しリグニンと反応できるためリグニン分
解に重要な働きをする酵素と考えられている。
【０００７】マンガンパーオキシダーゼの生産方法とし
ては、Ｋｉｒｋ、Ｄｏｄｓｏｎ、Ｂｏｎｎａｒｍｅらの
方法が報告されているが、アラゲカワラタケＩＦＯ４９
１７株をマンガンパーオキシダーゼ生産のための一般的
な培養方法であるＫｉｒｋらの培養方法（Arch.Microbi
ol.,117巻,227-285 (1978)）に従って培養した場合、マ
ンガンパーオキシダーゼは全く生産されなかった。ま
た、Ｄｏｄｓｏｎらの方法（FEMS Microbiology Letter
s, 42巻, 17-22(1987)）に従って培養した場合、該酵素
活性は最高で１６日目で０．６単位と大変少なく、さら
にＢｏｎｎａｒｍｅらの方法（Appl. Environ. Microbi
ol.,５６巻,No. 1, 210-217(1990)）に従って培養した
場合、酵素活性は最高で培養４日目で１．６単位であ
り、いずれの方法もマンガンパーオキシダーゼを精製す
るために充分な量の酵素を確保することが困難である。
ては、Ｋｉｒｋ、Ｄｏｄｓｏｎ、Ｂｏｎｎａｒｍｅらの
方法が報告されているが、アラゲカワラタケＩＦＯ４９
１７株をマンガンパーオキシダーゼ生産のための一般的
な培養方法であるＫｉｒｋらの培養方法（Arch.Microbi
ol.,117巻,227-285 (1978)）に従って培養した場合、マ
ンガンパーオキシダーゼは全く生産されなかった。ま
た、Ｄｏｄｓｏｎらの方法（FEMS Microbiology Letter
s, 42巻, 17-22(1987)）に従って培養した場合、該酵素
活性は最高で１６日目で０．６単位と大変少なく、さら
にＢｏｎｎａｒｍｅらの方法（Appl. Environ. Microbi
ol.,５６巻,No. 1, 210-217(1990)）に従って培養した
場合、酵素活性は最高で培養４日目で１．６単位であ
り、いずれの方法もマンガンパーオキシダーゼを精製す
るために充分な量の酵素を確保することが困難である。
【０００８】また従来、マンガンパーオキシダーゼは菌
体の増殖を盛んに行わせる培地では生産量が少なく、窒
素源が少ない培地で、気相の酸素濃度が高い条件でしか
酵素を大量に生産させることができなかった（Arch.Mic
robiol.,117巻,227-285 (1978)）。しかしながら、この
ような条件で培養を行った場合菌体の増殖が遅いため、
酵素を大量に生産させるためにはあらかじめ増殖を盛ん
に行わせる培地で増やした大量の菌体を植え継ぐという
操作が必要であった。
体の増殖を盛んに行わせる培地では生産量が少なく、窒
素源が少ない培地で、気相の酸素濃度が高い条件でしか
酵素を大量に生産させることができなかった（Arch.Mic
robiol.,117巻,227-285 (1978)）。しかしながら、この
ような条件で培養を行った場合菌体の増殖が遅いため、
酵素を大量に生産させるためにはあらかじめ増殖を盛ん
に行わせる培地で増やした大量の菌体を植え継ぐという
操作が必要であった。
【０００９】マンガンパーオキシダーゼは、Ｌｅｉｓｏ
ｌａらによってファネロケーテ・クリソスポリウムの培
養液から、分子量約46,000、等電点４．２〜４．９であ
る６つのアイソザイムとして分離されている（Arch. Bi
ochem. Biophys., 242巻, 329-341 (1985)）。ファネロ
ケーテ・クリソスポリウム以外の微生物の培養物からの
マンガンパーオキシダーゼの精製は、ヒラタケ由来の等
電点３．５、３．８、４．２、４．３である４つのマン
ガンパーオキシダーゼアイソザイム（特開平３−１２３
２９５、Plenum Publishing Corporation, 863-868(199
3)）、カワラタケ由来の等電点2.93、2.96、3.06、3.0
9、3.17の５つのマンガンパーオキシダーゼアイソザイ
ム（Acta Chemica Scandinavica, B41巻, 762-765 (198
7)、Arch.Biochem. Biophys., 300巻, No.1, 57-62 (19
93)）、コガネシワウロコタケ由来の分子量49,000、等
電点３．８であるマンガンパーオキシダーゼ（Arch. Bi
ochem. Biophys., 279巻,25-31(1990)）、シイタケ由来
の分子量44,600、等電点３．２のマンガンパーオキシダ
ーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 33巻, 359-365
(1990)）、ケガワタケ由来の分子量43,000、等電点２．
９５と３．２の２つのマンガンパーオキシダーゼアイソ
ザイム（Biotec. Appl. Biochem., 13, 291-302 (199
1)）がある。これらのマンガンパーオキシダーゼは、至
適ｐＨが３．０〜５．０である。
ｌａらによってファネロケーテ・クリソスポリウムの培
養液から、分子量約46,000、等電点４．２〜４．９であ
る６つのアイソザイムとして分離されている（Arch. Bi
ochem. Biophys., 242巻, 329-341 (1985)）。ファネロ
ケーテ・クリソスポリウム以外の微生物の培養物からの
マンガンパーオキシダーゼの精製は、ヒラタケ由来の等
電点３．５、３．８、４．２、４．３である４つのマン
ガンパーオキシダーゼアイソザイム（特開平３−１２３
２９５、Plenum Publishing Corporation, 863-868(199
3)）、カワラタケ由来の等電点2.93、2.96、3.06、3.0
9、3.17の５つのマンガンパーオキシダーゼアイソザイ
ム（Acta Chemica Scandinavica, B41巻, 762-765 (198
7)、Arch.Biochem. Biophys., 300巻, No.1, 57-62 (19
93)）、コガネシワウロコタケ由来の分子量49,000、等
電点３．８であるマンガンパーオキシダーゼ（Arch. Bi
ochem. Biophys., 279巻,25-31(1990)）、シイタケ由来
の分子量44,600、等電点３．２のマンガンパーオキシダ
ーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 33巻, 359-365
(1990)）、ケガワタケ由来の分子量43,000、等電点２．
９５と３．２の２つのマンガンパーオキシダーゼアイソ
ザイム（Biotec. Appl. Biochem., 13, 291-302 (199
1)）がある。これらのマンガンパーオキシダーゼは、至
適ｐＨが３．０〜５．０である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、白色腐朽菌
をリグノセルロース物質に作用させた場合に、目的とす
るリグニンの分解の他に、共存する炭水化物の分解を起
こすという問題点を解決することを意図するものであ
り、主としてリグノセルロース物質中のリグニンを低分
子化または分解することに対して有効であり、より中性
に近い条件で作用できるマンガンパーオキシダーゼおよ
びその製造方法を提供することにある。
をリグノセルロース物質に作用させた場合に、目的とす
るリグニンの分解の他に、共存する炭水化物の分解を起
こすという問題点を解決することを意図するものであ
り、主としてリグノセルロース物質中のリグニンを低分
子化または分解することに対して有効であり、より中性
に近い条件で作用できるマンガンパーオキシダーゼおよ
びその製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、リグニン
分解菌であるアラゲカワラタケについて鋭意研究を行っ
た結果、マンガンパーオキシダーゼを大量に生産するア
ラゲカワラタケの変異株を作製し、該変異株を増殖せし
め、その培養物から得た菌体外酵素をイオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー
により高度に精製し、従来知られたマンガンパーオキシ
ダーゼより至適ｐＨが高い新規な酵素標品を得て、本発
明に到達した。
分解菌であるアラゲカワラタケについて鋭意研究を行っ
た結果、マンガンパーオキシダーゼを大量に生産するア
ラゲカワラタケの変異株を作製し、該変異株を増殖せし
め、その培養物から得た菌体外酵素をイオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー
により高度に精製し、従来知られたマンガンパーオキシ
ダーゼより至適ｐＨが高い新規な酵素標品を得て、本発
明に到達した。
【００１２】本発明の酵素は、下記の性質を有する新規
なマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１である。 （１） 作用 過酸化水素存在下で二価のマンガンイオンを三価に酸化
する。 （２） 基質特異性 二価のマンガンを酸化する。 （３） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性 至適ｐＨはｐＨ５．５であり、ｐＨ４．０〜６．０の範
囲で安定である。 （４） 至適温度および熱安定性 至適温度は４５℃であり、５０℃までの熱に安定であ
る。 （５） 等電点は４．０付近である。 （６） 分子量は約４９，０００である。 （７） Ｈｇ2+、Ａｌ3+により弱く阻害を受け、 Ｆｅ
2+、Ｃｕ2+、シアン化カリウム、ＮａＮ3 、メルカプト
エタノール、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡで強く阻害
される。
なマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１である。 （１） 作用 過酸化水素存在下で二価のマンガンイオンを三価に酸化
する。 （２） 基質特異性 二価のマンガンを酸化する。 （３） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性 至適ｐＨはｐＨ５．５であり、ｐＨ４．０〜６．０の範
囲で安定である。 （４） 至適温度および熱安定性 至適温度は４５℃であり、５０℃までの熱に安定であ
る。 （５） 等電点は４．０付近である。 （６） 分子量は約４９，０００である。 （７） Ｈｇ2+、Ａｌ3+により弱く阻害を受け、 Ｆｅ
2+、Ｃｕ2+、シアン化カリウム、ＮａＮ3 、メルカプト
エタノール、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡで強く阻害
される。
【００１３】また、本発明のマンガンパーオキシダーゼ
ＣＨ−１の製造方法は、上記のマンガンパーオキシダー
ゼＣＨ−１の生産能を有するアラゲカワラタケの変異株
であるＮＴＧ III−５５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０４
６）を培地に培養し、その培養物からマンガンパーオキ
シダーゼＣＨ−１を採取することを特徴とするものであ
る。
ＣＨ−１の製造方法は、上記のマンガンパーオキシダー
ゼＣＨ−１の生産能を有するアラゲカワラタケの変異株
であるＮＴＧ III−５５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０４
６）を培地に培養し、その培養物からマンガンパーオキ
シダーゼＣＨ−１を採取することを特徴とするものであ
る。
【００１４】本発明の酵素はグアヤコール等のフェノー
ル性水酸基をもつ化合物に対しては作用するが、ベラト
リルアルコール等の４位のフェノール性水酸基がメトキ
シル基になった化合物に対しては作用しない。本発明の
酵素はヘム酵素に特有の４０７ｎｍ付近の吸収を持ち鉄
含有酵素であると推定される。
ル性水酸基をもつ化合物に対しては作用するが、ベラト
リルアルコール等の４位のフェノール性水酸基がメトキ
シル基になった化合物に対しては作用しない。本発明の
酵素はヘム酵素に特有の４０７ｎｍ付近の吸収を持ち鉄
含有酵素であると推定される。
【００１５】本発明の酵素はカワラタケ属に属するマン
ガンパーオキシダーゼＣＨ−１生産菌を培地に培養し、
その培養物中からマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１を
取り出すことにより製造される。本発明において、酵素
を生産するための培養は以下のようにして行なうことが
できる。
ガンパーオキシダーゼＣＨ−１生産菌を培地に培養し、
その培養物中からマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１を
取り出すことにより製造される。本発明において、酵素
を生産するための培養は以下のようにして行なうことが
できる。
【００１６】本発明に用いる微生物としては、マンガン
パーオキシダーゼＣＨ−１を生産する能力を有する微生
物であればいずれも用いることができるが、アラゲカワ
ラタケ(Coliorus hirstus)が適しており、アラゲカワラ
タケＩＦＯ４９１７株に由来する変異株であるＮＴＧ I
II−５５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０４６）が特に適して
いる。
パーオキシダーゼＣＨ−１を生産する能力を有する微生
物であればいずれも用いることができるが、アラゲカワ
ラタケ(Coliorus hirstus)が適しており、アラゲカワラ
タケＩＦＯ４９１７株に由来する変異株であるＮＴＧ I
II−５５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０４６）が特に適して
いる。
【００１７】用いる培地としては、マンガンパーオキシ
ダーゼＣＨ−１生産菌が増殖可能な培地であれば特に限
定されるものではない。従来、マンガンパーオキシダー
ゼは、菌体を大量増殖する培地で培養した場合にはその
生産量が少ないため、窒素源が少ない培地で、気相の酸
素濃度が高い条件で、大量の菌体を用いて培養する以外
に酵素を大量生産することができなかった。そのため、
あらかじめ菌体を大量増殖し、これを植え継ぐという操
作が必要であった。しかしながら、本発明の変異株を用
いる場合には、菌体を大量増殖する培地で菌体を増殖さ
せながら同時に酵素を生産することができるため、菌体
の植え継ぎ操作は不要である。
ダーゼＣＨ−１生産菌が増殖可能な培地であれば特に限
定されるものではない。従来、マンガンパーオキシダー
ゼは、菌体を大量増殖する培地で培養した場合にはその
生産量が少ないため、窒素源が少ない培地で、気相の酸
素濃度が高い条件で、大量の菌体を用いて培養する以外
に酵素を大量生産することができなかった。そのため、
あらかじめ菌体を大量増殖し、これを植え継ぐという操
作が必要であった。しかしながら、本発明の変異株を用
いる場合には、菌体を大量増殖する培地で菌体を増殖さ
せながら同時に酵素を生産することができるため、菌体
の植え継ぎ操作は不要である。
【００１８】培地の栄養源としては、微生物の培養に通
常用いられているものを広く用いることができる。炭素
源としては同化可能なものであれば良く、例えばグルコ
ース、マルトース、パルプ、木粉等が使用される。窒素
源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えば
ペプトン、ソイトン、酒石酸アンモニウム、ダイズレク
チン等が用いられる。その他りん酸塩、硫酸塩、マグネ
シウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、マン
ガン、亜鉛、等の塩類が必要に応じて使用される。培養
温度は生産菌が増殖可能な範囲で適宜変更し得るが、２
０℃〜４０℃が好ましい。また、必要に応じてベラトリ
ルアルコールのようなリグニンモデル化合物を添加する
こともできる。
常用いられているものを広く用いることができる。炭素
源としては同化可能なものであれば良く、例えばグルコ
ース、マルトース、パルプ、木粉等が使用される。窒素
源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えば
ペプトン、ソイトン、酒石酸アンモニウム、ダイズレク
チン等が用いられる。その他りん酸塩、硫酸塩、マグネ
シウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、マン
ガン、亜鉛、等の塩類が必要に応じて使用される。培養
温度は生産菌が増殖可能な範囲で適宜変更し得るが、２
０℃〜４０℃が好ましい。また、必要に応じてベラトリ
ルアルコールのようなリグニンモデル化合物を添加する
こともできる。
【００１９】本発明の酵素は培養液中に分泌生産される
ので、培養後の培養物から本酵素を採取するには、液体
培養においては菌体を濾過、遠心分離などの方法で除去
した培養上清から、また固体培養においては培養物から
抽出した抽出液を用いて、通常の酵素の単離方法によっ
て行なうことができる。酵素の精製は、例えば陰イオン
交換体によるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、高
速液体クロマトグラフィー等で行なうことができるが、
これらの方法を繰り返すことも可能であり、さらに必要
に応じて他の精製手段を組み合わせて用いることもでき
る。
ので、培養後の培養物から本酵素を採取するには、液体
培養においては菌体を濾過、遠心分離などの方法で除去
した培養上清から、また固体培養においては培養物から
抽出した抽出液を用いて、通常の酵素の単離方法によっ
て行なうことができる。酵素の精製は、例えば陰イオン
交換体によるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、高
速液体クロマトグラフィー等で行なうことができるが、
これらの方法を繰り返すことも可能であり、さらに必要
に応じて他の精製手段を組み合わせて用いることもでき
る。
【００２０】なお本発明のマンガンパーオキシダーゼＣ
Ｈ−１は、従来より知られているファネロケーテ・クリ
ソスポリウム、ヒラタケ、カワラタケ、コガネシワウロ
コタケ、シイタケ、ケガワタケのマンガンパーオキシダ
ーゼとは以下の点で異なっており、新規な酵素である。
Ｈ−１は、従来より知られているファネロケーテ・クリ
ソスポリウム、ヒラタケ、カワラタケ、コガネシワウロ
コタケ、シイタケ、ケガワタケのマンガンパーオキシダ
ーゼとは以下の点で異なっており、新規な酵素である。
【００２１】１）至適ｐＨは５．５であり、従来より知
られているマンガンパーオキシダーゼのいずれよりも高
い。 ２）等電点は４．０であり、ファネロケーテ・クリソス
ポリウムの４．２、４．３、４．５５、４．９、ヒラタ
ケの３．５、３．８、４．２、４．３、カワラタケの
２．９３、２．９６、３．０６、３．０９、３．１７、
コガネシワウロコタケの３．８、シイタケの３．２、お
よびケガワタケの２．９５、３．２のいずれとも異なっ
ている。 ３）分子量は49,000であり、ファネロケーテ・クリソス
ポリウムの46,000、ヒラタケの42,000〜45,000、カワラ
タケの44,000〜45,000、シイタケの44,600、およびケガ
ワタケの43,000とは全く異なるものである。また、コガ
ネシワウロコタケのマンガンパーオキシダーゼの分子量
は49,000であり本発明の酵素と同じであるが、至適ｐＨ
が異なるものである。
られているマンガンパーオキシダーゼのいずれよりも高
い。 ２）等電点は４．０であり、ファネロケーテ・クリソス
ポリウムの４．２、４．３、４．５５、４．９、ヒラタ
ケの３．５、３．８、４．２、４．３、カワラタケの
２．９３、２．９６、３．０６、３．０９、３．１７、
コガネシワウロコタケの３．８、シイタケの３．２、お
よびケガワタケの２．９５、３．２のいずれとも異なっ
ている。 ３）分子量は49,000であり、ファネロケーテ・クリソス
ポリウムの46,000、ヒラタケの42,000〜45,000、カワラ
タケの44,000〜45,000、シイタケの44,600、およびケガ
ワタケの43,000とは全く異なるものである。また、コガ
ネシワウロコタケのマンガンパーオキシダーゼの分子量
は49,000であり本発明の酵素と同じであるが、至適ｐＨ
が異なるものである。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。実施例１ アラゲカワラタケＩＦＯ４９１７株由来の一核菌糸が形
成した分裂子を、８０μｇ／ｍｌ濃度のニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）を含むりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）中に２８℃で１時間放置することにより突然変
異処理を行った。生き残った分裂子をスクリーニングプ
レート（ＡｚｕｒｅＢを９６０ｍＭ、グルコースを１．
５％、yeast nitrogen base w/o amino acidを０．６７
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．０５％、ＫＨ2ＰＯ4を
０．１％、およびａｇａｒを１．５％含み、培地ｐＨ
５．０）に生育させ、マンガンパーオキシダーゼＣＨ−
１を生産し、ＡｚｕｒｅＢを脱色する株であるＮＴＧ I
II−５５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０４６）を選抜した。
次いで、得られたマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１生
産変異株ＮＴＧ III−５５株を用いて、下記の表１に示
す組成のグルコース−ソイトン培地２００ｍｌを含む５
００ｍｌ容三角フラスコ内でガラスビーズを入れて振盪
培養した場合、８日目で培養液１ｍｌあたり３．５単位
の酵素生産が検出できた。
明する。実施例１ アラゲカワラタケＩＦＯ４９１７株由来の一核菌糸が形
成した分裂子を、８０μｇ／ｍｌ濃度のニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）を含むりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）中に２８℃で１時間放置することにより突然変
異処理を行った。生き残った分裂子をスクリーニングプ
レート（ＡｚｕｒｅＢを９６０ｍＭ、グルコースを１．
５％、yeast nitrogen base w/o amino acidを０．６７
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．０５％、ＫＨ2ＰＯ4を
０．１％、およびａｇａｒを１．５％含み、培地ｐＨ
５．０）に生育させ、マンガンパーオキシダーゼＣＨ−
１を生産し、ＡｚｕｒｅＢを脱色する株であるＮＴＧ I
II−５５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０４６）を選抜した。
次いで、得られたマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１生
産変異株ＮＴＧ III−５５株を用いて、下記の表１に示
す組成のグルコース−ソイトン培地２００ｍｌを含む５
００ｍｌ容三角フラスコ内でガラスビーズを入れて振盪
培養した場合、８日目で培養液１ｍｌあたり３．５単位
の酵素生産が検出できた。
【００２３】
【表１】
【００２４】なお酵素の力価測定は、Ｍｎ（II）を基質
として、過酸化水素およびマロン酸ナトリウムを共存さ
せた下記の表２に示すの組成の反応液中で室温で反応さ
せ、生成するＭｎ（III）− マロン酸複合体の２７０ｎ
ｍの波長における吸光度の値を経時的に記録測定して行
った。１分間に吸光度を１．０増加させる活性を１単位
とした。
として、過酸化水素およびマロン酸ナトリウムを共存さ
せた下記の表２に示すの組成の反応液中で室温で反応さ
せ、生成するＭｎ（III）− マロン酸複合体の２７０ｎ
ｍの波長における吸光度の値を経時的に記録測定して行
った。１分間に吸光度を１．０増加させる活性を１単位
とした。
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例２ アラゲカワラタケＩＦＯ−４９１７株由来のマンガンパ
ーオキシダーゼＣＨ−１高生産変異株ＮＴＧ III−５５
を、下記の表３に示す低濃度窒素源培地（Ｂｏｎｎａｒ
ｍｅらの培地）１．５Ｌを含むエアーリフト型２Ｌ培養
槽で２８℃で培養した。培養２日目にダイズレクチン
（０．１ｇ／Ｌ）とベラトリルアルコール（２．５ｍ
Ｍ）を添加し、７日目に培養を終了した。ガラス濾紙で
濾過し、培養上清を採取した。２０ｍＭこはく酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で一夜透析し、粗酵素液を得た。粗酵素
液のマンガンパーオキシダーゼ活性は、低濃度窒素源培
地１．５Ｌを含むエアーリフト型２Ｌ培養槽の場合６日
目で培養液１ｍｌあたり３．６単位が検出できた。
ーオキシダーゼＣＨ−１高生産変異株ＮＴＧ III−５５
を、下記の表３に示す低濃度窒素源培地（Ｂｏｎｎａｒ
ｍｅらの培地）１．５Ｌを含むエアーリフト型２Ｌ培養
槽で２８℃で培養した。培養２日目にダイズレクチン
（０．１ｇ／Ｌ）とベラトリルアルコール（２．５ｍ
Ｍ）を添加し、７日目に培養を終了した。ガラス濾紙で
濾過し、培養上清を採取した。２０ｍＭこはく酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で一夜透析し、粗酵素液を得た。粗酵素
液のマンガンパーオキシダーゼ活性は、低濃度窒素源培
地１．５Ｌを含むエアーリフト型２Ｌ培養槽の場合６日
目で培養液１ｍｌあたり３．６単位が検出できた。
【００２７】
【表３】
【００２８】低濃度窒素源培地１．５Ｌを含むエアーリ
フト型培養槽で７日間培養し、２０ｍＭこはく酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で透析して得た粗酵素液は、該緩衝液で
平衡化したゲル濾過カラム、ＤＥＡＥトヨパール６５０
−Ｍ ＴＳＫｇｅｌ（東ソー（株）社製）直径２．５ｃ
ｍ×１８ｃｍに通し、吸着画分を０Ｍから０．５Ｍまで
の濃度勾配でＮａＣｌを含む該緩衝液を通して溶出し７
ｍｌずつ分画した。マンガンパーオキシダーゼ活性は２
つのピークに分かれて溶出し、マンガンパーオキシダー
ゼＣＨ−１は後から溶出したピークである。
フト型培養槽で７日間培養し、２０ｍＭこはく酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で透析して得た粗酵素液は、該緩衝液で
平衡化したゲル濾過カラム、ＤＥＡＥトヨパール６５０
−Ｍ ＴＳＫｇｅｌ（東ソー（株）社製）直径２．５ｃ
ｍ×１８ｃｍに通し、吸着画分を０Ｍから０．５Ｍまで
の濃度勾配でＮａＣｌを含む該緩衝液を通して溶出し７
ｍｌずつ分画した。マンガンパーオキシダーゼ活性は２
つのピークに分かれて溶出し、マンガンパーオキシダー
ゼＣＨ−１は後から溶出したピークである。
【００２９】マンガンパーオキシダーゼＣＨ−１のピー
ク画分を集め、アミコン社製限外濾過膜ＰＭ−３０を用
いて限外濾過濃縮したところ、フェノールオキシダーゼ
活性がわずかに混入していたため、該緩衝液で平衡化し
たゲル濾過カラム、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００（直
径２．５ｃｍ×９３ｃｍ）に通し、流速２０ｍｌ／ｈｒ
とし、５ｍｌずつ分画した。マンガンパーオキシダーゼ
ＣＨ−１画分を集め、限外濾過により濃縮した後、さら
にｐＨ６．０酢酸緩衝液で平衡化したＨＰＬＣカラム、
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（直径５ｍｍ×５０ｍｍ）に通
した。流速を１．５ｍｌ／ｍｉｎとし、０〜０．５Ｍの
濃度勾配でＮａＣｌを含む該緩衝液で溶出した。検出は
２８０ｎｍおよびヘム蛋白の特異吸収４０７ｎｍの吸光
度で行なった。マンガンパーオキシダーゼＣＨ−１は２
７分から２９分にかけて溶出した。ＨＰＬＣで分画した
マンガンパーオキシダーゼＣＨ−１は、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により単一の酵素に精製されて
いることを確認した。
ク画分を集め、アミコン社製限外濾過膜ＰＭ−３０を用
いて限外濾過濃縮したところ、フェノールオキシダーゼ
活性がわずかに混入していたため、該緩衝液で平衡化し
たゲル濾過カラム、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００（直
径２．５ｃｍ×９３ｃｍ）に通し、流速２０ｍｌ／ｈｒ
とし、５ｍｌずつ分画した。マンガンパーオキシダーゼ
ＣＨ−１画分を集め、限外濾過により濃縮した後、さら
にｐＨ６．０酢酸緩衝液で平衡化したＨＰＬＣカラム、
ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（直径５ｍｍ×５０ｍｍ）に通
した。流速を１．５ｍｌ／ｍｉｎとし、０〜０．５Ｍの
濃度勾配でＮａＣｌを含む該緩衝液で溶出した。検出は
２８０ｎｍおよびヘム蛋白の特異吸収４０７ｎｍの吸光
度で行なった。マンガンパーオキシダーゼＣＨ−１は２
７分から２９分にかけて溶出した。ＨＰＬＣで分画した
マンガンパーオキシダーゼＣＨ−１は、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動により単一の酵素に精製されて
いることを確認した。
【００３０】以下にマンガンパーオキシダーゼCH-1の性
質について調べた。 (1) 作用機序 本酵素の作用機序を確認するためにＭｎ（II）を基質と
して表２の組成の反応液中で室温で反応させた。反応液
の可視および紫外吸収スペクトル（５００〜２００ｎ
ｍ）の経時的変化を測定した。結果は図１に示したよう
にＭｎ（III） −マロン酸複合体の示す２７０ｎｍの紫
外吸収の増加が認められ、Ｍｎ（II）からＭｎ（III）
への酸化が確認できた。
質について調べた。 (1) 作用機序 本酵素の作用機序を確認するためにＭｎ（II）を基質と
して表２の組成の反応液中で室温で反応させた。反応液
の可視および紫外吸収スペクトル（５００〜２００ｎ
ｍ）の経時的変化を測定した。結果は図１に示したよう
にＭｎ（III） −マロン酸複合体の示す２７０ｎｍの紫
外吸収の増加が認められ、Ｍｎ（II）からＭｎ（III）
への酸化が確認できた。
【００３１】(2) 至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３以下）、マ
ロン酸ナトリウム（ｐＨ３〜６）、りん酸ナトリウム
（ｐＨ６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）を
用いて測定した。酵素の活性は図２に示されるようにｐ
Ｈ５．５で最大となった。ｐＨ安定性は本発明の酵素を
１０ｍＭの所定の緩衝液中で５０℃、一時間保持し活性
を測定した。結果は図３に示すとおりであって、ｐＨ
４．０〜６．０で安定であった。なお、ｐＨ２．２はグ
リシン−塩酸緩衝液、ｐＨ２．９は酒石酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ３．３〜６．５はマロン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ５．６は酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．１は
りん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０，８．９はトリス
塩酸緩衝液、ｐＨ１０．０〜１０．６はグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液を用いて測定した。
ロン酸ナトリウム（ｐＨ３〜６）、りん酸ナトリウム
（ｐＨ６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）を
用いて測定した。酵素の活性は図２に示されるようにｐ
Ｈ５．５で最大となった。ｐＨ安定性は本発明の酵素を
１０ｍＭの所定の緩衝液中で５０℃、一時間保持し活性
を測定した。結果は図３に示すとおりであって、ｐＨ
４．０〜６．０で安定であった。なお、ｐＨ２．２はグ
リシン−塩酸緩衝液、ｐＨ２．９は酒石酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ３．３〜６．５はマロン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ５．６は酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．１は
りん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０，８．９はトリス
塩酸緩衝液、ｐＨ１０．０〜１０．６はグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液を用いて測定した。
【００３２】(3) 至適温度及び熱安定性 至適温度は温度条件を変えて本発明の酵素活性を測定し
た。結果は図４に示す通りであって、その至適温度は４
５℃であった。熱安定性は２０ｍＭマロン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）中４０〜６５℃の各温度で本発明の酵素を１
０分間放置し、酵素活性を測定した。その結果は図５に
示す通りであって、本発明の酵素は５０℃まで安定であ
った。
た。結果は図４に示す通りであって、その至適温度は４
５℃であった。熱安定性は２０ｍＭマロン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）中４０〜６５℃の各温度で本発明の酵素を１
０分間放置し、酵素活性を測定した。その結果は図５に
示す通りであって、本発明の酵素は５０℃まで安定であ
った。
【００３３】(4) 等電点 アンホラインディスクゲルｐＨ３．６〜５．７による等
電点電気泳動の結果より等電点は４．０であった。 (5) 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し、
約４９，０００であった。 (6) 金属イオン、阻害剤の影響 種々の金属塩を反応液中に１ｍＭの濃度で添加し、活性
を測定した。結果は表４に示した通りであり、Ｈｇ2+、
Ａｌ3+により弱く阻害を受け、Ｆｅ2+、Ｃｕ2+で強く阻
害された。金属イオンによる阻害は、反応中に生成した
Ｍｎ3+がこれらの金属イオンを酸化するために使われた
ため活性値が低くなったことも考えられる。
電点電気泳動の結果より等電点は４．０であった。 (5) 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し、
約４９，０００であった。 (6) 金属イオン、阻害剤の影響 種々の金属塩を反応液中に１ｍＭの濃度で添加し、活性
を測定した。結果は表４に示した通りであり、Ｈｇ2+、
Ａｌ3+により弱く阻害を受け、Ｆｅ2+、Ｃｕ2+で強く阻
害された。金属イオンによる阻害は、反応中に生成した
Ｍｎ3+がこれらの金属イオンを酸化するために使われた
ため活性値が低くなったことも考えられる。
【００３４】
【表４】
【００３５】阻害剤等種々の物質を反応液中に１ｍＭの
濃度で添加し、活性を測定した。結果は表５に示した通
りであり、シアン化カリウム、ＮａＮ3 、メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡで強く阻害さ
れた。
濃度で添加し、活性を測定した。結果は表５に示した通
りであり、シアン化カリウム、ＮａＮ3 、メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡで強く阻害さ
れた。
【００３６】
【表５】
【００３７】(7) 本酵素はヘムタンパク質の特徴である
４０７ｎｍ付近の吸収があり、水溶液は褐色を呈する。 (8) 本酵素の作用には過酸化水素を必要とする。
４０７ｎｍ付近の吸収があり、水溶液は褐色を呈する。 (8) 本酵素の作用には過酸化水素を必要とする。
【００３８】比較例１ アラゲカワラタケＩＦＯ４９１７株を実施例１記載の方
法で培養しマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１を生産さ
せようとした場合、８日目で１ｍｌあたり０．３単位の
酵素生産しか行われなかった。
法で培養しマンガンパーオキシダーゼＣＨ−１を生産さ
せようとした場合、８日目で１ｍｌあたり０．３単位の
酵素生産しか行われなかった。
【００３９】比較例２ アラゲカワラタケＩＦＯ４９１７株をLeont'eveskiiら
の培養方法（Biochemistry-USSR, 56巻, (9), Part2, 1
173-1180 (1992)）に従って培養し、本発明の酵素を生
産せしめようとした場合、マンガンパーオキシダーゼＣ
Ｈ−１活性は全く検出されなかった。
の培養方法（Biochemistry-USSR, 56巻, (9), Part2, 1
173-1180 (1992)）に従って培養し、本発明の酵素を生
産せしめようとした場合、マンガンパーオキシダーゼＣ
Ｈ−１活性は全く検出されなかった。
【００４０】比較例３ アラゲカワラタケＩＦＯ４９１７株をＤｏｄｓｏｎらの
方法（FEMS Microbiology Letters, 42巻, 17-22(198
7)）に従って培養した場合、マンガンパーオキシダーゼ
ＣＨ−１活性は１６日目で０．６単位であった。
方法（FEMS Microbiology Letters, 42巻, 17-22(198
7)）に従って培養した場合、マンガンパーオキシダーゼ
ＣＨ−１活性は１６日目で０．６単位であった。
【００４１】比較例４ アラゲカワラタケＩＦＯ４９１７株をＢｏｎｎａｒｍｅ
らの方法（Appl. Environ. Microbiol., 56巻, No. 1,
210-217 (1990)）に従って培養し本発明の酵素を生産せ
しめようとした場合、該酵素活性は４日目で１．６単位
であった。
らの方法（Appl. Environ. Microbiol., 56巻, No. 1,
210-217 (1990)）に従って培養し本発明の酵素を生産せ
しめようとした場合、該酵素活性は４日目で１．６単位
であった。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、従来より知られているリ
グニン分解酵素生産菌とは異なる起源の微生物から、従
来の酵素より至適ｐＨが高く、リグニンの低分子化、分
解に有効な、新規なリグニン分解酵素であるマンガンパ
ーオキシダーゼＣＨ−１を製造することが可能となっ
た。
グニン分解酵素生産菌とは異なる起源の微生物から、従
来の酵素より至適ｐＨが高く、リグニンの低分子化、分
解に有効な、新規なリグニン分解酵素であるマンガンパ
ーオキシダーゼＣＨ−１を製造することが可能となっ
た。
【図１】Ｍｎ（II）を含む酵素反応液中で形成されたＭ
ｎ（III） −マロン酸複合体の吸収スペクトルの経時的
変化（過酸化水素添加前、過酸化水素添加２分後、５分
後）を示す。
ｎ（III） −マロン酸複合体の吸収スペクトルの経時的
変化（過酸化水素添加前、過酸化水素添加２分後、５分
後）を示す。
【図２】本発明の酵素の至適反応ｐＨを示す。図中○は
酒石酸ナトリウム緩衝液、●はマロン酸ナトリウム緩衝
液、□は酢酸ナトリウム緩衝液、▲はりん酸ナトリウム
緩衝液を用いて測定したものである。
酒石酸ナトリウム緩衝液、●はマロン酸ナトリウム緩衝
液、□は酢酸ナトリウム緩衝液、▲はりん酸ナトリウム
緩衝液を用いて測定したものである。
【図３】本発明の酵素のｐＨ安定性を示す。
【図４】本発明の酵素の至適反応温度を示す。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/08 C12N 1/14 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の性質を有するマンガンパーオキシ
ダーゼＣＨ−１（１） 作用過酸化水素存在下で二価の
マンガンイオンを三価に酸化する。 （２） 基質特異性二価のマンガンを酸化する。 （３） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性至適ｐＨはｐＨ５．
５であり、ｐＨ４．０〜６．０の範囲で安定である。 （４） 至適温度および熱安定性至適温度は４５℃であ
り、５０℃までの熱に安定である。 （５） 等電点は４．０付近である。 （６） 分子量は約４９，０００である。 （７） Ｈｇ2+、Ａｌ3+により弱く阻害を受け、Ｆ
ｅ2+、Ｃｕ2+、シアン化カリウム、ＮａＮ 3 、メルカプ
トエタノール、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡで強く阻
害される。 - 【請求項２】 請求項１記載のマンガンパーオキシダー
ゼＣＨ−１の生産能を有するアラゲカワラタケ由来の変
異株であるＮＴＧIII−５５株（ＦＥＲＭＰ−１４０４
６）を培地に培養し、その培養物からマンガンパーオキ
シダーゼＣＨ−１を採取することを特徴とするマンガン
パーオキシダーゼＣＨ−１の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6694194A JP3161213B2 (ja) | 1994-04-05 | 1994-04-05 | マンガンパーオキシダーゼｃｈ−１及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6694194A JP3161213B2 (ja) | 1994-04-05 | 1994-04-05 | マンガンパーオキシダーゼｃｈ−１及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07274958A JPH07274958A (ja) | 1995-10-24 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP6694194A Expired - Fee Related JP3161213B2 (ja) | 1994-04-05 | 1994-04-05 | マンガンパーオキシダーゼｃｈ−１及びその製造方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3161213B2 (ja) |
-
1994
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