KR100516443B1

KR100516443B1 - 미생물을 이용한 효소 락카아제의 제조방법

Info

Publication number: KR100516443B1
Application number: KR10-1998-0047631A
Authority: KR
Inventors: 오광근; 이철우; 박근우; 김현수
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 1998-11-04
Filing date: 1998-11-04
Publication date: 2005-11-25
Also published as: KR20000031536A

Abstract

본 발명은 한국종균협회에 KFCC 10941로 기탁된 트라메테스속 씨제이105(Trametes sp. CJ-105)의 균사체를 탄소원으로 포도당을, 질소원으로 암모늄 타트레이트를, 비타민으로 티아민과 비오틴을 사용하여 배양하여 리그닌을 비롯한 각종 유해화합물 분해에 작용하는 효소 락카아제(laccase)를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

미생물을 이용한 효소 락카아제의 제조방법{Process for Producing Enzyme Laccase using Microorganism}

본 발명은 미생물을 배양하여 효소 락카아제(laccase)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 백색부후균(white rot fungi: WRF)인 트라메테스속 씨제이105(Trametes sp. CJ-105)를 배양하여 리그닌과 각종 유해화합물의 분해에 작용하는 효소 락카아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 트라메테스속 씨제이105는 본 발명자들이 자연에서 분리한 것으로 각종 아조계, 중합계, 반응성염료에 대하여 분해성을 확인하여 특허출원한 균주로 (참조: 1996년 12월 17일에 출원된 특허출원 제96-66550호), 한국종균협회에 KFCC 10941로 기탁되어 있다.

백색부후균은 담자균류(Basidiomycetes)에 속하는 균류의 일종으로서 각종 난분해물질을 비특이적으로 분해할 수 있는 리그닌분해효소(Ligninolytic enzyme)를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이러한 리그닌분해효소로는 리그닌퍼옥시다제(Lignin peroxidase), 망간-의존-퍼옥시다제(Mn(II)-dependent peroxidase) 및 락카아제를 들 수 있으며 그 중에서 락카아제는 구리를 함유한 폴리페놀 옥시다제로서 산소분자가 물분자로 환원될 때 폴리페놀, 메톡시-치환 모노페놀, 방향족아민류 등의 전자를 유리시켜 라디칼을 형성시킨다. 락카아제 촉매에 의해 형성된 라디칼은 여러 종류의 중합반응, 제거반응 및 기타 다른 반응을 수행한다. 따라서, 효소 락카아제는 페놀류 화합물을 비롯한 각종 난분해물질을 산화시켜 분해할 수 있는 능력을 갖고 있다. 즉, Chivukula 등(Appl. Environ. Microbiol. 61, 4374: 1995)은 피리쿨라리아 오리제(Pyricularia oryzae)에 의해 생산된 락카아제를 이용한 페놀류 아조계 염료의 분해에 관하여 보고하였고, Nicklas 등(Appl. Environ. Microbiol. 31, 70:1989)은 트라메테스 베르시콜로(Trametes versicolor)에 의해 생산된 락카아제를 이용하여 방향족 화합물의 분해에 대하여 보고하는 등 락카아제를 이용한 각종 유해화합물의 분해에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 한편, 락카아제를 생산하는 방법에 관해서는 Rao 등(Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 321:1992)이 모노실리움 인디쿰(Monocillium indicum)에 의한 락카아제의 생산에 대해 보고하였고 Thurston 등(Journal of General Microbiology. 139, 171:1993)은 아가리쿠스 비스포러스(Agaricus bisporus)에 의한 락카아제의 생산을 보고하였으며 Sanroman 등(Biotechnology Letters. 19, 995:1997)은 페네로키트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)을 반고체 배양하여 락카아제를 생산하는 방법에 대하여 보고하는 등 다양한 균주에 의해 락카아제를 생산하는 방법에 대해 연구가 진행되고 있다. 그러나, 아직까지 락카아제를 생산하는 효소활성이 낮을 뿐만 아니라 산업적으로 이용하기 위해서는 대량생산을 위한 락카아제의 생산방법을 확립할 필요가 있다.

산업이 발달함에 따라, 생태계에 자연적으로 존재하지 않는 화합물인 제노바이오틱스(Xenobiotics)라는 새로운 화합물이 많이 만들어지고 있다. 이들 대부분은 난분해성으로 강한 독성과 발암성을 갖고 있으며 자연환경에 축적되어 오염을 가중시킨다. 이러한 화합물은 산업용도에 이용되는 합성화합물, 폐기물이나 각종 부산물로부터 형성된 화합물 또는 산업용화합물이 환경적으로 변환된 물질로서, 대표적인 종류로는 염료류, 다이옥신류(Dioxin), 다환 방향족탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: PAH), 염소유도체 화합물, 다염소화 벤젠(Polychlorinated Benzene: PCB)등이 있다. 상기 화합물들을 처리하기 위해서는 우수한 미생물의 개발이 필수적이고 이를 잘 활용할 수 있는 기술을 개발할 필요가 있다. 백색부후균의 경우는 각종 화합물에 대하여 비특이적으로 작용할 수 있는 기작을 보유하여 다양한 난분해화합물을 분해할 수 있으며, 분해과정이 세포외에서 이루어지기 때문에 고농도의 독성화합물과 불용성화합물의 처리가 가능하고 현장적용에 있어서도 생장조건의 특이성으로 선택적인 성장을 보이므로 다른 미생물의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 이러한 특징 때문에 백색부후균은 생물학적 환경정화에 유용하게 사용될 수 있으며, 이를 적용하기 위해서는 우수한 균주를 선별하는 기술, 백색부후균의 균사체를 대량으로 배양하는 기술, 리그닌분해효소를 효소활성이 높게 생산하는 기술 등이 필요하다.

본 발명자들은 각종 아조계, 중합계, 반응성염료를 분해하는 능력이 우수한 백색부후균을 신규로 분리, 선별하여 동정한 결과 트라메테스속 씨제이105 케이에프씨씨 10941로 명명하였으며 이 균주를 배양하여 효소활성이 높은 락카아제를 생산하는 방법을 확립하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 트라메테스속 씨제이105를 배양하여 효소 락카아제를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 균주 트라메테스속 씨제이105는 한국종균협회에 1996년 12월 5일에 수탁번호 KFCC-10941로 기탁, 보관되어 있다. 상기의 균주는 YM배지(효모추출물 3g/ℓ, 맥아 추출물 3g/ℓ, 포도당 10g/ℓ, 펩톤 5g/ℓ, 한천 17g/ℓ pH 6.8)의 사면배지에 27℃에서 배양한 후 4℃에서 보관하면서, 주기적으로 계대를 하였으며 필요시에 사용하였다. 락카아제를 생산하기 위한 트라메테스속 씨제이105의 배양은 전배양과 본배양으로 구성되는데 전배양은 상기 보관균주의 균사체 선단을 코크보러(직경 6mm)로 취한 후, YM배지에서 한천을 제외한 조성으로 만든 액체배지 50㎖를 함유하는 250㎖플라스크에 접종하여 25±1℃의 항온기에서 5일간 정치배양하였다. 본배양은 상기 전배양 액체배양액을 5000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 균사체를 멸균 증류수로 2회 세척하여 배지성분을 제거한 후에 증류수 50㎖을 첨가하여 블렌더로 1분간 균질화한 다음 플라스크 또는 발효기에 접종하여 실시하였다. 접종은 5%(V/V)를 하는 것이 일반적이며 25±1℃에서 플라스크배양일 경우에는 150rpm으로, 발효기배양일 경우에는 교반속도 70rpm, 공기주입량 0.5vvm으로 하여 배양하였다. 락카아제를 생산하는 트라메테스속 씨제이105의 배양에서 탄소원으로서 포도당, 글리세롤, 자일로즈, 프록토즈를 비롯한 단당류와 젖당, 설탕을 비롯한 이당류, 덱스트란, 셀룰로즈를 비롯한 다당류를 대상으로 배양하였으며 그 중에서 포도당의 경우가 균체성장과 락카아제 생산이 가장 우수하였고 또한, 포도당 농도를 0.1∼10%로 조정하여 비교하였을 때 농도가 2%인 경우가 균체성장과 락카아제 생산이 가장 우수하였다. 질소원으로는 아스파라진, 요소, 질산나트륨, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 암모늄 타트레이트를 대상으로 배양하였을 때 아스파라진의 경우가 균체성장이 좋았으나 암모늄 타트레이트가 락카아제의 생산에 있어서는 가장 우수했다. 한편, 암모늄 타트레이트 농도를 0.01% 내지 1%로 조정하여 비교하였을 때 농도가 0.04%인 경우 균체성장과 락카아제 생산이 가장 우수하였다.

또한, 비타민으로서 티아민과 비오틴을 첨가했을 때 균체성장과 락카아제 생산이 우수했으며 배양 최적조건으로서 pH를 3.0 내지 9.0으로 조정하여 비교했을 때 pH 5.0인 경우가 균체성장과 락카아제 생산이 가장 우수하였고 온도를 20℃ 내지 40℃로 조정하여 비교했을 때 25℃가 최적이었다. 락카아제 효소는 유도제(inducer)를 사용함으로써 그 생산을 증진시킬 수 있으며 이러한 작용을 하는 유도제로서는 2,5-자일리딘(2,5-Xylidine: 2,5-디메틸아닐린), 구아이아콜(guaiacol: 2-메톡시페놀) 및 베라트릴 알코올(Veratryl alcohol)등을 사용하였다. 그 중에서 유도제로서 2,5-자일리딘을 첨가했을 때 락카아제의 생산이 증대되었으며 최종농도를 0.1 내지 5mM되도록 한 다음 접종시 균사체량의 2 내지 3배 되는 시점인 배양 1 일 후에 첨가했을 때는 농도가 0.5mM일 때 락카아제 생산량이 가장 높았다. 또한, 2,5-자일리딘을 최종농도를 0.5mM로 조정하여 배양한지 1, 2, 3, 4일 후에 첨가하여 비교했을 때 접종시 균사체량의 2 내지 3배 되는 시점인 1일 후에 첨가할 때가 락카아제 생산이 가장 좋았다.

본 발명자들은 상기의 여러 가지 기본적인 락카아제 생산조건을 확립하였고, 이를 바탕으로 대량생산에 대한 조건을 검토하였다. 즉, 5리터 발효기를 사용하여 트라메테스속 씨제이105를 배양하면서 배양 1일 후에 2,5-자일리딘을 최종농도가 0.5mM이 되도록 첨가한 후 10일 동안 배양한 결과 암모늄이온이 급속히 감소하는 시기에 효소활성이 가장 높게 나타났으며 최고 340U/㎖의 락카아제를 생산할 수 있었다.

다음의 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예로 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1. 균주의 배양 및 락카아제 활성측정

트라메테스속 씨제이105 균주를 YM배지의 사면배지에서 27℃로 배양한후 4℃에서 보관하였다. 이후 상기 균주의 균사체의 선단을 코크보러(직경 6mm)로 취하여 한천을 제외한 같은 조성의 액체배지 50㎖을 함유하는 250㎖플라스크에 접종하여 25±1℃ 의 항온기에서 5일간 정치배양하였다. 상기 전배양 액체배양액을 5000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 균사체를 멸균 증류수로 2회 세척하여 배지성분을 제거한 후에 증류수 50㎖을 첨가하여 블렌더로 1분간 균질화한 다음 표 1 조성의 기본배지를 100㎖함유한 500㎖ 플라스크에 5%(v/v)씩 접종한 후 25±1℃의 진탕회전배양기(Vision, VS-8480SR)를 사용하여 150rpm으로 7일간 배양하였다. 또한, 균질화한 전배양액을 5리터 발효기에 5%(v/v)씩 접종한 후 25℃, pH 5.0, 교반속도 70rpm, 공기주입량 0.5vvm으로 고정하여 10일동안 배양하였다. 배양하는 동안 배양액 1㎖의 표본을 취하여 원심분리기(Vision, VS15000CFN)에서 4℃로 5분간 원심분리한 후 상등액에 대하여 포도당의 농도, 암모늄 이온농도, 락카아제 활성을 측정하였다.

트라메테스속 씨제이105의 배양배지 조성

성분	함량
탄소원	10g
질소원	2g
인산제1칼륨	1g
황산마그네슘·7수화물	0.5g
염화칼슘·2수화물	100㎍
황화철·7수화물	100㎍
황산구리·5수화물	20㎍
황산아연·7수화물	10㎍
황화망간·4수화물	10㎍
2,2-디메틸숙신산	4g/l
	pH5.0

포도당의 농도는 Sugar-pak I 칼럼(Milipore, USA)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R64, Japan)를 이용하여 측정하였고 암모늄 이온은 Ionpac CS12칼럼이 장착된 이온 크로마토그래피(Dionex, USA)를 사용하여 측정하였다. 한편, 락카아제는 0.1M의 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0) 2.5㎖에 상등액 0.17㎖을 혼합한 후, 5mM의 ABTS(2,2′-아지노비스azinobis-(3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트) 0.33㎖을 첨가하고 분광광도계(Miltonroy, Genesys2)를 이용하여 1분간 420nm에서 흡광도의 차이를 측정하였다(흡광계수=36,000M^-1cm^-1) 효소의 활성단위는 분당 1μmol의 ABTS를 산화시키는 효소의 양을 1 unit로 정하였다. 또한, 상기의 액체배지 전체를 미리 무게를 측정한 여과지(Whatman No. 2)를 사용하여 여과한 후 균사체를 증류수로 2회 세척하고 90℃ 건조기에서 12시간 건조하여 균사체량을 측정하였다.

실시예 2. 탄소원이 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향

각종 탄소원이 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 탄소원의 영향을 검토하였다. 포도당, 글리세롤, 자일로즈, 프록토즈를 비롯한 단당류와 젖당, 설탕을 비롯한 이당류, 덱스트란, 셀룰로즈를 비롯한 다당류를 각각 1%로 조정하여 배양한 후 배양 3일째에 균체량과 효소활성을 측정한 결과 도1과 같이 포도당이 다른 탄소원에 비하여 균체성장과 락카아제 생산이 우수하였다. 또한, 포도당을 0.1% 내지 10%범위에서 농도별로 조정하여 균체량과 효소생산과의 관계를 검토한 결과 도1과 같이 포도당의 농도가 증가함에 따라 균체성장이 증가했으며, 락카아제 생산은 포도당의 농도가 2%인 경우에 가장 높게 나타났다.

실시예 3. 질소원이 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향

각종 질소원이 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 질소원의 영향을 검토하였다. 아스파라진, 요소, 질산나트륨, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 암모늄 타트레이트를 각각 0.2%으로 조정하여 배양 3일 후 균체량과 효소활성을 측정한 결과 도2와 같이 균체성장의 경우에는 아스파라진이 가장 좋았으나 락카아제 생산에 있어서는 암모늄 타트레이트가 가장 우수하였다. 한편, 암모늄 타트레이트의 최적농도 조건을 확립하기 위하여 암모늄 타트레이트를 0.01% 내지 1%의 범위에서 농도별로 조정하여 균체량과 효소생산과의 관계를 검토한 결과 도2와 같이 암모늄 타트레이트의 농도가 증가함에 따라 균체성장이 증가했으며, 락카아제 생산은 암모늄 타트레이트의 농도가 0.04%인 경우에 가장 높게 나타났다.

실시예 4. 비타민 첨가가 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향

트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 비타민 첨가의 영향을 알아보기 위하여 티아민과 비오틴을 첨가하지 않은 경우를 대조구로 하고 티아민과 비오틴을 각각 100μg씩 첨가한 경우와 티아민과 비오틴을 모두 100μg 첨가한 경우에 배양 3일 후 균체량과 효소활성을 측정한 결과 하기 표2와 같이 티아민과 비오틴을 모두 첨가했을 때 균체성장과 락카아제 생산이 우수하게 나타났다.

비타민 첨가가 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향

비타민	상대적 성장율(%)	상대적 활성(%)
대조구	63	82
티아민	72	95
비오틴	80	97
티아민+비오틴	100	100

실시예 5. 초기 pH가 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향

배양배지의 초기 pH를 3.0 내지 9.0의 범위에서 여러 가지로 조정하여 배양 3일 후 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산을 측정한 결과 도3과 같이 pH 5.0의 경우에 균체성장과 락카아제 생산이 가장 좋았다.

실시예 6. 배양온도가 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향

배양온도가 균체성장과 락카아제 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 온도를 20℃ 내지 40℃의 범위에서 여러 가지로 조정하여 균체량과 효소활성을 배양 3일째에 측정한 결과 도4와 같이 배양온도가 25℃일 때 균체성장과 락카아제 생산이 가장 높게 나타났으며 그 이상의 온도에서는 점차 감소하였다.

실시예 7. 2,5-자일리딘 농도별 첨가가 트라메테스속 씨제이105의 균사체를 배양하여 락카아제 생산을 유도하는데 미치는 영향

트라메테스속 씨제이105의 락카아제 생산을 유도하기 위해 50%의 에탄올에 용해시킨 2,5-자일리딘을 최종농도가 0.1 내지 5mM이 되도록 조정한 후, 접종시 균사체량의 2 내지 3배 되는 시점인 배양 1일 후에 첨가하고, 첨가하지 않은 대조구와 각각 락카아제 생산을 비교하였다. 그 결과 도5에서와 같이 2,5-자일리딘의 농도가 0.5mM일 때 락카아제 생산이 가장 우수하였으며, 5mM을 첨가한 경우는 대조구에 비하여 효소생산이 저하되었다.

실시예 8. 2,5-자일리딘 첨가시기가 트라메테스속 씨제이105의 균사체를 배양하여 락카아제를 생산하는데 미치는 영향

트라메테스속 씨제이105의 락카아제 생산을 유도하기 위해 50%의 에탄올에 용해시킨 2,5-자일리딘을 최종농도가 0.5mM이 되도록 조정한 후 배양 1일, 2일, 3일, 4일 후에 각각 첨가하여 락카아제 생산을 비교하였다. 그 결과 도6에서와 같이 접종시 균사체량의 2 내지 3배 되는 시점인 배양 1일후 첨가한 경우가 상대적으로 높게 나타났으며 첨가시기가 늦을수록 활성이 낮게 나타났다.

실시예 9. 트라메테스속 씨제이105의 균사체 배양에 의한 락카아제의 대량생산

상기의 실시예에서 도출된 최적조건을 바탕으로 발효기를 이용하여 락카아제를 대량 생산하는 방법을 확인하였다. 즉, 트라메테스속 씨제이105의 균사체 선단을 코크보러(직경 6mm)로 취한 후, YM배지에서 한천을 제외한 조성으로 만든 액체배지 50㎖를 함유하는 250㎖ 플라스크에 접종하여 25±1℃의 항온기에서 5일간 정치배양하였다. 상기 액체배양액을 5000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 균사체를 멸균 증류수로 2회 세척하여 배지성분을 제거한 후에 증류수 50㎖을 첨가하여 블렌더로 1분간 균질화한 다음 교반속도 70rpm, 공기주입량 0.5vvm으로 조정한 5리터 발효기에 5%(V/V)로 접종하여 배양하였다. 접종시 균사체량의 2 내지 3배 되는 시점인 배양 1일후 2,5-자일리딘을 최종농도가 0.5mM이 되도록 첨가한 후 10일 동안 배양한 결과 도7에서와 같이 암모늄이온이 급속히 감소하는 시기에 효소활성이 가장 높게 나타났으며 최고 340U/㎖의 락카아제를 대량 생산할 수 있었다.

트라메테스속 씨제이105를 배양하여 효소 락카아제를 생산하는 방법이 확립되어 향후 효소제제를 비롯한 다양한 생물학적 환경정화기술(Bioremediation)에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

도1은 본 발명에 따른 트라메테스속 씨제이105(Trametes sp. CJ-105)의 균체성장과 효소 락카아제(laccase)생산에 미치는 탄소원의 영향을 나타낸 그래프이다.

도2는 본 발명에 따른 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 효소 락카아제 생산에 미치는 질소원의 영향을 나타낸 그래프이다.

도3은 본 발명에 따른 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 효소 락카아제 생산에 미치는 초기 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.

도4는 본 발명에 따른 트라메테스속 씨제이105의 균체성장과 효소 락카아제 생산에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.

도5는 본 발명에 따른 효소 락카아제생산의 유도제로서 2,5-자일리딘의 농도별 첨가 영향을 나타낸 그래프이다.

도6은 본 발명에 따른 효소 락카아제생산의 유도제로서 2,5-자일리딘의 첨가시기에 따른 영향을 나타낸 그래프이다.

도7은 본 발명에 따른 5리터 발효기에서의 트라메테스속 씨제이105의 균사체 배양에 따른 효소 락카아제 생산의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.

Claims

트라메테스속 씨제이105의 균사체를 탄소원으로 포도당을, 질소원으로 암모늄 타트레이트를, 비타민으로 티아민과 비오틴을 사용하여 배양함을 특징으로 하여 락카아제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 포도당의 최종농도를 2%로 하여 배양함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 암모늄 타트레이트의 최종농도를 0.04%로 하여 배양함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 초기 pH를 5.0으로 조정하여 25℃의 온도로 배양함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 2,5-자일리딘을 첨가하여 배양함을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 2,5-자일리딘을 최종농도가 0.5mM 되도록 첨가함을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 2,5-자일리딘의 첨가시기가 배양 1일 후임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 교반속도 70rpm, 공기주입량 0.5vvm으로 하여 배양 1일후 2,5-자일리딘을 최종농도가 0.5mM이 되도록 첨가한 후 10일 동안 배양함을 특징으로 하는 방법.