CN112359026B - 一种提高毛木耳中漆酶含量的方法 - Google Patents

一种提高毛木耳中漆酶含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食用菌发酵技术领域，具体涉及一种提高毛木耳中漆酶含量的方法，本发明提供一种诱导物，所述诱导物为麦麸汁；在有氧及避光条件下，含有碳源、氮源及无机组分的无菌发酵培养基中培养毛木耳，发酵培养基由葡萄糖、麦芽糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、及麸皮汁组成，能够在短时间内发酵获得较高活性的漆酶，漆酶的发酵周期缩短，显现出广阔的应用潜力。

Description

一种提高毛木耳中漆酶含量的方法
技术领域
本发明属于食用菌发酵技术领域，具体涉及一种提高毛木耳中漆酶含量的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
大量研究表明，白腐真菌由于其产生非特异性胞外酶，如木质素分解酶系统中的漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶等，可用于秸秆降解，生物漂白以及污染物的治理，降解有毒化合物的能力具有广泛的底物特异性，可以降解代谢多种化学物质，包括化学合成染料。使得白腐真菌在工业和生活方面的应用研究受到广泛重视，显现出广阔的应用潜力。
漆酶，是一种含四个铜离子的多酚氧化酶，作为一种绿色催化剂，其催化底物广，且大多数催化反应的唯一产物为水，这一优良性能使其广泛应用于各个领域。实际应用于生产的漆酶主要来源于真菌和细菌，国内外的主要生产菌株为白腐真菌。毛木耳Auricularia cornea隶属于木耳科木耳属，是较为常见的白腐真菌，木质素酶产酶能力较强。但自然条件下生长的菌株漆酶产量及漆酶活力普遍较低，若能在毛木耳发酵过程中提高毛木耳漆酶产量，获得性能优良的漆酶，开发漆酶的应用研究具有重要意义。因此，目前需要解决的一个关键性问题是如何在控制成本的前提下提高漆酶的产量。
发明内容
在为了解决上述问题，本发明提供一种提高毛木耳中漆酶含量的方法，通过研究发现，在毛木耳液体培养基中添加适宜含量的麦麸汁，能有效促进毛木耳漆酶的生物合成，显著提高毛木耳发酵液中漆酶含量，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种提高毛木耳中漆酶含量的诱导物，所述诱导物为麦麸汁。
本发明第二方面，提供一种提高毛木耳中漆酶含量的方法，包括以下步骤：
（1）菌丝体培养：在无菌环境下接种毛木耳菌块至母种培养基培养皿中央，黑暗条件下培养；
（2）诱导物筛选：在250 mL锥形瓶中加入CYM诱导培养基后灭菌处理，在无菌环境下接种菌块，振荡条件下培养，发酵液离心后取上清液即得粗酶液，用于漆酶酶活测定；
所述CYM诱导培养基的配制方法为：将1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、 0.46%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O，20g诱导物煮5min后加水定容至100mL，配成20%（W/V）的CYM诱导培养基。
本发明第三方面，提供上述方法在染料降解、木质素／纤维素降解、生物漂白、生态修复等领域的应用。
本发明的一个或多个具体实施方式至少取得了以下技术效果：
（1）在有氧及避光条件下，含有碳源、氮源及无机组分的无菌发酵培养基中培养毛木耳，发酵培养基由葡萄糖、麦芽糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、及麸皮汁组成，能够在短时间内发酵获得较高活性的漆酶，漆酶的发酵周期缩短，在发酵前期即可进行纯化，便于投入到工业生产，降低生产成本；
（2）处理前 CYM基础培养基漆酶产量为115.3379U/mL，添加麦麸汁进行诱导后，漆酶产量为595.4461U/mL，是CYM基础培养基漆酶产量的5.16倍；经过响应面实验，最适条件下CYM诱导培养基漆酶产量为1537.564U/mL，是 CYM基础培养基漆酶产量的13.33倍；
（3）本发明方法使用的发酵培养基组成成分极为简单，操作简便，省时省力，利于广泛推广使用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明实施例1中不同诱导物对漆酶酶活的影响；
图2为本发明实施例1中菌块接种量对漆酶酶活的影响；
图3为本发明实施例1中培养温度对漆酶酶活的影响；
图4为本发明实施例1中培养转速对漆酶酶活的影响；
图5为本发明实施例1中CYM诱导培养基浓度对漆酶酶活的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，自然条件下生长的菌株漆酶产量及漆酶活力普遍较低，因此，本发明提出一种提高毛木耳中漆酶含量的方法，该方法能够有效促进毛木耳漆酶的生物合成，显著提高毛木耳发酵液中漆酶含量，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明第一方面，提供一种提高毛木耳中漆酶含量的诱导物，所述诱导物为麦麸汁；
本发明第二方面，提供一种提高毛木耳中漆酶含量的方法，包括以下步骤：
（1）菌丝体培养：在无菌环境下接种毛木耳菌块至母种培养基培养皿中央，黑暗条件下培养；
（2）诱导物筛选：在250 mL锥形瓶中加入CYM诱导培养基后灭菌处理，在无菌环境下接种菌块，振荡条件下培养，发酵液离心后取上清液即得粗酶液，用于漆酶酶活测定；
所述CYM诱导培养基的配制方法为：将1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、 0.46%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O，20g诱导物煮5min后加水定容至100mL，配成20%（W/V）的CYM诱导培养基。
进一步地，步骤（1）中，所述母种培养基固体原料及其重量百分比为：1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、 0.46% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O，随后在1L培养基加20g琼脂粉，121℃灭菌20 min；
进一步，所述步骤（1）中培养温度为26℃，培养时间为8d，母种培养基直径为9cm；
进一步，所述步骤（1）和（2）中的菌块直径均为0.7cm；
进一步，所述步骤（2）中菌块数量为1-13个；
进一步，所述步骤（2）中培养温度为22℃-34℃；
进一步，所述步骤（2）中振荡培养转速为100r/min-190r/min，培养时间为7d；
进一步，所述步骤（2）中CYM诱导培养基质量浓度为5%-20%；
进一步，所述步骤（2）中灭菌条件为：121℃灭菌20min；
进一步，所述步骤（2）中离心条件为：4℃下6000r/min离心10min；
进一步，所述步骤（2）中诱导物为柏木汁、板栗木汁、桃木汁、玉米芯汁、米糠汁、麦麸汁、苹果木汁、棉籽壳汁、玫瑰汁、小米汁、苹果汁、梨木汁、葡萄树汁或石榴树汁的一种，更进一步，所述诱导物为麦麸汁。漆酶属于木质素降解酶类，麦麸作为木质素纤维素底物，提供了自然习性相近的环境，可激活毛木耳中漆酶活性。
本发明第三方面，提供上述方法在染料降解、木质素／纤维素降解、生物漂白、生态修复等领域的应用。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：
1、配制培养基
（1）母种培养基的固体原料及其重量百分比为：1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、 0.46% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O，随后在1L培养基加20g琼脂粉，121℃灭菌20 min；
（2）CYM基础培养基的固体原料及其重量比分比为：1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、0.46%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O，水1L；
（3）所述CYM诱导培养基的配制方法为：将1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、0.46%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O，20g诱导物煮5min后加水定容至100mL，配成20%（W/V）的CYM诱导培养基。
2、制备粗酶液
250mL三角瓶装100mL培养基，121℃条件下灭菌20min，接种5个0.7cm菌块，26℃、160rpm恒温震荡培养7d；
（1）在无菌环境下接种0.7cm菌块至9cm母种培养基培养皿中央，26℃黑暗条件下培养8d；
（2）诱导物筛选：在250mL锥形瓶中加入100mL10%的CYM诱导培养基，121℃灭菌20min。在无菌环境下接种5个直径为0.7cm的菌块，温度26℃，转速160r/min条件下振荡培养7d。发酵液在4℃下6000r/min离心10min，上清液即为粗酶液，以空白发酵液为对照，测定粗酶液中漆酶含量，所有操作均在无菌条件下进行。
3、漆酶活性的测定方法
1.0mL反应体系中加入0.17mL ABTS和0.03mL粗酶液，在反应温度为37℃预热5min后时，加入0.3mL三氯乙酸和0.5mL去离子水来终止反应，利用紫外分光光度计测定420nm处吸光度，以每分钟1.0μmol的ABTS被转化所需的酶量为1个酶活力单位。
计算公式：漆酶酶活(U/mL）=A÷ε÷d×V反总x109÷V样÷T
式中：
ε：ABTS摩尔消光系数；
d：比色皿光径；
V反总：反应总体积；
V样：反应中样本体积；
T：反应时间
4、不同诱导物对提高毛木耳中漆酶含量的影响
本试验分别探究了CYM、柏木汁、板栗木汁、桃木汁、玉米芯汁、米糠汁、麦麸汁、苹果木汁、棉籽壳汁、玫瑰汁、小米汁、苹果汁、梨木汁、葡萄树汁、石榴树汁几种诱导物对毛木耳中漆酶含量的影响，具体诱导方法如前所述。
试验结果如图1所示，采用麦麸汁作为诱导物对漆酶含量增加极为显著，可以达到600 U/mL，因此接下来的试验过程选用麦麸汁作为诱导剂。
5、单因素实验
（1）菌块接种量对漆酶含量的影响
使用CYM基础培养基分别接种1、5、9、13个菌块后置于26℃下160r/min振荡培养7d，每个条件重复3次；
试验结果如图2所示，菌块数量为5个时能够达到最高的漆酶产量，为350 U/mL，因此选择菌块数量为5进行接下来的研究。
（2）培养温度对漆酶含量的影响
使用 CYM基础培养基接种5个菌块后分别置于22℃、26℃、30℃、34℃下160r/min振荡培养7d，每个条件重复3次；
试验结果如图3所示，培养温度为26℃时能够达到最高的漆酶产量，为330 U/mL，因此选择培养温度为26℃进行接下来的研究。
（3）培养转速对漆酶含量的影响
使用CYM基础培养基接种5个菌块后分别置于26℃下100r/min、130r/min、160r/min、190r/min恒温振荡培养7d，每个条件重复3次；
试验结果如图4所示，转速为160r/min时能够达到最高的漆酶产量，为300 U/mL，因此选择转速为160r/min进行接下来的研究。
（4）CYM诱导培养基质量浓度对漆酶含量的影响
将20%的CYM诱导培养基分别稀释至5%、7.5%、10%、15%、17.5%，20%置于26℃下160r/min振荡培养7d，每个条件重复3次；
试验结果如图5所示，CYM诱导培养基为7.5%时能够达到最高的漆酶产量，为630U/mL，因此选择CYM诱导培养基为7.5%进行接下来的研究。
6、响应面优化
表 1 中心复合设计试验因素与水平
Figure 896095DEST_PATH_IMAGE001
采用Design-Expert 8.0.6.1实验设计软件设计4因素、3水平的响应面回归分析实验，如表1所示。按因素、水平组合进行27次测定毛木耳发酵液中漆酶含量的实验，实验结果见表2。
表 2 中心组合实验设计方案及考察指标响应值
Figure 206991DEST_PATH_IMAGE002
建立回归模型，以漆酶含量作为评价指标的响应值，获得自变量A（培养时间）、B（温度）、C（CYM诱导培养基）、D（pH）的二次多项式回归方程：
Y=1169.626333-66.55030556A+313.2817499B-139.9218889C-231.375D+203.4043333AB-23.49741675AC+71.05783333AD-43.44708335BC-236.1053334BD-351.1758334CD-350.9444583A2
-295.8772084B2-42.16166669C2-235.4883333D2，并对该模型进行方差分析和显著性检验，回归模型在统计学上呈极显著（p<0.0001），说明实验模型有统计学意义；失拟项p为 0.0106，不显著，说明实验模型拟合度较好，模型的残差可能来源于实验过程的随机误差。在所取的各因素水平范围内，对响应值的影响顺序为：A（培养时间）>D（pH）> C（CYM诱导培养基）> B（温度）。
根据上述所建立的数学模型进行参数优化分析，获得CYM诱导物培养基诱导毛木耳高产漆酶的最优条件为培养时间7d、培养温度26.9℃、10% CYM诱导培养基、pH5，在此条件下漆酶产量为1567.732U/mL。在实际条件下，将获得的最优提取条件进行验证试验，结果表明其漆酶产量为1537.564U/mL，与模型预测结果相符。
7、总结
处理前 CYM基础培养基漆酶产量为115.3379U/mL，添加麦麸汁进行诱导后，漆酶产量为595.4461U/mL，是CYM基础培养基漆酶产量的5.16倍；经过相应面实验，最适条件下CYM诱导培养基漆酶产量为1537.564U/mL，是 CYM基础培养基漆酶产量的13.33倍。因此，本申请提供的方法能够有效提高毛木耳中漆酶产量，且使用的发酵培养基组成成分极为简单，操作简便，省时省力，具有良好的实际应用价值。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种提高毛木耳中漆酶含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在无菌环境下接种毛木耳菌块至母种培养基培养皿中央，黑暗条件下培养；
所述母种培养基固体原料及其重量百分比为：1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、 0.46% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O，随后在1L培养基加20g琼脂粉，121℃灭菌20 min；
培养温度为26℃，培养时间为8d，母种培养基直径为9cm；
（2）在锥形瓶中加入CYM诱导培养基后灭菌处理，在无菌环境下接种菌块，振荡条件下培养，发酵液离心后取上清液即得粗酶液；
所述CYM诱导培养基的配制方法为：将1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、0.46%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O，20g诱导物煮5min后加水定容至100mL，配成20%（W/V）的CYM诱导培养基；
所述诱导物为麦麸汁；
培养时间为7d，培养温度为26℃，
所述振荡培养转速为160r/min；
所述CYM诱导培养基质量浓度为10%；
所述离心条件为：4℃下6000r/min离心10min；
所述灭菌条件为：121℃灭菌20min。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）中的菌块直径均为0.7cm。
3.如权利要求2中所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中菌块数量为1-13个。
4.权利要求1-3任一项所述方法在染料降解、木质素降解、纤维素降解、生物漂白或生态修复领域的应用。
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