CN103834695A - 一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用 - Google Patents

一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属化合物分离纯化技术领域，涉及一种微生物来源的新型真菌漆酶高效诱导化合物的发酵制备、分离纯化工艺，及其在诱导真菌漆酶生产方面的应用。其特征在于包括下述步骤：通过真菌发酵制备含有活性化合物的发酵液，经过萃取获得的活性化合物粗提物依次经不同层析树脂吸附，以不同浓度甲醇-水作为洗脱剂纯化精制，最终获得纯化的活性化合物分子；获得的活性化合物在1～500μM浓度下可以高效诱导漆酶生产真菌分泌胞外漆酶。本发明具有以下优点：诱导化合物来源于真菌次级代谢产物；诱导化合物工作浓度低，有效工作浓度为1～500μM；诱导化合物具有高的真菌漆酶诱导活性。

Description

一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用
本申请是申请日为2012年5月7日，申请号为2012101384476，发明名称为“一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用”的分案申请。
技术领域
本发明属于化合物分离纯化技术领域，涉及一种微生物来源的真菌漆酶诱导活性化合物的发酵制备、高纯度漆酶诱导活性化合物的纯化工艺及其在真菌漆酶诱导方面的应用。
背景技术
漆酶（Laccase,EC1.10.3.2）是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值（Arora DS,Sharma RK(2010)Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications.Appl Biochem Biotechnol160:1760–1788），近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。
漆酶广泛存在于高等真菌（特别是担子菌）中。多数真菌分泌的天然漆酶存在产量低、发酵周期长、后处理繁琐等缺点，无法满足工业化应用的需要。目前，用来提高漆酶的生物合成产量主要有两种方法：重组表达和添加化合物诱导。然而，重组表达产量依然较低、且生产成本高、后处理难度大，使漆酶生产的成本大大提高，限制了漆酶在工业生产中的应用；有效的诱导剂多为芳香类化合物或重金属离子，其有环境毒性并且价格昂贵，有效作用浓度大，通常在10-3～10-2摩尔级别，易造成环境污染，生产后的发酵液需要脱毒处理，提高了生产成本，同样无法突破漆酶产业化应用的瓶颈。因此，寻找一种清洁、高效的漆酶生产方式是推进漆酶产业化进程的迫切需要。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种高效真菌漆酶诱导活性化合物（名称为3-羟基-2-辛基-戊二酸）的发酵制备和分离纯化工艺及其在真菌漆酶诱导发酵方面的应用。
本发明的目的之一是提供一种对真菌漆酶具有高诱导活性的化合物，该化合物有如下分子式：
本发明的的另一目的是保护该活性化合物在诱导真菌漆酶合成方面的应用。
本发明的活性的化合物来源于微生物发酵菌株Gongronella sp，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉市武昌区八一路武汉大学；保藏日期：2012年3月27日；保藏号为：CCTCCAF2012004。
该活性化合物的发酵制备方法，是将上述发酵菌株，经发酵培养获得发酵液，然后再发酵液经分离纯化后获得纯活性化合物。
所述发酵培养是指将Gongronella sp.接种在经灭菌的pH4.0～7.0的发酵培养基中，于温度25～31℃、摇床转速100～150rpm条件下培养3～7天后通过纱布过滤收集发酵液备用；所述的发酵培养基为每升水中含10～20g蔗糖、1～2g DL-天冬酰胺、0.7～1.5g KH2PO4、0.2～0.6gMgSO4·7H2O、0.02～0.15g Na2PO4·7H2O、0.01～0.05g CaCl2、0.01～0.05g FeSO4·7H2O、0.01～0.04g腺嘌呤、20～60μg VB1。
作为优先，所述的发酵培养基为每升水中含15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g Na2PO4·7H2O、0.01g CaCl2、0.01g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤、50μg VB1。
所述分离纯化依次包括以下步骤：
(1)制备的发酵液通过萃取剂1:1（v/v）萃取，萃取液在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏，去除萃取剂，得到活性化合物粗制品；所述萃取剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚中的任意一种；
(2)将粗制品通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂A质量比1:10～20上样，使用体积浓度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3～5柱体积，收集合并活性化合物组分并在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏浓缩收集的层析组分，得浓缩产物一；
(3)步骤(2)中获得的浓缩产物一通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂B质量比1:10～20上样，使用体积浓度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3～5柱体积，收集合并含活性化合物组分并在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏，得浓缩产物二；
(4)步骤(3)中获得的浓缩产物二通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂C质量比1:10～20上样，使用体积20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3～5柱体积，收集合并含活性化合物组分并在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏获得纯物质。
所述步骤(2)中所述的层析树脂A为市售D101、LX-60非极性大孔树脂。
所述步骤(3)中所述的层析树脂B为市售MCI GEL CHP20P MCI系列精细层析树脂。
所述步骤(4)中所述的层析树脂C为市售十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)等非极性层析树脂。
步骤(2)～(4)中得到的洗脱液在收集合并含活性化合物组分前，使用硅胶薄层层析（TLC）进行组成成分检测，根据TLC结果合并组分，具体方法如下：
将斜面保藏的漆酶生产真菌挑取至CPDA斜面上，28℃静置培养3天。活化的菌丝体块（直径0.5cm左右）转接至9cm CPDA平皿中央，28℃倒置培养3天。取适量上述合并组分真空蒸干浓缩，挥尽有机溶剂，用无菌水溶解。无菌条件下在漆酶生产真菌菌丝体边缘等距离放置灭菌的牛津杯，于牛津杯中加入一定量上述合并组分的水溶液，28℃静置培养36h，在牛津杯处打孔，向孔内加入愈创木酚漆酶显色缓冲液，观察牛津杯与菌丝接触处或孔周围的颜色变化。阴性对照为水，阳性对照为Gongronella sp.的乙酸乙酯萃取物。根据平皿活性检测结果对上述合并的组分进行浓缩备用或保存于4℃。
活性化合物在诱导真菌漆酶合成方面的应用：
取活化的漆酶生产真菌菌丝体块7～8块（直径约0.5cm），接入装有100mL CPDA液体培养基的250mL三角瓶中，28℃,120rpm摇床培养。生长4天的漆酶生产菌用匀浆器6000rpm匀浆10秒备用。取匀浆后的5mL漆酶生产菌培养液接入CPDA液态摇瓶，28℃,120rpm摇床培养培养。4天后，加入终浓度为10μM的本发明活性诱导化合物继续培养，4～6天后，漆酶活力达到12000U/L，是不加本发明诱导活性化合物发酵漆酶活力1600U/L的7.5倍。
与现有的真菌漆酶诱导剂相比，本发明具有的优点为：（1）本发明诱导化合物来源于真菌次级代谢产物；2）本发明诱导化合物工作浓度低，有效工作浓度为10μM；（3）本发明诱导化合物具有高的真菌漆酶诱导活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但应该理解这些实施例并非限制本发明的范围。
一、含有本发明活性诱导化合物的发酵制备
1、Gongronella sp.菌株的活化
斜面保藏的Gongronella sp.W5挑取至CPDA斜面上，28℃静置培养3天以活化菌株。
2、培养基的配制及灭菌
配制发酵培养基（15g蔗糖，1.5g DL-天冬酰胺，0.5g MgSO4·7H2O，0.1gNa2HPO4·12H2O，0.01g CaCl2，0.01g FeSO4·7H2O，0.0275g腺嘌呤，50μg VB1），115℃灭菌20min备用
3、活性诱导化合物的发酵制备
挑取直径活化的4mm Gongronella sp.W5菌丝体5块，接种到灭菌的发酵培养基中，28℃，120rpm振荡培养4d，16层纱布过滤菌丝体，收集发酵液备用。
二、本发明活性诱导化合物的分离纯化
1、含有本发明诱导活性化合物的萃取
取500mL收集的Gongronella sp.W5发酵上清于1L梨形分液漏斗，加入乙酸乙酯250mL，充分振荡摇匀并注意避免乳化层，静置分层。收集上层有机相后，再向下层水相中继续加入125mL乙酸乙酯继续萃取，重复两次。合并3次的有机相，在旋转蒸发仪上40℃减压浓缩蒸干备用。
2、D101大孔树脂初分离本发明诱导活性化合物
精细D101大孔树脂材料用乙醇浸泡过夜，均匀地填充入规格为3.8cm×65cm的层析玻璃柱内，用乙醇洗柱至流出液清澈，再依次用2个柱体积的3.75%的盐酸-水溶液冲洗，超纯水冲洗至pH中性，2个柱体积5%的NaOH水溶液洗柱，超纯水冲洗至pH中性，最后用水平衡树脂柱，沉降过夜使气泡除尽。
按照化合物与树脂填料比例为1：10比例取（一）中制备的含有本发明诱导活性化合物若干，用极少量甲醇溶解，湿法上样。依次用体积浓度20%、40%···100%甲醇-水溶液冲柱，每个梯度洗脱3个柱体积。0.5mL/min定量收集，硅胶板点板检测各收集组分的物质组成，使用展层系统为氯仿：甲醇=9：1+冰醋酸，最后根据点板结果显示的物质组成合并洗脱组分，浓缩，点板检测。活性平板检测最后合并的组分，将含活性诱导物质的部分合并待进一步分离。
3、MCI精细树脂分离本发明诱导活性化合物
MCI柱材料用甲醇浸泡过夜，均匀地填充入规格为2.0cm×50cm的层析玻璃柱内，用甲醇洗柱至流出液清澈，再依次用1/2柱体积体积浓度为80%、60%、40%、20%甲醇-水溶液和2个体积的超纯水置换层析柱内的甲醇，沉降过夜使气泡除尽。
合并D101大孔树脂柱分离得到的含活性诱导物质的部分，蒸干浓缩，用极少量甲醇溶解，静态湿法上样。依次用体积浓度为20%、40%···100%甲醇-水溶液冲柱，每个梯度洗脱3个柱体积。0.5mL/min收集洗脱液，硅胶板点板检测各管中的物质组成，使用展层系统为氯仿：甲醇=9：1+冰醋酸，最后根据点板检测结果合并洗脱组分，浓缩，点板检测确定各合并物的有机成分组成。活性平板检测最后合并的组分，将含活性诱导物质的部分合并待进一步分离。
4、ODS精细树脂纯化本发明诱导活性化合物
ODS柱材料用甲醇浸泡过夜，均匀地填充入规格为1.0cm×10cm的层析玻璃柱内，用甲醇洗柱至流出液清澈，再依次用1个柱体积体积浓度为80%、60%、40%、20%甲醇-水溶液和2个体积的超纯水置换层析柱内的甲醇，并用加压泵排除柱内的气泡。
合并MCI柱分离得到的含活性诱导物质的部分，蒸干浓缩，用水-甲醇溶解，静态湿法上样。依次用20%、40%···100%甲醇冲柱，每个梯度冲3个柱体积，0.2mL/min收集洗脱液，硅胶板点板检测各管中的物质组成，使用展层系统为氯仿：甲醇=9：1+冰醋酸，最后根据点板结果分别合并含不同成分的洗脱液，浓缩，点板检测。活性平板检测最后合并的组分，将含活性诱导物质的部分合并获得纯化的本发明诱导活性化合物。
三、本发明活性诱导化合物在诱导真菌漆酶合成方面的应用
1、漆酶生产菌株Panus rudis的活化
斜面保藏的P.rudis挑取至CPDA斜面上，28℃静置培养3天以活化菌株。
2、种子瓶的制备
取活化的P.rudis菌丝体块7～8块（直径约0.5cm），接入装有100mL CPDA液体培养基的250mL三角瓶中，28℃,120rpm摇床培养。生长4天的P.rudis用匀浆器6000rpm匀浆10秒备用。
3、活性诱导化合物的漆酶发酵生产
取匀浆后的5mL漆酶生产菌培养液接入CPDA液态摇瓶，28℃,120rpm摇床培养培养。4天后，加入终浓度为10μM的本发明活性诱导化合物继续培养，4～6天后，漆酶活力达到12000U/L，是不加本发明诱导活性化合物发酵漆酶活力1600U/L的7.5倍。漆酶活力测定采用ABTS法：反应混合液包括950μL100mmol/L酒石酸钠缓冲液(pH4.0),30μL15mmol/LABTS和20μL适当稀释的酶液，混合均匀后在30℃下水浴3min后，于420nm下测定吸光值。酶活单位定义为：在上述条件下，每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为一个酶活力单位。
酶活计算公式：E(U/L)=OD420×555.56。

Claims (7)

1.一种对真菌漆酶具有高诱导活性的化合物的发酵制备方法，其特征在于：使用的发酵菌株为Gongronella sp.，经发酵培养获得发酵液，所述发酵液经分离纯化后获得如下分子式的纯活性化合物：
Figure FDA0000474726040000011
2.根据权利要求1所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于：所述发酵培养是指将Gongronella sp.接种在经灭菌的pH4.0～7.0的发酵培养基中，于温度25～31℃、摇床转速100～150rpm条件下培养3～7天后通过纱布过滤收集发酵液备用；所述的发酵培养基为每升水中含10～20g蔗糖、1～2g DL-天冬酰胺、0.7～1.5g KH2PO4、0.2～0.6g MgSO4·7H2O、0.02～0.15gNa2PO4·7H2O、0.01～0.05g CaCl2、0.01～0.05g FeSO4·7H2O、0.01～0.04g腺嘌呤、20～60μg VB1。
3.根据权利要求2所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基为每升水中含15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1gNa2PO4·7H2O、0.01g CaCl2、0.01g FeSO4·7H2O、0.0275g腺嘌呤、50μg VB1。
4.根据权利要求2所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，所述分离纯化依次包括以下步骤：
(1)制备的发酵液通过萃取剂体积比1:1萃取，萃取液在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏，去除萃取剂，得到活性化合物粗制品；所述萃取剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚中的任意一种；
(2)将粗制品通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂A质量比1:10～20上样，使用体积浓度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3～5柱体积，收集合并活性化合物组分并在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏浓缩收集的层析组分，得浓缩产物一；
(3)步骤(2)中获得的浓缩产物一通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂B质量比1:10～20上样，使用体积浓度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3～5柱体积，收集合并含活性化合物组分并在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏，得浓缩产物二；
(4)步骤(3)中获得的浓缩产物二通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂C质量比1:10～20上样，使用体积20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3～5柱体积，收集合并含活性化合物组分并在100～2000Pa，30～55℃的条件下减压蒸馏获得纯物质。
5.根据权利要求4所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的层析树脂A为市售D101、LX-60非极性大孔树脂。
6.根据权利要求4所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的层析树脂B为市售MCI GEL CHP20P MCI系列精细层析树脂。
7.根据权利要求4所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的层析树脂C为市售十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)非极性层析树脂。
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