CN102618512B - 一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，包括如下步骤：(1)将香菇菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；(2)将种子液按5～15％体积比接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养1～5天，加入扩张蛋白溶液，然后继续培养4～8天，分离，取上清液，得到发酵液；(3)从发酵液中提取漆酶。本发明将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于香菇漆酶的液体发酵生产，大幅度提高了香菇漆酶的液体发酵产量，相比传统发酵生产方法提高了32倍以上，具有极好的工业化应用前景。

Description

一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法
技术领域
本发明涉及一种利用香菇液体发酵生产工业用酶制剂漆酶的方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术
漆酶(Laccase，P-diphenol oxidase，EC 1.10.3.2)是一类结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中，其中以担子菌中的白腐菌中分布最为广泛。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物是水，是一种环保型酵素。由于环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶国内外研究较热。真菌漆酶一般含有4个铜离子，其氧化还原电位比昆虫和植物漆酶高，可以氧化多种酚类、芳胺类、羧酸类、甾体激素与生物色素、金属有机化合物和一些非酚类底物，在废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、免疫检测等诸多现代工业领域里都能广泛应用。香菇(Lentinula edodes)又名香蕈，属担子菌纲，伞菌目，蘑菇科，皮裥属，学名香皮裥菌，在我国已有悠久的生产栽培历史。我国是全球最大的香菇生产国，目前在我国70％以上的省份均有栽培香菇，因此香菇具有价格低、产地多、易于培养的特点。香菇作为一种白腐真菌已被证明可以产生漆酶，而且其中包括多种同工酶，合称为总漆酶，且其酶的氧化还原活力比昆虫漆酶、植物漆酶都要高出很多。相比直接从香菇子实体中提取，低成本、高效的液体发酵技术是目前工业化发酵生产的发展方向，然而当前相关香菇发酵生产漆酶的研究很少，而且与香菇其它活性成分的发酵提取生产相比，其漆酶的产量仍然偏低，同时酶活性受到培养条件和基质成分等诸多因素的制约。已有报道利用芳香类化合物或重金属离子诱导提高产量，但是这些诱导物一般都具有毒性，且难于降解，添加后使发酵液处理成本增高，还易造成环境污染。利用液体静置培养或固态发酵技术能够缓解漆酶生产的环境污染问题，但发酵周期太长，不适合工业化发酵生产应用。
如中国专利文献CN1463578A(申请号02124094)，公开了一种香菇液体菌种的深层发酵培养方法及其培养基涉及菌种深层发酵培养方法及其培养基。该培养方法包括(1)将母种在母种培养基内进行培养；(2)将在母种培养基内培养长满试管的菌丝移种到木屑原种培养基内进行过渡培养，培养条件为：温度22～27±1℃，暗培养12～20天，待菌丝长满，(3)将木屑菌种充分打碎后立即移种到液体培养基中进行一级摇瓶的培养扩增；(4)将一级摇瓶内生长5～7天的菌液移入盛有新鲜液体培养基的二级摇瓶中进行扩增；(5)将二级摇瓶出来的菌液进行发酵处理即可得到成品香菇液体菌种。其它一些利用漆酶基因的异源表达的产量往往也低于野生菌。因此，这些都限制了目前漆酶的工业化生产应用，急需开发一种新的能够提高漆酶产率、降低生产成本的制备方法和生产工艺以满足现代工业化的需要。
近年来在植物细胞壁中发现一类称为扩张蛋白的新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白在植物形态建成(Fleming et al.，1999)、果实成熟(Cosgrove，2000)、根毛发生(Cho and Cosgrove，2002)、细胞扩张(Cosgrove，1998)、渗透调节(Wu and Cosgrove，2000)和禾本科植物花粉管生长(Cosgrove，1997)等诸多方面均起着极为重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验证明这种植物细胞壁蛋白有使热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，推测其能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而调节酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，可能在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸等调控作用。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于香菇的液体发酵进行漆酶等次生代谢产物的生产国内外目前均未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法。
本发明技术方案如下：
一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，包括如下步骤：
(1)将香菇菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按5～15％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25～30℃的条件下，液体发酵培养1～5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.0～3.0mg/mL，然后继续培养4～8天，分离，取上清液，得到发酵液；
(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取漆酶。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PD液体发酵培养基，每升组分如下：
去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养条件为：摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间3～6天。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下：
玉米粉100g，麸皮100g，蔗糖20g，白糖10g，蛋白胨2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，水定容至1000ml，pH 5.0～7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为1.5～3.0mg/mL；进一步优选2.0～3.0mg/mL。最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为2.5mg/mL。
所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备，如采用McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove D J.Two endogenous proteins that induce cellwall extension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％HgCl2消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置25～30h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/L Na2S2O5，2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1wt％Triton X-100，pH 7.0；所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1.5mmol/LNa2S2O5，0.5mol/L NaCl，pH 6.0；所述酸性缓冲液配制是：将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离是将发酵液经4～6层纱布过滤，4℃、8000r/min离心15min。
所述步骤(3)中，从发酵液中提取漆酶的步骤如下：
向步骤(2)制得的发酵液中0～4℃下按0.3～0.5g/mL的添加量向发酵液中缓慢添加研磨后的(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，4℃沉淀6～8h，于4℃10000rpm离心20min，弃上清液，将沉淀溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；4℃用截留分子量为10～20kDa的透析袋透析，然后4℃条件下用截留分子量为10～20kDa的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得香菇漆酶酶液。
所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是：将0.69g磷酸二氢钠、0.012g柠檬酸溶于蒸馏水中，定容至1L，pH 8.0。
本发明同现有技术相比有如下优点：
1.本发明将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于香菇漆酶的液体发酵生产，大幅度提高了香菇漆酶的液体发酵产量，使产量达到17.41U/mL，相比传统发酵生产方法提高了3.2倍以上，具有极好的工业化应用前景。
2.本发明所采用的香菇液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产。本方法也适用于其它普通香菇栽培品种
3.本发明所述的植物扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物等多种物种中提取，来源相当广泛，成本较低，制备方法也相对简单，重复性好，可工业化规模提取。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。
原料及培养基
实施例中所述的发酵菌种为香菇(Lentinus edodes)，菌种编号为XDJ-1，购自济南先道生物科技有限公司。
实施例中所述截留分子量为10～20kDa的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋，购自北京博润莱特科技有限公司，截留分子量为10～20kDa的聚偏氟乙烯(PVDF)透析膜，购自济南盛伟生物科技有限公司。
实施例中所述牛血清蛋白标准液、考马斯亮蓝、愈创木酚均购自济南盛伟科技有限公司，其它试剂均为常规市售产品。
实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下：
将大豆(Glycine max L.Merr.CV.M40；购自济南伟丽种业有限公司)或黄瓜(Cucumissativus L.CV.Jinnian No.6；购自济南伟丽种业有限公司)种子经0.1wt％HgCl2消毒5min，流水冲洗6h，然后，栽入湿蛭石中，27℃暗培养5d。剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，即生长区约100g，置-20℃冰箱预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用70μm尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置2h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取48h，过滤，滤液按0.4g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置28h，4℃条件下25000g离心10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃条件下用截留分子量为3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(购自北京博润莱特科技有限公司)透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液，置4℃下保存。其他未描述步骤可参照McQueen-Mason等在McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove DJ.Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants.Plant Cell，1992，4：1425～1433中的描述进行。
上述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L HERES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1.5mmol/LNa2S2O5，2mmol/L EDTA，0.1wt％Triton X-100，pH 7.0；
上述提取液组分为：15mmol/LHERES，1.0mmol/LEDTA，1.5mmol/LNa2S2O5，0.5mol/L NaCl，pH 6.0；
所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：
将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。
扩张蛋白溶液浓度的测定方法采用考马斯亮蓝法检测，具体可参照(《精编蛋白质科学实验指南》，ISBN：703018086，出版日期1900-1-1)中记载的考马斯亮蓝法进行操作，以牛血清白蛋白作标准曲线，经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为0.31g/ml。
实施例中所述的PD液体发酵培养基，每升组分如下：
去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。
实施例中所述的液体发酵培养基，每升组分如下：
玉米粉100g，麸皮100g，蔗糖20g，白糖10g，蛋白胨2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，水定容至1000ml，pH 5.0～7.0。
所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是：将0.69g磷酸二氢钠、0.012g柠檬酸溶于蒸馏水中，定容至1L，pH 8.0。
琥珀酸钠缓冲液配制方法是：称取NaOH 1.0g和琥珀酸5.9g，溶于800mL蒸馏水中，用1.0mM的NaOH溶液调pH 4.5，蒸馏水定容至1000mL。
实施例1：
一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，包括如下步骤：
(1)将香菇(Lentinus edodes)菌种，菌种编号为XDJ-1，接种到PD液体发酵培养基中，摇床转速150r/min，温度28℃，时间3天，进行活化培养，得种子液；
(2)将步骤(1)制得种子液按10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25℃的条件下，液体发酵培养1天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.5mg/mL，然后继续培养8天，经5层纱布过滤，4℃、8000r/min离心15min，取上清液，得到发酵液；
(3)向步骤(2)制得的发酵液中4℃下按0.4g/mL的添加量向发酵液中缓慢添加研磨后的(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，进行4℃沉淀8h，于4℃10000rpm离心20min，弃上清液，将沉淀溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；4℃用截留分子量为10～20kDa的透析袋透析，然后4℃条件下用截留分子量为10～20kDa的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得香菇漆酶酶液。
漆酶待测样品的制备
取由1L发酵液制得的漆酶，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至50mL，制得漆酶待测样品。
漆酶的含量测定
(2)标准曲线的建立
采用本领域常规的BCA法，具体参见(《蛋白质技术手册》，ISBN：7-03-008329-6，出版日期：2000)
(1)标准曲线建立
将牛血清蛋白标准液(0.5g/L)0.0mL，0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，依次加入0.15mol/L NaCl溶液1.0mL，0.9mL，0.8mL，0.7mL，0.6mL，0.5mL，0.4mL，再在每支管中加入5mL的0.01％(W/V)考马斯亮蓝。465nm进行测定OD值，绘制标准曲线。
(1)漆酶的产量测定
取制得的制得的漆酶待测样品10μL试管中，用0.15mol/L NaCl溶液定容至1.0mL，摇匀。空白对照为1.0mL 0.15mol/L NaCl溶液。再加入5mL加入0.01wt％(W/V)考马斯亮蓝。465nm进行测定OD值。根据标准曲线计算蛋白含量测得蛋白含量为0.234g/L，得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为0.234×100/20＝1.17g。
(2)漆酶的活力测定
采用本领域常规的愈创木酚法测定(具体参照：张玉荣等影响愈创木酚法测定玉米过氧化物酶活力的因素，粮食工程.2008：4～7)发酵液漆酶总酶活：
将1mL琥珀酸钠缓冲液，1mL 4mM愈创木酚和0.5mL漆酶待测样品混合，制得2.5mL反应混合液，然后30℃反应30min后，用紫外可见分光光度计于465nm处测定吸光值，用0.5ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替代漆酶待测样品与1mL琥珀酸钠缓冲液和1mL 4mM愈创木酚混合做对照。
所述酶活力单位定义：每分钟使OD465值改变0.01为一个酶活单位(U)。
经检测，漆酶待测样品总酶活为85.1U。得到每毫升粗漆酶发酵液总酶活为85.1×2/20＝8.51U。(测得值×2得1ml酶活的活力，再除以发酵液浓缩的倍数)，具体结果如表1所示。
实施例2：
如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，在温度25℃的条件下，液体发酵培养3天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2.0mg/mL，然后继续培养6天。
经检测计算，465nm比色法测定得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为1.52g，每毫升发酵液粗漆酶总酶活10.33U。具体结果如表1所示。
实施例3
如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，在温度25℃的条件下，液体发酵培养5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2.5mg/mL，然后继续培养4天。
经检测计算，465nm比色法测定得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为2.82g，每毫升发酵液粗漆酶总酶活17.41U。具体结果如表1所示。
对比例1：
如实施例1所述的方法，不同之处在于，步骤(2)中，将步骤(1)制得种子液按10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25℃的条件下，液体发酵培养9天，过滤得发酵液。
经检测计算，465nm比色法测定得到漆酶发酵液每升粗漆酶总蛋白含量为0.71g，每毫升发酵液粗漆酶总酶活4.07U。具体结果如表1所示。
表1.不同实施例的香菇漆酶产量比较
Figure BDA0000153621080000061

Claims (2)

1.一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将香菇菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；
（2）将步骤（1）制得的种子液按5~15 %体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25～30 ℃的条件下，液体发酵培养1～5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.0～3.0 mg/mL，然后继续培养4～8天，分离，取上清液，得到发酵液；
（3）从步骤（2）制得的发酵液中提取漆酶；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
玉米粉100 g，麸皮100 g，蔗糖20 g，白糖10 g，蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KH2PO4 0.5 g，水定容至1000 ml，pH 5.0～7.0；
所述步骤（2）中的扩张蛋白溶液按照如下方法制备：
将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15 wt% HgCl2消毒4～6 min，流水冲洗5～7 h，然后，25～28 ℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4 cm，置-20 ℃预冷0.5 h，加预冷至4 ℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70 μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3 h，得静置液；向静置液中加入提取液，4 ℃下提取44～50 h，过滤，按0.3～0.5 g/ mL的添加量向滤液中缓慢添加（NH4）2SO4，添加（NH4）2SO4过程中不断搅拌，防止（NH4）2SO4局部过饱和，然后静置25～30 h，4 ℃条件下25000 g离心5～10 min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4 ℃下分子量3000 Da的透析袋透析，透析液经20000 g离心10 min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速100～180 r/min，温度25～30℃，时间3～6天。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，扩张蛋白的浓度为1.5～3.0 mg/mL。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，扩张蛋白的浓度为2.0～3.0 mg/mL。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，扩张蛋白的浓度为2.5 mg/mL。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为：25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol/L Na2S2O5，2 mmol/L 乙二胺四乙酸，0.1 wt% Triton X-100，pH 7.0；所述提取液组分为：15 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸，1.5 mmol/L Na2S2O5，0.5 mol/L NaCl，pH 6.0；所述酸性缓冲液配制是：将2.05 g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1 L。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的分离是将发酵液经4～6层纱布过滤，4 ℃、8000 r/min离心15 min。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，从发酵液中提取漆酶的步骤如下：
向步骤（2）制得的发酵液中0～4 ℃下按0.3～0.5 g/ mL的添加量向发酵液中缓慢添加研磨后的（NH4）2SO4，4 ℃沉淀6～8 h，于4 ℃ 10000 rpm离心20 min，弃上清液，将沉淀溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；4 ℃用截留分子量为10～20 kDa的透析袋透析，然后4 ℃条件下用截留分子量为10～20 kDa的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得香菇漆酶酶液。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是：将0.69 g磷酸二氢钠、0.012 g柠檬酸溶于蒸馏水中，定容至1 L，pH 8.0。
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