CN103026902B - 一种紫芝担孢子萌发的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫芝担孢子萌发的方法。本发明选择菌盖带有白边刚开始弹射孢子的紫芝子实体来收集担孢子，通过子实体活体套袋收集担孢子，将孢子涂布于萌发培养基（配方为：麦芽汁200ml，灵芝提取液100ml，琼脂20g，水700ml，121℃灭菌30min）中，获得了紫芝单核菌株。

Description

一种紫芝担孢子萌发的方法

技术领域    

本发明涉及一种紫芝担孢子萌发的方法。

背景技术   

紫芝，学名为 Ganoderma sinense (Zhao,Xu et )Zhang，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属。紫芝也称“中国灵芝”， 野生主要分布在两广、福建和台湾等地区。子实体木栓质，多呈半圆形至肾形，少数近圆形，大型个体长宽可达20cm，一般个体4.7×4cm，小型个体2×1.4cm，表面紫黑色，具漆样光泽，菌肉锈褐色。菌管管口与菌肉同色，管口圆形，每毫米5个。菌柄侧生，长可达15cm，直径约2cm，黑色，有光泽。担孢子顶端呈脐突形，或稍平截，双层壁，外壁透明内壁平滑，内壁呈淡褐色有明显小刺。扫描电镜下观察孢子表面有纵向的沟脊，脊上侧边可见整齐的孔洞结构，成熟孢子大小约为10-12.5 × 7-8.5μm。紫芝作为一种传统药用菌被《中华人民共和国药典》所收录，其含有多种化学成分，主要为多糖，生物碱，甾醇，有机酸及三萜类化合物。紫芝气味甘、性温、无毒，具有治耳聋、利关节、保神、益精气、久服轻身不老延年的功效。

随着紫芝的保健功效不断为人所知，紫芝需求量不断加大。对与紫芝的种植栽培要求不断提高，然而紫芝生产周期长，产量低，给紫芝的生产栽培带来很大的困难。另外由于紫芝抗病虫害能力弱，导致紫芝农药残留现象时有发生，严重制约了紫芝产业的健康发展。因此选育生产周期短，高产，抗病虫害的紫芝菌株势在必行。现代蕈菌育种主要方式主要有一下几种：野生驯化、诱变育种、原生质体融合育种和杂交育种等。野生驯化，主要从野外采集经过组织分离而来，由于没有发生遗传变异所以不能获得新的种性。诱变育种和原生质体融合不仅需要筛选众多的变异体和融合体，而且由于遗传稳定性较差，并未得到广泛的应用。杂交育种是一种有效的品种改良技术，并在香菇、双孢蘑菇和金针菇等得到广泛的应用。其主要流程为：（1）亲本选择；（2）亲本单核菌株的获得；（3）单核菌株配对杂交；（4）杂合子鉴定；（5）杂合子筛选，小试、大试和推广。研究表明紫芝担孢子为双层细胞壁，同紫芝一样担孢子不易萌发,也未见有关紫芝担孢子萌发的研究。

紫芝担孢子为双层细胞壁，同紫芝一样担孢子不易萌发, 无法进行担孢杂交育种，目前生产上使用的紫芝品种主要是通过野生菌株驯化而来。本方法解决了紫芝担孢子萌发难的问题，在紫芝杂交育种上具有重大意义。

发明内容  

 本发明的目的是提供一种紫芝担孢子萌发的方法，解决紫芝担孢子不易萌发的难题，为紫芝的杂交育种打下基础。

本发明的一种紫芝担孢子萌发的方法，包括以下步骤：

（1）紫芝担孢子收集

用于萌发的紫芝担孢子应选择孢子释放周期前10天释放的，即待紫芝菌盖分化形成，菌盖未完全呈紫色、 边缘0.3-0.8cm呈白色生长圈时收集担孢子；

采用套袋收集的方法，套袋时选用灭菌的信封内垫一张无菌的硫酸纸，用信封将紫芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，再用封条将信封固定在菌盖上；担孢子收集期间控制环境相对湿度80%-90%，温度24℃-28℃，套袋收集的时间为20h-24h；

（3）紫芝担孢子保存

收集的紫芝担孢子放在灭菌的信封内，控制环境温度18℃-28℃、相对湿度50%-75%，或放置在4℃冰箱，但放置时间不超过24h；

（4） 担孢子萌发处理

取收集的紫芝担孢子，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有15-30个孢子即可涂布紫芝担孢子萌发培养基，然后在25℃-27℃生化培养箱中黑暗培养，至担孢子萌发；使用的紫芝担孢子萌发培养基为麦芽灵芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，灵芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min；

所述麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水定容至1L；

所述灵芝提取液：取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水定容至1L。

本发明选择菌盖带有白边刚开始弹射孢子的紫芝子实体来收集担孢子，通过子实体活体套袋收集担孢子，将孢子涂布于萌发培养基中，获得了紫芝单核菌株。解决了实验室条件下紫芝成熟担孢子不易萌发，难以进行紫芝杂交育种的难题。

    本发明简单易行无需用到特殊的药品及仪器设备，普通实验室即可通过本方法获得所需的单核菌株用于杂交育种或紫芝的遗传分析。担孢子是担子菌减数分裂的产物，存在广泛的遗传变异。由担孢子萌发所获得的单核菌株具有遗传多样性的特点，单核菌株杂交后，有利于获得超亲性状，解决了紫芝不能单孢杂交的问题。

附图说明

图1为紫芝担孢在培养基中萌发形态。

具体实施例

本发明的一种赤芝担孢子萌发的方法，包括以下步骤：

1. 紫芝担孢子收集时期选择

用于萌发的紫芝担孢子应选择孢子释放周期前10天释放的，即待紫芝菌盖分化形成，菌盖未完全呈紫色、 边缘0.3-0.8cm呈白色生长圈时收集担孢子；

2. 紫芝担孢子收集方法 

采用套袋收集的方法，套袋材料选用透气性、透光性好的信封，套袋时选用灭菌信封内垫一张无菌的硫酸纸，用信封将紫芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，再用封条将信封固定在菌盖上；担孢子收集期间控制环境相对湿度80%-90%，温度24℃-28℃，套袋收集的时间为20h-24h。

3. 紫芝担孢子保存

收集的紫芝担孢子放在无菌的信封内，控制环境温度18℃-28℃、相对湿度50%-75%，或放置在4℃冰箱；但放置时间不超过24h 。

4. 担孢子萌发处理

取收集的紫芝担孢子，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有15-30个孢子即可涂布紫芝担孢子萌发培养基，然后在25℃-27℃生化培养箱中黑暗培养，至担孢子萌发；使用的紫芝担孢子萌发培养基为麦芽灵芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，灵芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min；

所述麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水定容至1L；

所述灵芝提取液：取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水定容至1L。

为了充分公开本发明的赤芝担孢子萌发的方法，以下结合实施例加以说明。

实施例1：一种紫芝担孢子萌发的方法

选择福建紫芝栽培品种紫芝S2作为亲本，在PDA斜面进行活化，长满斜面后转接到木屑菌袋中。具体种植方法参见文献：钟礼义，邱福平，陈体强．阔叶树边材栽培紫芝示范试验[J]．食用菌，2005，1：26-27。

2. 担孢子采集时期选择

紫芝孢子释放周期大约30天，用于萌发的担孢子应选择前10天释放的。即待紫芝菌盖分化形成，选择选取朵型完整，长势健壮，菌管发育正常，子实体生长至3-5cm、菌盖边缘0.3-0.6cm呈白色生长圈时收集担孢子。

3. 紫芝担孢子收集方法

用无菌的信封和硫酸纸采用紫芝活子实体套袋法收集孢子，将无菌的硫酸纸光面向上放入信封，再用信封将紫芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，用封条将信封固定在菌盖上。孢子收集期间控制空间相对湿度85%-90%，温度25℃-27℃，套袋收集的时间22h便可在硫酸纸收集到赤芝担孢子。收集时间过短则收集的孢子量少，若时间过长收集的担孢子则不易萌发或不萌发。

4. 紫芝担孢子保存

将收集的紫芝担孢子装入无菌的信封内，于室温下、相对湿度60%放置2h后进行涂单孢。

5. 担孢子萌发处理

取收集保存2h的紫芝孢子印，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有10-20个孢子即可涂布平板，涂好的平板在28℃生化培养箱中黑暗培养54h，可观察到萌发的紫芝担孢子，见图1。使用的紫芝担孢子萌发的平板培养基为麦芽灵芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，紫芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min；

麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水定容至1L；

紫芝提取液：取150-250g切碎的干紫芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水定容至1L。

采用PDA培养基（配方：200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、pH自然加水至1000mL）或水琼脂培养基（配方：琼脂 20g，水1000ml），紫芝担孢子均不萌发，本发明经麦芽灵芝培养基萌发处理54h后孢子萌发率为0.91%。

6．单核菌株获得及检测：选取观察到有担孢子萌发的平板，在100倍显微镜下观察寻找萌发出芽管的担孢子，用接种针无菌条件下连同培养基挑出萌发的担孢子于斜面培养基中培养。当菌落长到1cm左右时即可在显微镜下镜检观察是否有锁状联合，无锁状联合即为单核菌株。通过镜检纯化后，共获得了31根紫芝单核菌株。

7. 单孢菌株交配型测定

以紫芝S2的一个单孢菌株记为T₁，作为交配型测定的基准菌株，其交配型定为A_xB_x。将余下30根紫芝S2单核菌株与T₁在PDA培养基上进行配对，待两个单孢菌株的菌丝接触3d后，观察锁状联合，出现锁状联合的表示与T₁发生亲和反应，选出能与T₁发生亲和反应的单孢菌株，将其定为测交菌株T₂，其交配型定为A_yB_y。

将所有不与T₁亲和的单孢分离菌株与T₂交配，能与T₂发生亲和反应的单孢分离菌株的交配型则为A_xB_x。

将既不与T₁发生亲和，又不与T₂发生亲和的某一单孢菌株定为测交菌株T₃，其交配型定为A_xB_y。将既不与T₁发生亲和，又不与T₂发生亲和的所有其他单孢菌株均与T₃交配，交配中发生亲和的菌株的交配型为A_yB_x，而不亲和的菌株交配型为A_xB_y。

通过三轮交配反应，可知31根紫芝S2单核菌株的交配型，交配型为A_xB_x有11个单孢菌株，交配型为A_yB_y有7个单孢菌株，交配型为A_xB_y有8个单孢菌株，交配型为A_yB_x有5个单孢菌株。获得四种交配的单孢菌株。

担孢子是减数分裂的产物，存在广泛的变异，紫芝单孢菌株的获得为紫芝的杂交育种提供了育种材料，同时也为紫芝的遗传学分析打下基础。

Claims (1)

1.一种紫芝担孢子萌发的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）紫芝担孢子收集

用于萌发的紫芝担孢子应选择孢子释放周期前10天释放的，即待紫芝菌盖分化形成，菌盖未完全呈紫色、 边缘0.3-0.8cm呈白色生长圈时收集担孢子；

采用套袋收集的方法，套袋时选用灭菌的信封内垫一张无菌的硫酸纸，用信封将紫芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，再用封条将信封固定在菌盖上；担孢子收集期间控制环境相对湿度80%-90%，温度24℃-28℃，套袋收集的时间为20h-24h；

（2）紫芝担孢子保存

收集的紫芝担孢子放在灭菌的信封内，控制环境温度18℃-28℃、相对湿度50%-75%，或放置在4℃冰箱，但放置时间不超过24h；

（3） 担孢子萌发处理

取收集的紫芝担孢子，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有15-30个孢子即可涂布紫芝担孢子萌发培养基，然后在25℃-27℃生化培养箱中黑暗培养，至担孢子萌发；使用的紫芝担孢子萌发培养基为麦芽灵芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，灵芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min；

所述麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水定容至1L；

所述灵芝提取液：取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水定容至1L。