CN106754624A - 一种灵芝担孢子萌发的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝担孢子萌发培养基，以及应用该担孢子萌发培养基进行灵芝担孢子萌发的方法。该灵芝担孢子萌发培养基是由灵芝煮出液，PDA粉末和水组成的，该灵芝担孢子萌发方法使灵芝担孢子的萌发率在10％以上，甚至高达20％，从而获得灵芝孢子单核菌株。本发明的灵芝担孢子萌发方法解决了在实验室条件下灵芝担孢子萌发率极低的难题，从而为灵芝的单孢杂交育种打下基础。

Description

一种灵芝担孢子萌发的方法

技术领域

本发明涉及食用菌育种领域，具体的说涉及一种灵芝担孢子萌发的方法。

背景技术

灵芝[Ganoderma lucidum(Curtis)P.Karst.]隶属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、灵芝属。《神农本草经》和《本草纲目》将其列为上品，有“益心气，补中，增智慧，不忘”、“久服轻身不老，延年神仙”，在民间有悠久的应用历史。现代药理学研究也表明灵芝具有多种功效：1.抗肿瘤作用；2.免疫调节作用；3.抗放射作用；4.对神经系统作用；5.对心血管作用；6.对呼吸系统的作用；7.对消化系统的作用。灵芝的交配型为四极性异宗结合，即两个不同的细胞核共存于一个细胞的菌丝才能进行生殖生长而形成子实体。目前，灵芝常用的育种手段主要有杂交、原生质体融合以及诱变等。近来的研究表明目前生产上使用的灵芝菌株间的遗传多样性不高，而以此为亲本材料通过杂交或诱变或原生质体融合等手段获得的杂交菌株或诱变菌株或融合菌株中出现超亲现象的概率很低，因而严重影响了育种效率的提高和高产优质灵芝新品种的获得。而灵芝品种作为灵芝产业的源头和重要要素，在很大程度上影响着灵芝产业的发展。

灵芝担孢子是灵芝生长发育后期通过减数分裂产生的单核生殖细胞，因而具有丰富的遗传多样性，从而为灵芝新品种的选育提供了绝好的材料。但是没有萌发的灵芝担孢子是无法生成初级菌丝的，因而无法通过杂交、原生质体融合或诱变等手段进行灵芝品种选育。灵芝孢子具有两层壁，十分坚韧，一般的化学、物理方法很难将其打破；在自然界中非常难以萌发，在实验室条件下萌发率也极低。从而限制了灵芝的新品种选育。

虽然利用原生质体单核化技术可以解决因灵芝担孢子萌发率极低，单核菌株不易获得而出现的难题，但通过原生质体单核化技术获得的单核菌株，因没有发生减数分裂，造成获得的单核菌株的遗传多样性不丰富。因此通过原生质体单核化技术难以获得广泛变异的新菌株。

为了解决灵芝育种尤其是实验室育种的问题，需要开发一种新的担孢子萌发的方法。

发明内容

本发明首先提到了一种灵芝担孢子萌发培养基，该培养基由如下组分组成：

灵芝煮出液，PDA粉末和水；

其中灵芝煮出液、PDA粉末和水的比例为：300～400mL：39g：600～700mL；

其中所述的灵芝煮出液是通过如下方法制备得到的：

将灵芝子实体加入水中，电磁炉800～1600w加热15～20min，过滤，取滤液即可。

具体的灵芝煮出液是通过如下方法制备得到的：

取灵芝子实体15～20g，加入300～400mL蒸馏水，电磁炉800～1600w加热10～15min，过滤，取滤液，并加水定容至300～400mL，得到灵芝煮出液。

本发明还提供了应用上述灵芝担孢子萌发培养基进行灵芝担孢子萌发的方法，该方法为：

取灵芝担孢子，用水稀释，形成担孢子悬浮液，使担孢子的浓度为×10³个/mL；

吸取担孢子悬浮液均匀涂布于上述灵芝担孢子萌发培养基上；

于25～28℃避光培养至担孢子萌发。

本发明还提供了一种灵芝担孢子收集与萌发的方法，该方法包括如下步骤：

⑴适合担孢子收集的灵芝子实体选择

选取生长发育良好、菌盖美观且正在喷射灵芝担孢子的灵芝子实体(正生长于菌棒上)；

⑵担孢子收集

担孢子收集采用套筒方式，用两头开口的保鲜袋套住灵芝子实体，再用一端封闭的无纺布圆筒套在外部；

担孢子收集期间的环境温度维持在20～30℃；收集时间为3～5d，取灵芝菌盖上方的担孢子；

⑶担孢子保存

收集的灵芝担孢子存放于无菌的离心管中，并置于4～10℃，待用；

⑷担孢子萌发

取灵芝担孢子，用水稀释，形成担孢子悬浮液，使担孢子的浓度为×10³个/mL；

吸取担孢子悬浮液均匀涂布于上述灵芝担孢子萌发培养基上；

于25～28℃避光培养至担孢子萌发。

本发明所提供的将采用套筒方式收集的灵芝担孢子在灵芝担孢子萌发培养基上进行萌发，灵芝担孢子的萌发率在10％以上，甚至高达20％，从而获得灵芝孢子的单核菌株。本方法解决了在实验室条件下灵芝担孢子萌发率极低的难题，从而为未来的灵芝单孢杂交育种奠定了技术基础。

本发明的灵芝担孢子萌发方法简单、易行，无需用到特殊的仪器、设备和药品，普通的实验室即可通过本发明获得所需的灵芝担孢子菌株用于灵芝的杂交育种。通过孢子萌发获得的单核菌株(由担孢子萌发而成的单倍体的菌丝称为初级菌丝，也称为初生菌丝，是单核的；由任何一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体及其后代即为菌株)遗传多样性丰富，所以以此为材料进行杂交获得的后代的遗传性状稳定，且有利于获得新的遗传性状，克服了原生质体单核菌株杂交遗传变异小，诱变育种不稳定的缺陷，为灵芝的品种改良和新品种选育打下坚实的基础，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1灵芝担孢子在培养基上萌发。

具体实施例

下列实施例中所用灵芝子实体为“沪农灵芝1号”，来自上海市农业科学院食用菌研究所。

实施例1灵芝担孢子萌发培养基的配制

取灵芝子实体15g，加入300mL蒸馏水，800w加热15min，过滤，取滤液，并加蒸馏水定容至300mL，得到灵芝煮出液；

灵芝煮出液300mL，PDA粉末(购自BD公司)39g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌15min。

实施例2灵芝担孢子萌发培养基的配制

取灵芝子实体17g，加入400mL蒸馏水，1200w加热12min，过滤，取滤液，并加蒸馏水定容至400mL，得到灵芝煮出液；

灵芝煮出液400mL，PDA粉末(购自BD公司)39g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌15min。

实施例3灵芝担孢子萌发培养基的配制

取灵芝子实体20g，加入400mL蒸馏水，1600w加热10min，过滤，取滤液，并加蒸馏水定容至400mL，得到灵芝煮出液；

灵芝煮出液400mL，PDA粉末(购自BD公司)39g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌15min。

实施例4灵芝担孢子的收集和萌发

1.适合担孢子收集的子实体选择

选取生长发育良好、菌盖美观且正在喷射灵芝担孢子的灵芝子实体(正生长于菌棒上)，用蒸馏水进行清洗，确保子实体和菌棒清洁，用于收集灵芝担孢子。

2.担孢子收集

担孢子收集采用套筒方式，用两头开口的保鲜袋套住灵芝子实体，再用一端封闭的无纺布圆筒套在外部。

担孢子收集期间的环境温度维持在20～30℃；收集时间为3d，取灵芝菌盖上方的担孢子用于萌发。

3.担孢子保存

收集的灵芝担孢子存放于无菌的离心管中，并置于4～10℃，待用。

4.担孢子萌发

取极少量的灵芝担孢子，用无菌蒸馏水逐步稀释，形成担孢子悬浮液，确保担孢子的浓度为2×10³个/mL。吸取50μL担孢子悬浮液均匀涂布于实施例1中制备的灵芝担孢子萌发培养基上，然后于25～28℃避光培养至担孢子萌发。

5.初级菌丝体的获得及鉴定

用无菌的10μL小枪头在无菌条件下挑取担孢子萌发的菌落于PDA平板中央，同时在其边缘斜插一无菌盖玻片，25～28℃培养。当菌丝长至盖玻片上，即可在无菌条件下将其取出并置于显微镜下进行镜检，观察是否有锁状联合结构，无锁状联合结构的即为初级菌丝体。最终获得了“沪农灵芝1号”的担孢子萌发而成的单核菌株100株。涂布萌发培养基平板上的担孢子总数为1000个，所以根据下列灵芝担孢子萌发率的计算公式，

可以计算出本实施例中的灵芝担孢子萌发率为10％。

灵芝担孢子的萌发率(％)＝(平板上挑取的单菌落总数/涂布于平板上的担孢子总数)*100％

6.灵芝孢子单核菌株交配型测定

灵芝为典型的四极性异宗结合真菌，因而理论上其后代应具有4种交配型。因此通过交配型测定，了解“沪农灵芝1号”担孢子交配型与理论上的交配类型是否一致；同时还可以通过交配型测定，明确这些灵芝孢子萌发的单核菌株的交配型，为后续的灵芝单孢杂交育种奠定基础，提高育种的效率。

以“沪农灵芝1号”一个孢子单核菌株1的交配型记为A₁B₁，作为交配型测定的基准菌株，将余下99株孢子单核菌株分别与菌株1接种在PDA平板上进行对峙培养，待两个孢子单核菌株的菌丝接触2～3d后，取交界处的菌块于新的PDA平板上，并在菌块边缘斜插一无菌盖玻片，25～28℃培养。待菌丝延伸至盖玻片上，取出该盖玻片于显微镜下观察菌丝有无锁状联合结构，出现锁状联合结构则表示待测试菌株与菌株1发生性亲和反应，所有与菌株1发生性亲和反应的单核菌株的交配型则判定为A₂B₂。选出交配型为A₂B₂的单核菌株中的1株，将其定为测交菌株C₁。

将所有不与单核菌株1发生性亲和反应的孢子单核菌株与菌株C₁对峙培养，能与菌株C₁发生性亲和反应的孢子单核菌株的交配型则判定为A₁B₁。

将与菌株1和菌株C₁均不发生性亲和反应，但与菌株1形成假锁状联合结构(具有假锁状联合结构的菌株是不能进行生殖生长而形成子实体的)的某个单核菌株定为测交菌株D₁，其交配型则判定为A₂B₁。将与菌株1和菌株C₁均不发生亲和反应的所有其他单核菌株分别与菌株D₁对峙培养，与菌株D₁发生性亲和反应，形成锁状联合结构的菌株的交配型则判定为A₁B₂；与菌株D₁不发生亲和反应的菌株的交配型即为A₂B₁。

通过上述三轮交配型测试，可知100株“沪农灵芝1号”单核菌株的交配型共有4种。交配型为A₁B₁的有27株孢子单核菌株，交配型为A₂B₂的有31株孢子单核菌株，交配型为A₁B₂的有20株孢子单核菌株，交配型为A₂B₁的有22株。

实施例5灵芝担孢子的收集和萌发

1.适合担孢子收集的子实体选择

选取生长发育良好、菌盖美观且正在喷射灵芝担孢子的“沪农灵芝1号”灵芝子实体(正生长于菌棒上)，用蒸馏水进行清洗，确保子实体和菌棒清洁，用于收集灵芝担孢子。

2.担孢子收集

担孢子收集采用套筒方式，用两头开口的保鲜袋套住灵芝子实体，再用一端封闭的无纺布圆筒套在外部。

担孢子收集期间的环境温度维持在22～28℃；收集时间为3d，取灵芝菌盖上方的担孢子用于萌发。

3.担孢子保存

收集的灵芝担孢子存放于无菌的离心管中，并置于4～6℃，待用。

4.担孢子萌发

取极少量的灵芝担孢子，用无菌蒸馏水逐步稀释，形成担孢子悬浮液，确保担孢子的浓度为1.3×10³个/mL。吸取80μL担孢子悬浮液均匀涂布于实施例2中制备的灵芝担孢子萌发培养基上，然后于25～28℃避光培养至担孢子萌发。

5.初级菌丝体的获得及鉴定

用无菌的10μL小枪头在无菌条件下挑取担孢子萌发的菌落于PDA平板中央，同时在其边缘斜插一无菌盖玻片，25～28℃培养。当菌丝长至盖玻片上，即可在无菌条件下将其取出并置于显微镜下进行镜检，观察是否有锁状联合结构，无锁状联合结构的即为初级菌丝体。最终获得了“沪农灵芝1号”的担孢子萌发而成的单核菌株83株。涂布萌发培养基平板上的担孢子总数为520个，所以根据前述灵芝担孢子萌发率的计算公式，可以计算出本实施例中的灵芝担孢子萌发率约为16％。

实施例6灵芝担孢子的收集和萌发

1.适合担孢子收集的子实体选择

选取的生长发育良好、菌盖美观且菌盖边缘出现0.5cm的白色至浅褐色生长圈的“沪农灵芝1号”灵芝子实体(正生长于菌棒上)，用蒸馏水进行清洗，确保子实体和菌棒清洁，用于收集灵芝担孢子。

2.担孢子收集

担孢子收集采用套筒方式，用两头开口的保鲜袋套住灵芝子实体，再用一端封闭的无纺布圆筒套在外部。

担孢子收集期间的环境温度维持在25～28℃；收集时间为5d，取灵芝菌盖上方的担孢子用于萌发。

3.担孢子保存

收集的灵芝担孢子存放于无菌的离心管中，并置于4～6℃，待用。

4.担孢子萌发

取极少量的灵芝担孢子，用无菌蒸馏水逐步稀释，形成担孢子悬浮液，确保担孢子的浓度为1×10³个/mL。吸取100μL担孢子悬浮液均匀涂布于实施例3中制备的灵芝担孢子萌发培养基上，然后于25～26℃避光培养至担孢子萌发。

5.初级菌丝体的获得及鉴定

用无菌的10μL小枪头在无菌条件下挑取担孢子萌发的菌落于PDA平板中央，同时在其边缘斜插一无菌盖玻片，25～28℃培养。当菌丝长至盖玻片上，即可在无菌条件下将其取出并置于显微镜下进行镜检，观察是否有锁状联合结构，无锁状联合结构的即为初级菌丝体。最终获得了“沪农灵芝1号”的担孢子萌发而成的单核菌株139株。涂布萌发培养基平板上的担孢子总数为700个，所以根据前述灵芝担孢子萌发率的计算公式，可以计算出本实施例中的灵芝担孢子萌发率约为20％。

Claims (3)

1.一种灵芝担孢子萌发培养基，其特征在于该培养基由如下组分组成：

灵芝煮出液，PDA粉末和水；

其中灵芝煮出液、PDA粉末和水的比例为：300～400mL：39g：600～700mL；

其中所述的灵芝煮出液是通过如下方法制备得到的：

将灵芝子实体加入水中，电磁炉800～1600w加热10～15min，过滤，取滤液即可。

2.一种应用权利要求1的灵芝担孢子萌发培养基进行灵芝担孢子萌发的方法，该方法为：

取灵芝担孢子，用水稀释，形成担孢子悬浮液，使担孢子的浓度为×10³个/mL；

吸取担孢子悬浮液均匀涂布于上述灵芝担孢子萌发培养基上；

于25～28℃避光培养至担孢子萌发。

3.一种应用权利要求1的灵芝担孢子萌发培养基进行灵芝担孢子收集与萌发的方法，该方法包括如下步骤：

⑴适合担孢子收集的灵芝子实体选择

选取生长发育良好、菌盖美观且正在喷射灵芝担孢子的灵芝子实体；

⑵担孢子收集

担孢子收集采用套筒方式，用两头开口的保鲜袋套住灵芝子实体，再用一端封闭的无纺布圆筒套在外部；

担孢子收集期间的环境温度维持在20～30℃；收集时间为3～5d，取灵芝菌盖上方的担孢子；

⑶担孢子保存

收集的灵芝担孢子存放于无菌的离心管中，并置于4～10℃，待用；

⑷担孢子萌发

取灵芝担孢子，用水稀释，形成担孢子悬浮液，使担孢子的浓度为×10³个/mL；

吸取担孢子悬浮液均匀涂布于上述灵芝担孢子萌发培养基上；

于25～28℃避光培养至担孢子萌发。