CN103026901A - 一种赤芝担孢子萌发的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种赤芝担孢子萌发的方法。通过选择赤芝子实体时期，采用套袋方法收集担孢子并控制收集担孢子时间，在麦芽赤芝培养基进行萌发，使赤芝担孢子的萌发率在1.0%以上，从而获得赤芝单孢菌株，所述麦芽赤芝培养基配方为：麦芽汁200ml，赤芝提取液100ml，琼脂20g，水700ml，121℃灭菌30min。本方法解决了在实验室条件下赤芝担孢子不易萌发的难题，从而为赤芝的单孢杂交育种打下基础。本发明简单易行，无需用到特殊的药品及仪器设备，普通实验室即可通过本发明获得所需的单孢菌株用于赤芝的杂交育种或用于赤芝的遗传分析。

Description

一种赤芝担孢子萌发的方法

技术领域    

本发明涉及一种赤芝担孢子萌发的方法。

背景技术   

赤芝，学名为Ganoderma lucidum (Leyss.Fr) Karst，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属。我国最早的药学著作（神农本草经）中记载有赤芝“苦、平、无毒”，主治“胸中结”，“益心气，补中，增智慧，不忘”，此外还强调灵芝可“久食亲身不老，延年神仙”。可见灵芝的使用早在公元一世纪左右便为人所知。上世纪70年代，林志彬等在对灵芝药理和临床的研究过程中提出来了灵芝“扶正固本”的作用机制的工作假说。并在长期的研究中证明并完善这一假说。灵芝的药理作用主要表现在以下几个方面：1、抗肿瘤作用；2、免疫调节作用；3、抗放射作用；4、对神经系统作用；5、对心血管的作用；6、对呼吸系统的作用；7、对消化系统的作用；8、对内分泌代谢系统的作用。

食用菌常用育种方法主要有单孢杂交育种，原生质体融合育种，诱变育种以及野生菌株驯化等，但灵芝担孢子细胞壁厚，长期以来被认为不能萌发，限制了灵芝的新品种选育。据统计我国已通过省级以上审定的赤芝品种共计18个，其中国家级审定品种4个，省级审定品种14个。18个品种中引进品种1个，野生驯化品种13个，原生质体融合育成的品种2个，通过原生质体单核化育种品种2个。相较于其他食药菌品种，杂交育种所在的比例很少，而通过单孢杂交选育而成的品种则没有。目前国内栽培的赤芝品种主要是从日本和韩国引进的品种，如从日本引进的日芝、信州、惠州等，韩国引进的韩芝系列等。

野生驯化菌种中高产优质的品种较少，且筛选驯化工作繁重。诱变育种由于选育定向性差及遗传稳定性差所以在生产栽培上很少推广使用。原生质体单核化育种虽可以解决由于灵芝担孢子难萌发，单核菌株难以获得的难题，但是原生质体单核化获得的单核菌株未经减数分裂过程，一个菌株只能获得两种类型的单核菌株，因此通过原生质体技术很难获得广泛变异的新品种。通过担孢子能获得具有丰富遗传多样性的单核菌株，本发明解决了赤芝担孢子难萌发的问题，为赤芝的单孢杂交育种打下良好的基础，具有广泛的应用前景。

发明内容  

 本发明的目的是提供一种赤芝担孢子萌发的方法，解决赤芝担孢子不易萌发的难题，为赤芝的单孢杂交育种打下基础。

本发明的一种赤芝担孢子萌发的方法，包括以下步骤： 

（1）担孢子收集 

用于萌发的担孢子应选择孢子释放周期前10天释放的，即待赤芝菌盖分化形成，菌盖边缘1-2cm呈白色生长圈时收集担孢子；

采用套袋收集的方法，套袋材料选用无菌的白色或黄色的信封和硫酸纸，将无菌的硫酸纸光面向上放入信封，再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，用橡皮筋将信封口固定在菌柄上；担孢子收集期间控制环境相对湿度80%-90%，温度24℃-28℃，套袋收集的时间为20h-24h；

（2）担孢子保存

    收集的赤芝担孢子放在信封内，控制环境温度20℃-30℃、相对湿度50%-75%，或放置在4℃冰箱；但放置时间不超过24h；

（3）担孢子萌发

取收集的赤芝担孢子，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有10-20个孢子即可涂布赤芝担孢子萌发培养基，然后在28℃生化培养箱中黑暗培养，至担孢子萌发；使用的赤芝担孢子萌发培养基为麦芽赤芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，赤芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min；

所述麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水定容至1L；

所述赤芝提取液：取120-200g切碎的干赤芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水定容至1L。

通过选择赤芝子实体时期，采用套袋方法收集担孢子并控制收集担孢子时间，在麦芽赤芝培养基进行萌发，使赤芝担孢子的萌发率在1.0%以上，从而获得赤芝单孢菌株。本方法解决了在实验室条件下赤芝担孢子不易萌发的难题，从而为赤芝的单孢杂交育种打下基础。

    担孢子是担子菌细胞核减数分裂的产物，是进行杂交选育的基本材料。本发明简单易行，无需用到特殊的药品及仪器设备，普通实验室即可通过本发明获得所需的单孢菌株用于赤芝的杂交育种或用于赤芝的遗传分析。由于通过担孢子萌发所获得的单核菌株多样性丰富，用于杂交育种其后代遗传性状稳定，且有利于获得新的遗传性状，克服了野生驯化遗传变异小，诱变育种不稳定的问题，为赤芝的品种改良和新品种选育打下基础。

附图说明

图1 赤芝担孢子在培养基萌发形态。

图2 赤芝子实体生长中期，此时收集的担孢子易萌发。

图3 赤芝子实体生长后期，此时收集的担孢子不易萌发或不萌发。

图4 赤芝子实全生长成熟期，此时收集的担孢子不萌发。

具体实施例

本发明的一种赤芝担孢子萌发的方法，包括以下步骤：

1. 担孢子收集时期及方法 

赤芝孢子释放周期大约30天，用于萌发的担孢子应选择前10天释放的。即待赤芝菌盖分化形成，菌盖边缘1-2cm呈白色生长圈时收集担孢子，见图2。若菌盖边缘的白色生长圈小于1cm或消失时收集的担孢子不易萌发或不萌发，见图3和图4。

孢子采集采用套袋收集的方法，套袋材料选用无菌的白色信封和硫酸纸。将无菌的硫酸纸光面向上放入信封，再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，用橡皮筋将信封口固定在菌柄上。孢子收集期间控制空间相对湿度在80%-90%，温度24℃-28℃，套袋收集的时间在20h-24h便可在硫酸纸收集到赤芝担孢子。收集时间过短则收集的孢子量少，若时间过长收集的担孢子则不易萌发或不萌发。

2.担孢子保存

    收集的赤芝担孢子放在无菌的信封内，空间温度20℃-30℃、相对湿度50%-75%，或放置4℃冰箱，但放置时间不超过24h，若超过24h则不易萌发或不萌发。

3. 担孢子萌发处理

取刚收集的赤芝孢子印，在无菌操作下稀释至100倍显微镜视野中有10-20个孢子即可涂布平板，涂好的平板在28℃生化培养箱中黑暗培养48h后开始观察，至担孢子开始萌发。使用的赤芝担孢子萌发培养基为麦芽赤芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，赤芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min。

麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水至1L。

赤芝提取液：取120-200g切碎的干赤芝，加入1L煮沸30min，过滤去除残渣并加水至1L。

为了充分公开本发明的赤芝担孢子萌发的方法，以下结合实施例加以说明。

实施例1：一种赤芝担孢子萌发的方法 

 1.亲本选择及岀芝：

选择生产性状良好的日本赤芝和赤芝5.75作为亲本，在PDA斜面进行活化，长满斜面后转接到木屑菌袋中。具体种植方法参见文献：曾振基，古培总，陈东标，凌宏通，何焕清．杂木屑栽培赤灵芝技术[J]．中国食用菌，2004，23（3）：41-42。

2. 担孢子采集时期及方法

赤芝孢子释放周期大约30天，用于萌发的担孢子应选择前10天释放的。即待赤芝菌盖分化形成，选择子实体生长至3-4cm、菌盖边缘1-2cm呈白色生长圈时收集担孢子。用无菌的白色信封和硫酸纸采用套袋法收集孢子，将无菌的硫酸纸光面向上放入信封，再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，用橡皮筋将信封口固定在菌柄上。孢子收集期间控制空间相对湿度在85%-90%，温度26℃，套袋收集的时间为22h便可在硫酸纸收集到赤芝担孢子。收集时间过短则收集的孢子量少，若时间过长收集的担孢子则不易萌发或不萌发。

3. 担孢子保存

将收集的赤芝担孢子装入无菌的信封内，于室温下、相对湿度70%放置4h后进行涂单孢。

4. 担担孢子萌发处理

取收集保存4h的赤芝孢子印，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有10-20个孢子即可涂布平板，涂好的平板在28℃生化培养箱中黑暗培养4854h，可观察到萌发的赤芝担孢子。使用的赤芝担孢子萌发的平板培养基为麦芽赤芝汁琼脂培养基，其配方为：麦芽汁200ml，赤芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min。

麦芽汁：取干麦芽粉15g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水至1L。

赤芝提取液：取120g切碎的干赤芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水至1L。

PDA培养基配方：200g马铃薯（浸提液）、20g葡萄糖、20g琼脂、pH自然加水至1000mL。

水琼脂培养基配方：琼脂 20g，水1000ml。

表1 不同萌发处理48h赤芝孢子萌发率

备注：“—”代表未观察到孢子萌发

5.单核菌株获得及检测

选取观察到有担孢子萌发的平板，在100倍显微镜下观察寻找萌发出芽管的担孢子，见图1。用接种针无菌条件下连同培养基挑出萌发担孢子于PDA斜面培养基中，28℃培养。当菌落长到1cm左右时即可在显微镜下镜检观察是否有锁状联合，无锁状联合的即为单核菌株。通过纯化后，共获得了日本赤芝单核菌株43根，赤芝5.75单核菌株45根。

6.单核菌株交配型测定 

以日本赤芝的一个单孢菌株记为T₁，作为交配型测定的基准菌株，其交配型定为A_xB_x。将余下42根日本赤芝单核菌株与T₁在PDA培养基上进行配对，待两个单孢菌株的菌丝接触3d后，观察锁状联合，出现锁状联合的表示与T₁发生亲和反应，选出能与T₁发生亲和反应的单孢菌株，将其定为测交菌株T₂，其交配型定为A_yB_y。

将所有不与T₁亲和的单孢分离菌株与T₂交配，能与T₂发生亲和反应的单孢分离菌株的交配型则为A_xB_x。

将既不与T₁发生亲和，又不与T₂发生亲和的某一单孢菌株定为测交菌株T₃，其交配型定为A_xB_y。将既不与T₁发生亲和，又不与T₂发生亲和的所有其他单孢菌株均与T₃交配，交配中发生亲和的菌株的交配型为A_yB_x，而不亲和的菌株交配型为A_xB_y。

通过三轮交配反应，可知43根日本赤芝单核菌株的交配型，交配型为A_xB_x有15个单孢菌株，交配型为A_yB_y有18个单孢菌株，交配型为A_xB_y有7个单孢菌株，交配型为A_yB_x有3个单孢菌株。获得四种交配的单孢菌株。

同样的方法测得45根赤芝5.75单核菌株的交配型，交配型为A_xB_x有20个单孢菌株，交配型为A_yB_y有19个单孢菌株，交配型为A_xB_y有6个单孢菌株。获得三种交配型的单孢菌株。

这些单孢菌株为后续赤芝品种间的单孢杂交育种打下基础。

Claims (1)

1.一种赤芝担孢子萌发的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）担孢子收集 

用于萌发的担孢子应选择孢子释放周期前10天释放的，即待赤芝菌盖分化形成，菌盖边缘1-2cm呈白色生长圈时收集担孢子；

采用套袋收集的方法，套袋材料选用无菌的白色或黄色的信封和硫酸纸，将无菌的硫酸纸光面向上放入信封，再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄，使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面，用橡皮筋将信封口固定在菌柄上；担孢子收集期间控制环境相对湿度80%-90%，温度24℃-28℃，套袋收集的时间为20h-24h；

（2）担孢子保存

    收集的赤芝担孢子放在信封内，控制环境温度20℃-30℃、相对湿度50%-75%，或放置在4℃冰箱；但放置时间不超过24h；

（3）担孢子萌发

取收集的赤芝担孢子，在无菌操作下用无菌水稀释至100倍显微镜视野中有10-20个孢子即可涂布赤芝担孢子萌发培养基，然后在28℃生化培养箱中黑暗培养，至担孢子萌发；使用的赤芝担孢子萌发培养基为麦芽赤芝培养基，其配方为：麦芽汁200ml，赤芝提取液100 ml，琼脂 20g，水700ml，121℃灭菌30 min；

所述麦芽汁：取干麦芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70℃浸渍60min，过滤取浸渍液，将残渣同样再浸渍、过滤一次，将两次浸渍液混合，过滤去除残渣并加水定容至1L；

所述赤芝提取液：取120-200g切碎的干赤芝，加入1L水煮沸30min，过滤去除残渣并加水定容至1L。

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