CN110438014A - 一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法及应用 - Google Patents

一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法及应用 Download PDF

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杨菁
肖冬来
张迪
黄小菁
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Abstract

本发明涉及一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法和应用，包括以亲本的选择、担孢子的收集、纯菌丝体的获得和单双核菌丝确认等步骤；本发明以物理方式简易快速收集担孢子，使得担孢子收集过程由2天缩短至20‑30min，且能够克服因生长发育时间、温度不适宜造成孢子难以释放的因素，减少了污染率，高效便捷地获得担孢子。

Description

一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法及应用
技术领域
本发明属于食用菌育种技术领域，具体涉及一种食用菌伞菌担孢子的分离方法及应用。
背景技术
我国是世界食用菌栽培大国，是世界上食用菌栽培种类最多，产量最高的国家。食用菌的生产是一个涉及到菌种、培养料、生长环境和栽培技术等诸多方面的栽培体系，在满足食用菌生产的诸多环节因素中，优质、高产、抗逆性强的菌种是一个最重要的因素，具有优良基因综合性状的栽培品种的菌种纯培养是食用菌产业优质发展的保障。在生产实践中多用菌种分离获得所需菌种，食用菌菌种分离就是在无菌条件下将所需要的食用菌与其他微生物分开，在适宜条件下培养以获得纯培养的过程，获得食用菌纯培养方法因分离材料性质不同而分为组织分离法、孢子分离法、基内菌丝分离法三种。其中，孢子分离法在食用菌育种中使用较为普遍。孢子分离法是利用食用菌成熟的有性孢子在适宜的培养基上萌发成菌丝体，进而获得的纯培养的方法。一个食用菌子实体可以形成上亿的有性孢子，即担孢子，数量众多的担孢子其遗传特性变异数量也较大，因此是良种选育的好材料。
传统的孢子分离法是依靠自身的生物特性弹射获取担孢子，获得的担孢子经过萌发形成纯菌丝体，常规的孢子分离法存在着担孢子良莠不齐的状况，孢子弹射后收集担孢子需要24-48h，花费时间长，且操作上易发生污染等问题。现有技术中已经有较多装置用于辅助孢子分离，专利号为CN105969654B的中国专利公开了一种真菌孢子洗筛过滤器及真菌孢子分离方法，利用洗筛瓶以及水流的作用进行真菌孢子的分离和收集，但是该装置和方法容易造成孢子污染等问题；专利号为CN201770697U的中国专利公开了一种真菌孢子分离机，包括物料粉碎机、沉降分离器、气流循环系统和风机，能够满足实验室真菌分离量小批次多品种复杂，但是，操作复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食用菌伞菌担孢子的分离方法和应用，以物理方式简易快速收集担孢子，使得担孢子收集过程由2天缩短至20-30min，且能够克服因生长发育时间、温度不适宜造成孢子难以释放的因素，减少了污染率，高效便捷地获得担孢子。
一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，具体步骤如下：
（1）亲本的选择：根据育种目标选择八分熟的子实体作为种菇；
（2）担孢子的收集：无菌操作切开子实体菌盖，切取菌褶，将菌褶放入无菌水中制成担孢子悬液；
（3）纯菌丝体的获得：将担孢子悬液制成不同梯度的孢子悬液，进行平板培养，待孢子萌发，挑取生长良好的单菌落，获得纯菌丝体；
（4）单双核菌丝确认：经过步骤（3）获得的纯菌丝体在显微镜下进行镜检，根据有无锁状联合，辨别双核菌丝体和单核菌丝体。
进一步的，所述步骤（2）中菌褶位于菌盖与菌柄连接处，切取菌褶1-2mm，菌褶置于含有无菌水的试管中，需经过超声波清洗器振荡15~30min制成担孢子悬液。
进一步的，所述步骤（3）中通过十倍稀释法稀释担孢子悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同梯度浓度的孢子悬液。
进一步的，将经过步骤（3）制得的各梯度浓度孢子悬液进行平板培养，在23~25℃条件下培养7~10天孢子萌发，进而挑取生长良好的单菌落，获得纯菌丝体。
进一步的，所述步骤（4）单双核菌丝确认的具体步骤如下：
S1、在PDA培养基的平板上接种纯菌丝体，在23~25℃条件下培养3~5天，在距菌丝生长点前端倾斜插入盖玻片继续培养；
S2、待菌丝爬至2/5~3/5插片时，将已爬壁的菌丝盖玻片取出，扣于载玻片上，使得菌丝面朝下；
S3、将载玻片置于显微镜下，观察菌丝核相，确定单双核菌株。
进一步的，所述步骤S1中在距菌丝前端处以30~60°斜插入盖玻片。
一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法适用于姬松茸、大球盖菇或香菇系食用菌伞菌类担孢子的分离及选育工作。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明以物理方式简易快速收集担孢子，使得担孢子收集过程由2d缩短至20-30min，能够高效便捷地获取担孢子，本发明的担孢子分离方法适用于姬松茸、大球盖菇、香菇等食用菌伞菌类担孢子的分离及选育工作。
2、本发明采用菌褶多点定位采集担孢子，克服了传统担孢子自行弹射的收集方式中因生长发育时间、温度不适宜造成孢子难以释放等问题。
3、本发明通过无菌操作采集担孢子，在多点菌褶处定位取样，可控性强，染上杂菌的几率小，克服了传统担孢子自行弹射收集过程中弹射担孢子与杂菌混合的问题，提高了菌种选育纯培养的效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。
实施例1
一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，具体步骤如下：
（1）亲本的选择：根据育种目标选择八分熟的子实体作为种菇；
（2）担孢子的收集：无菌操作切开子实体菌盖，在菌盖与菌柄连接处切取菌褶1-2mm，将切取的菌褶置于含有无菌水的试管中，经过超声波清洗器振荡15~30min制成担孢子悬液；
（3）纯菌丝体的获得：将担孢子悬液通过十倍稀释法稀释制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同梯度浓度的孢子悬液，将制得的孢子悬液进行平板培养，在23~25℃条件下培养7~10天待孢子萌发，从中挑取生长良好的单菌落，获得纯菌丝体；
（4）单双核菌丝确认：经过步骤（3）获得的纯菌丝体在显微镜下进行镜检，根据有无锁状联合辨别双核菌丝体和单核菌丝体；单双核菌丝确认的具体步骤如下：
S1、在PDA培养基的平板上接种纯菌丝体，在23~25℃条件下培养3~5天，在距菌丝生长点前端以30~60°倾斜插入盖玻片继续培养；
S2、待菌丝爬至2/5插片时，将已爬壁的菌丝盖玻片取出，扣于载玻片上，使得菌丝面朝下；
S3、将载玻片置于显微镜下，观察菌丝核相，确定单双核菌株。
分离收集的食用菌伞菌类担孢子可应用于多孢自交育种和单孢杂交育种中。
其中，多孢自交育种的具体步骤如下：将经步骤（1）-（4）制得的担孢子悬液加入到液体培养基中进行液体多孢自交摇菌，液体多孢自交摇菌的摇床转速为150rpm/min，培养温度为23~25℃，得到的混合菌丝液植入PDA平板培养7~10d，挑选出生长速度快且菌丝浓密洁白的单菌落，镜检有无锁状联合，挑选有锁状联合的双核菌丝进行栽培，进行子实体的组织分离与培养，出菇后经过初筛和复筛获得农艺性状优良，稳定的品种。
其中，单孢杂交育种的具体步骤如下：根据育种目标选择亲缘关系较远的子实体作为亲本菌株，两亲本菌株均经过步骤（1）-（4）处理后获得的无锁状联合的单核菌丝，将两亲本担孢子的单核菌丝体两两接种于同一PDA平板上进行配对杂交，两亲本担孢子的单核菌丝体相距2~3cm对峙培养至菌丝充分接触、融合并发生核迁移，杂交后挑取相互交接处的菌丝进行培养，镜检有无锁状联合，若有锁状联合，则表明杂交成功所获得异核体；获得的异核体菌株以及亲本菌株1、亲本菌株2在同一PDA平板上按照亲本菌株1、异核体菌株和亲本菌株2的方式相距2~3cm接种培养15~17天进行拮抗差异性鉴定，最终选取菌丝生长均匀、整齐、长速快且洁白粗壮异核体作为出菇试验的材料，经过栽培出菇初筛，复筛获得新品种。
本发明适用于姬松茸、大球盖菇或香菇等系食用菌伞菌类担孢子的分离及选育工作。
实施例2
一种姬松茸的担孢子分离方法以及多孢自交育种，具体步骤如下；
（1）在无菌环境下，在姬松茸发育基本成熟子实体的菌盖与菌柄连接处，用无菌解剖刀切取1-2mm菌褶，放入10 ml无菌水的试管中；再将试管置于超声波清洗器中进行振荡20min，制备成姬松茸担孢子悬液；
（2）将经过步骤（1）所得姬松茸担孢子悬液1ml加入到200ml的液体培养基三角摇瓶中，进行多孢自交摇床摇菌，摇床条件为转速150/min，温度25℃，培养3d；将所得到的姬松茸混合菌丝液植入PDA平板培养10d，挑选生长速度快，菌丝浓密洁白的单菌落；
（3）在显微镜下（600倍）镜检有无锁状联合，有锁状联合的双核菌丝表明已形成异核体；选取菌丝生长均匀，整齐、长速快且洁白粗壮姬松茸异核体作为出菇试验的材料，按照常规的姬松茸栽培管理方法，经过栽培出菇区域试验初筛，生产试验复筛，获得农艺性状优良，稳定的品种。
本实施例所用的姬松茸亲本菌株为福建省农科院食用菌研究所提供；
实施例3
一种大球盖菇的担孢子分离方法以及多孢自交育种，具体步骤如下；
（1）在无菌环境下，在大球盖菇发育基本成熟的子实体菌盖与菌柄连接处，用无菌解剖刀切取1-2mm菌褶，放入10 ml无菌水的试管中；再将试管置于超声波清洗器中进行振荡30min，制备成大球盖菇担孢子悬液；
（2）将经过步骤（1）所得的大球盖菇担孢子悬液1ml加入到200ml的液体培养基三角摇瓶中,进行多孢自交摇床摇菌，摇床条件为转速150rpm/min，温度22℃，培养1d；将所得到的大球盖菇混合菌丝液植入PDA平板培养7d，挑选生长速度快，菌丝浓密洁白的单菌落；
（3）在显微镜下（600倍）镜检锁状联合，有锁状联合的双核菌丝表明已形成大球盖菇异核体；选取菌丝生长均匀，整齐、长速快且洁白粗壮大球盖菇异核体作为出菇试验的材料，按照常规的大球盖菇栽培管理方法，经过栽培出菇，区域试验初筛，生产试验复筛，获得农艺性状优良，稳定的品种。
本实施例所用的大球盖菇亲本菌株为福建省农科院食用菌研究所提供；
实施例4
一种香菇的担孢子分离方法及单孢杂交育种，具体步骤如下：
（1）根据育种目标选择亲本之间优势互补、亲缘关系较远、亲合力好的子实体，分别选择发育基本陈述的野生香菇子实体和栽培香菇808品种的子实体，并在子实体菌盖与菌柄连接处，用无菌解剖刀切取1-2mm菌褶，放入10 ml无菌水的试管中；再将试管置于超声波清洗器中进行振荡20min，分别制备成野生香菇和栽培香菇808担孢子悬液；
（2）利用十倍稀释法梯度稀释野生香菇和栽培香菇808各自担孢子悬液进行平板培养，在25℃培养10d,，香菇担孢子萌发，挑取生长良好单菌落，获得纯菌丝体；
（3）在显微镜下（600倍）镜检锁状联合，无锁状联合的为野生香菇单核菌丝体和栽培香菇808单核菌丝体；在取得的野生香菇和栽培香菇808单核菌丝体中选择菌丝粗壮浓密、生长势旺盛的个体，两两接种于同一PDA平板上进行配对杂交，两者相距2cm对峙培养至菌丝充分接触，两两单核菌丝体融合、发生核迁移；
（4）杂交后挑取两个单核菌丝体相互交叠处的菌丝体转接至PDA进行再次培养并编号；在显微镜下（600倍）镜检有无锁状联合，若有锁状联合，则表明杂交组合成功，形成杂合子菌株；选取菌丝生长均匀，整齐、长速快且洁白粗壮的杂合子作为出菇试验的材料，进行优良杂交子的筛选，经过品种比较试验，区域试验的初筛、生产试验的复筛获得农艺性状优良，稳定的香菇新品种；
（5）在同一PDA平板内按野生香菇菌株、杂合子菌株、香菇808菌株的方式相距2~3cm接种培养15~17d进行拮抗差异性鉴定；
本实施例中所用的野生香菇系福建省闽北山区采集。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）亲本的选择：根据育种目标选择八分熟的子实体作为种菇；
（2）担孢子的收集：无菌操作切开子实体菌盖，切取菌褶，将菌褶放入无菌水中制成担孢子悬液；
（3）纯菌丝体的获得：将担孢子悬液制成不同梯度的孢子悬液，进行平板培养，待孢子萌发，挑取生长良好的单菌落，获得纯菌丝体；
（4）单双核菌丝确认：经过步骤（3）获得的纯菌丝体在显微镜下进行镜检，根据有无锁状联合，辨别双核菌丝体和单核菌丝体。
2.如权利要求1所述的一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中菌褶位于菌盖与菌柄连接处，切取菌褶1-2mm，菌褶置于含有无菌水的试管中，需经过超声波清洗器振荡15~30min制成担孢子悬液。
3.如权利要求1所述的一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于：所述步骤（3）中通过十倍稀释法稀释担孢子悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同梯度浓度的孢子悬液。
4.如权利要求3所述的一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于：将经过步骤（3）制得的各梯度浓度孢子悬液进行平板培养，在23~25℃条件下培养7~10天孢子萌发，进而挑取生长良好的单菌落，获得纯菌丝体。
5.如权利要求1所述的一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于：所述步骤（4）单双核菌丝确认的具体步骤如下：
S1、在PDA培养基的平板上接种纯菌丝体，在23~25℃条件下培养3~5天，在距菌丝生长点前端倾斜插入盖玻片继续培养；
S2、待菌丝爬至2/5~3/5插片时，将已爬壁的菌丝盖玻片取出，扣于载玻片上，使得菌丝面朝下；
S3、将载玻片置于显微镜下，观察菌丝核相，确定单双核菌株。
6.如权利要求5所述的一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于：所述步骤S1中在距菌丝前端处以30~60°斜插入盖玻片。
7.如权利要求1至6任一所述的一种食用菌伞菌类担孢子的分离方法，其特征在于：适用于姬松茸、大球盖菇或香菇系食用菌伞菌类担孢子的分离及选育工作。
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