CN103392504A - 一种纯化金针菇单核菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种纯化金针菇单核菌株的方法，其特征在于包含以下步骤：将从金针菇子实体收集的担孢子接种到带PDA培养基的平板培养至形成圆形菌落；在菌落边缘挑取连带PDA培养基的菌丝1～2mm作为接种块，接种至新的带PDA培养基的平板，培养至接种块周围有放射状菌丝长出；再次挑取单根菌丝至新的PDA培养基培养，继续培养6～7天得到纯化的菌落，任意挑选菌丝再次培养，得到纯化后的金针菇菌株；PDA培养基配方：去皮马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，吐温(80)0.1ml，pH值为6.5～6.8，倾倒于平板上，每平板18～20ml。本发明方法能获得高度纯化的单核菌株。

Description

一种纯化金针菇单核菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种食用菌栽培育种方法，特别是公开一种金针菇栽培育种中的单核菌株纯化方法，应用于金针菇的工厂化生产。

背景技术

目前中国食用菌产量占世界总产量的70%，产量超过1000万吨，已成为世界第一菌菇生产国。随着国内外市场对食用菌的需求与日俱增，我国食用菌产业迅速发展。1978年，中国菌类产量仅有6万吨，占世界总产量6%，全国食用菌总产量由1978年的40万吨猛增到近年的1038万吨。据农业部统计，在国内种植业中，食用菌产值仅次于粮、棉、油、菜、果，居第6位。已成为种植业中的一大支柱产业。在食用菌的国际贸易中，我国的贸易量占到亚洲的80%，占到全球的40%。去年我国食用菌出口创汇在2.3亿美元以上。

金针菇生产作为食用菌产业的重要组成部分，其发展不可小觑。在我国，金针菇产量在众多食用菌中排名第五，但产量占总产量不足8%。金针菇工厂化生产占自身比重接近50%，远高于其他食用菌种。2010年上海市金针菇工厂化生产量约87吨/日，约占全国金针菇工厂化生产总量722吨/日的12%。预计2011年上海的金针菇工厂化生产量可达142吨/日，同比增长63%。

金针菇工厂化的高速发展，对于食用菌产业既是机遇又是挑战。同时对金针菇研究提出了更高的要求。开展金针菇研究无论对于上海的工厂化生产，还是对于全国的常规栽培，均有重要意义。与其它种植业一样，新品种的培育是金针菇生产的关键环节，直接影响产品的产量和质量。因此，金针菇的育种工作在研究工作中显得尤为重要。在金针菇育种中，传统的杂交育种仍占据重要地位。而杂交育种的一个重要前提条件就是要有良好的育种材料。在育种材料的选择过程中，如何获得纯化的目的菌株则是重中之重。

金针菇是双因子（A因子和B因子）控制的四极性异宗结合的食用菌，其生活史由有性世代和无性世代组成。金针菇的有性世代在子实体的菌褶上产生担子，每个担子产生四个担孢子。四种交配型的子代担孢子除具有其亲本交配型（A1B1、A2B2）外，还具有两种重组交配型 (A1B2、A2B1)。担孢子在适宜条件下萌发形成单核菌丝体(又称单核体)，交配因子不同的单核菌丝之间发生融合，经过质配，形成具有两种细胞核的双核菌丝（又称双核体），双核菌丝通过一种特定的细胞结构——锁状联合，将两种细胞核均匀输送到每个新生菌丝细胞。而性不亲和的单核菌株之间则可形成异核体则这种异核体则不会产生锁状联合结构，在传统育种工作中这种菌丝体不易区分。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的难题，提供一种纯化金针菇单核菌株的方法，为金针菇工厂化生产中传统的育种工作提供可靠的纯化菌株。

本发明是这样实现的：一种纯化金针菇单核菌株的方法，其特征在于包含以下步骤：

将从金针菇子实体收集的担孢子萌发后的单核菌丝体在无菌环境条件下接种到带PDA培养基的平板，18～19℃，暗室培养至菌丝形成圆形菌落，直径为1～2cm；

在菌落边缘挑取连带PDA培养基的菌丝1～2mm作为接种块，接种至新的带PDA培养基的平板，有菌丝的一面接触新的PDA培养基，18～19℃，暗室培养3天至接种块周围有放射状菌丝长出；

再次挑取单根菌丝至新的PDA培养基培养，在相同条件下继续培养6～7天形成菌落，该菌落里的所有菌丝均得到纯化，任意挑选菌丝再次培养均为纯化后的金针菇单核菌株；

所述的PDA培养基配方：去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 ml，吐温(80)  0.1ml ，pH值为6.5～6.8；所述的带PDA培养基的平板：将上述PDA培养基倾倒在平板上，每平板18～20ml。

本发明方法适用于金针菇单核菌丝的纯化，便于在传统杂交育种过程中获得菌丝单一的育种材料，可有效避免由于菌丝不纯给育种工作带来的不良影响。在金针菇有性繁殖过程中，产生的担孢子可萌发为单核菌丝体，由一个担孢子萌发的菌丝体，即认为是纯的单核菌株，但在实际操作中很难确定获得的菌丝体是否由一个担孢子萌发而成。本发明方法可以获得肉眼可见的单根菌丝，由这单根菌丝萌发而成的菌丝体，等效于由一个担孢子萌发的菌丝体。

金针菇为高等担子菌，其菌丝为有隔菌丝，通常认为有隔菌丝是多细胞组成的，细胞是单核或多核的。然而严格说来，菌丝并非由细胞组成，而是由于隔膜的存在而把菌丝分隔成许多效室，是由细胞核存在的一个固定的细胞质体积的功能单位。金针菇菌丝隔膜属桶孔型隔膜，当菌丝发生断裂后，附近隔膜桶孔会迅速封闭，形成封闭的功能单元。因此，本发明方法获得的单根菌丝可以进一步生长繁殖成菌丝体。

本发明的有益效果是：本发明方法优于传统方法，单核菌丝体在纯化过程中，本发明方法获得的菌丝体是利用单根菌丝生长而成，而传统方法则是挑取菌落边缘菌丝，传统方法获得的单核菌丝体通过镜鉴是否具有锁状联合来进一步确定获得的单核菌丝体的是否为单核菌丝体，本发明方法则可直接获得肉眼可见的单根菌丝，后由这单根菌丝进一步生长成菌丝体，可以等效于由一个担孢子萌发而成的菌丝体。利用本发明的纯化金针菇单核菌株的方法，可以获得纯化的单核菌株，为后续育种工作提供可靠保障。

具体实施方式

实施例：

准备PDA培养基：

配方：去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂20 g，吐温(80)  0.1ml，蒸馏水1000 ml，pH 6.5～6.8，倾倒上述PDA培养基于平板，每平板18～20ml，即成为带PDA培养基的平板。

纯化培养：

将金针菇菌种（上海农业科学院食用菌所提供）栽培出菇，选取完整长势良好的金针菇子实体，摘取菌盖平放于无菌平板，将无菌平板封口置于18～19℃环境中24h，在超净工作台中取出菌盖，在无菌平板上有孢子印形成，此时完成担孢子的收集，用移液器吸取10ul无菌蒸馏水吹打在孢子印上并反复吸打10～15次，吸取孢子液，转移至1ml离心管，稀释5～8个梯度，并利用血球计数板计数，选取孢子数10⁴个/ml的梯度，吸取100ul，涂布无菌平板。将无菌平板置于18～19℃暗室培养，实时观察，有白色肉眼可见圆点形成时，将其挑出，获得担孢子萌发菌丝体。

将担孢子萌发后的菌丝体接种到带PDA培养基的平板，18～19℃，暗室培养至菌落长至直径1～2cm。

在菌落边缘挑取连带PDA培养基的菌丝1～2mm作为接种块，接种至新的带PDA培养基的平板，有菌丝的一面接触新的PDA培养基，18～19℃，暗室培养3天至接种块周围有放射状菌丝长出；

再次挑取清晰可见的单根菌丝至新的PDA培养基培养，该菌丝即为纯化后的单核菌株。在相同条件下继续培养6～7天形成菌落，该菌落里的所有菌丝均得到纯化，任意挑选菌丝再次培养均为纯化后的金针菇单核菌株。

采用本发明方法获得的单核菌丝经PDA培养基培养后其形态学表现为正圆形菌落，并且圆形菌落的形成，与接种量、接种块形状、菌龄等无关，菌丝生长速度单一稳定。通过光学显微镜镜鉴无锁状联合形成，证明获得菌丝体不是双核菌丝。利用四种交配型单核菌株进行交配实验，获得的单核菌株只能同其中一种交配型形成锁状联合，证明获得的单核菌丝体不是异核体，经过上述实验鉴定，通过本发明方法获得的菌丝体为纯化的单核菌丝体。

Claims (1)

1.一种纯化金针菇单核菌株的方法，其特征在于包含以下步骤：

将从金针菇子实体收集的担孢子萌发后的单核菌丝体在无菌环境条件下接种到带PDA培养基的平板，18～19℃，暗室培养至菌丝形成圆形菌落，直径为1～2cm；

在菌落边缘挑取连带PDA培养基的菌丝1～2mm作为接种块，接种至新的带PDA培养基的平板，有菌丝的一面接触新的PDA培养基，18～19℃，暗室培养3天至接种块周围有放射状菌丝长出；

再次挑取单根菌丝至新的PDA培养基，在相同条件下继续培养6～7天形成菌落，该菌落里的所有菌丝均得到纯化，任意挑选菌丝再次培养均为纯化后的金针菇单核菌株；

所述的PDA培养基配方：去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 ml，吐温80  0.1ml ，pH值为6.5～6.8；

所述的带PDA培养基的平板：将上述PDA培养基灌装玻璃三角瓶，瓶口塞紧棉花，121℃高温蒸汽灭菌25min，自然冷却至45～50℃后，在无菌条件下倾倒在直径90mm玻璃平板上，每平板18～20ml。