CN100370016C - 对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillusniger xj)，其形态特征：xj菌株在查氏培养基上，26℃，培养10天，菌落直径为4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子头密集着生，除菌落边缘没有分生孢子外，整个菌落都布满了分生孢子结构，菌落背面无色，不分泌色素，气生菌丝发达，从气生菌丝分化出的分生孢子梗由特化的足细胞长出，顶端膨大成球形，表面着生两层分生孢子小梗，次生小梗上着生成串的分生孢子；分生孢子头为黑色，球形，放射状，直径72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，长600-2100μm，宽12-13μm；顶囊近球形，直径40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子为球形至近球形，表面有突起，直径2.4-3μm。本发明对自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，容易培养和保存及工业化生产，抑制根癌农杆菌效果好。
Description
技术领域
本发明涉及对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途。
背景技术
果树细菌性根癌病菌(Agrobacterium tumefaciens)引起根癌病分布于世界各地。DeCleene和DeLey曾报道根癌农杆菌可侵染93个科331属643中的双子叶植物及少数裸子植物。1980年Kennedy报道美国由原核植物病原菌所造成的作物损失中，果树和葡萄的根癌病排列为最重要。我国的葡萄根癌病在北方地区13个省均有不同程度发生，樱桃根癌病在山东、大连、河北等地发生严重，桃树根癌病在江苏、浙江、福建及上海郊区普遍发生，严重的果园植株发病率为90％以上。
根癌病对果树的危害极大是一种世界性病害，直接影响了果树产品的生产，从而影响了农业经济的发展。因此，对此病的防治引起了世界各国的关注，鉴于化学农药对环境的污染和生态平衡的破坏，植物根癌病的生物防治得到了重视，国际上主要应用细菌在其代谢过程中产生的细菌素来对根癌农杆菌的生长起到预防和抑制的作用，但其菌株主要是选取不致病的发根土壤杆菌K84菌株，K84菌株在根癌病的防治中的作用是防非治，是作为一种预防措施使用，并且不能防治所有根癌病，只对含胭脂碱Ti质粒的根癌农杆菌才有效果。虽然分离出的另外一些无致病性的土壤杆菌，如根癌土壤杆菌J73、根癌土壤杆菌D286等能弥补K84菌株之不足，但生防细菌不耐旱，寿命短，必须贮藏和随制随用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种对根癌农杆菌T-37有抑制作用的拮抗真菌黑曲霉菌株。
本发明的另一目的在于提供该对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株在抑制根癌农杆菌方面的用途。
对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，其形态特征：xj菌株在查氏(Czapck)培养基上，26℃，培养10天，菌落直径为4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子头密集着生，除菌落边缘没有分生孢子外，整个菌落都布满了分生孢子结构，菌落背面无色，不分泌色素，气生菌丝发达，从气生菌丝分化出的分生孢子梗由特化的足细胞长出，顶端膨大成球形，表面着生两层分生孢子小梗，次生小梗上着生成串的分生孢子。分生孢子头为黑色，球形，放射状，直径72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，长600-2100μm，宽12-13μm；顶囊近球形，直径40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子为球形至近球形，表面有突起，直径2.4-3μm。
该菌种已于2006年3月7目保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)
对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的分离步骤：
(1)拮抗菌的分离与纯化：准确称取10.0g果树根系土样，借助无菌操作技术，将土样加入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，使土样均匀地分散为稀释液，再吸取1m土壤稀释液到9ml无菌水中，充分混匀，成为土壤悬液。采用混菌法接种，吸取1ml悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却到45℃的双抗马丁氏培养基，充分混匀，待凝固后倒置，25℃保温培养5天，挑取真培养基中长出的肉眼可见的大小不同的真菌菌落，移入马丁氏平板上，恒温培养，直至纯化得到单菌落，转移至斜面试管保存；
(2)拮抗菌琼脂柱的制备：在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基(厚1cm)，用打孔器对已冷却的PDA培养基进行打孔，将琼脂柱放置于无菌空培养皿中，用接种环分别取少量的拮抗菌孢子接在琼脂柱上，26℃静置培养3天；
(3)拮抗菌的筛选
T-37平板制备：取长满根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面试管一只，加入灭过菌的蒸馏水10ml，用枪轻轻吹打并充分混匀，制成细菌菌悬液，取0.1ml接种于平板培养基表面，用L棒均匀涂布；
拮抗菌筛选：将已制备好的拮抗菌琼脂柱分别置于T-37平板上，于4℃冰箱倒扣放置12h后，30℃继续培养48h，室温下观察结果，在琼脂柱周围有一株真菌产生较明显的抑菌圈，这一株真菌即为本发明的黑曲霉菌株xj(Aspergillus.niger xj)。
通过对抑菌试验来说明本发明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的抑制根癌农杆菌的用途：
(1)发酵液与菌体提取液的制备
将上述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)按10％的接种量接入PDA液体发酵培养基中(200ml培养瓶装入40ml培养基)，26℃，140rpm，摇瓶培养9天，将发酵液与菌丝体一同转入离心管中，2000转/分，离心10min进行菌液分离，再用蒸馏水重悬菌丝体(加水量为菌丝体5倍)，2000转/分再离心10min，反复4次，分别收集上清液和菌丝体。
双层滤纸过滤上清液，将上清液置于减压真空干燥箱中50℃浓缩10倍，浓缩后的上清液于紫外灯下照射30分钟，置于4℃冰箱备用。
菌丝体于减压真空干燥箱中55℃烘至恒重，再将菌丝研磨成粉，过80目筛，加入20倍无菌水，50℃水浴30min，浸提4次，收集提取液，过滤，浓缩，紫外照射，4℃冰箱保存备用。
(2)用无菌的圆滤纸片(直径0.6cm)，分别吸取发酵上清液与菌体提取液，在酒精灯前略微干燥，轻轻放在T-37平板上，倒置于4℃冰箱12h后，30℃继续培养48h，室温下可分别产生直径为2.4cm与3.8cm的抑菌圈。
本发明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，能适应病害生态系，而且耐突变，容易培养和保存，抑制根癌农杆菌效果好，在农业方面有很大的应用前景。该技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，实现液体发酵工业化生产黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，为开发相关生物制剂奠定基础。
具体实施方式
对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的分离步骤：
(1)供试菌株：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)购于中国农业科学院土壤肥料研究所，保存于贵州大学真菌资源研究所；
(2)拮抗菌的分离与纯化：准确称取10.0g果树根系土样，借助无菌操作技术，将土样加入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，使土样均匀地分散为稀释液，再吸取1m土壤稀释液到9ml无菌水中，充分混匀，成为土壤悬液。采用混菌法接种，吸取1ml悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却到45℃的双抗马丁氏培养基，充分混匀，待凝固后倒置，25℃保温培养5天，挑取真培养基中长出的肉眼可见的大小不同的真菌菌落，移入马丁氏平板上，恒温培养，直至纯化得到单菌落，转移至斜面试管保存；
(3)拮抗菌琼脂柱的制备：在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基(厚1cm)，用打孔器对已冷却的PDA培养基进行打孔，将琼脂柱放置于无菌空培养皿中，用接种环分别取少量的拮抗菌孢子接在琼脂柱上，26℃静置培养3天；
(4)拮抗菌的筛选
T-37平板制备：取长满根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面试管一只，加入灭过菌的蒸馏水10ml，用枪轻轻吹打并充分混匀，制成细菌菌悬液，取0.1ml接种于平板培养基表面，用L棒均匀涂布；
拮抗菌筛选：将已制备好的拮抗菌琼脂柱分别置于T-37平板上，于4℃冰箱倒扣放置12h后，30℃继续培养48h，室温下观察结果，在琼脂柱周围有一株真菌产生较明显的抑菌圈，命名为xj。
拮抗菌的鉴定：xj菌株在查氏(Czapck)培养基上，26℃，培养10天，菌落直径为4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子头密集着生，除菌落边缘没有分生孢子外，整个菌落都布满了分生孢子结构，菌落背面无色，不分泌色素，气生菌丝发达，从气生菌丝分化出的分生孢子梗由特化的足细胞长出，顶端膨大成球形，表面着生两层分生孢子小梗，次生小梗上着生成串的分生孢子。分生孢子头为黑色，球形，放射状，直径72-220um；分生孢子梗壁厚而光滑，长600-2100μm，宽12-131μm；顶囊近球形，直径40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子为球形至近球形，表面有突起，直径2.4-3μm。
根据Raper(1965)关于曲霉属的分类标准，xj菌株的主要形态特征与他所描述的黑曲霉(Aspergillus niger V.Tieghen 1867)的标准形态基本相同，因而认为xj菌株属于曲霉属黑曲霉群的一株黑曲霉，记为黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)。
通过对抑菌试验来说明本发明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的抑制根癌农杆菌的用途：
(1)发酵液与菌体提取液的制备
将上述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)按10％的接种量接入PDA液体发酵培养基中(200ml培养瓶装入40ml培养基)，26℃，140rpm，摇瓶培养9天，将发酵液与菌丝体一同转入离心管中，2000转/分，离心10min，进行菌液分离，再用蒸馏水重悬菌丝体(加水量为菌丝体5倍)，2000转/分再离心10min，反复4次，分别收集上清液和菌丝体。
双层滤纸过滤上清液，将上清液置于减压真空干燥箱中50℃浓缩10倍，浓缩后的上清液于紫外灯下照射30分钟，置于4℃冰箱备用。
菌丝体于减压真空干燥箱中55℃烘至恒重，再将菌丝研磨成粉，过80目筛，加入20倍无菌水，50℃水浴30min，浸提4次，收集提取液，过滤，浓缩，紫外照射，4℃冰箱保存备用。
(2)用无菌的圆滤纸片(直径0.6cm)，分别吸取发酵上清液与菌体提取液，在酒精灯前略微干燥，轻轻放在T-37平板上，倒置于4℃冰箱12h后，30℃继续培养48h，室温下可分别产生直径为2.4cm与3.8cm的抑菌圈。
Claims (2)
1.一种对根癌农杆菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，保藏号：CCTCC NO：M 206021，其形态特征：xj菌株在查氏培养基上，26℃，培养10天，菌落直径为4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子头密集着生，除菌落边缘没有分生孢子外，整个菌落都布满了分生孢子结构，菌落背面无色，不分泌色素，气生菌丝发达，从气生菌丝分化出的分生孢子梗由特化的足细胞长出，顶端膨大成球形，表面着生两层分生孢子小梗，次生小梗上着生成串的分生孢子；分生孢子头为黑色，球形，放射状，直径72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，长600-2100μm，宽12-13μm；顶囊近球形，直径40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子为球形至近球形，表面有突起，直径2.4-3μm。
2.如权利要求1所述的黑曲霉菌株在抑制根癌农杆菌方面的用途。
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