CN109234210A - 用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备和应用 - Google Patents

用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.16418，保藏日期为2018年9月4日。该菌株对草莓生长过程及采后储存过程中灰霉病的产生均起到较好的防治作用；且该菌株的繁殖速度快，抗逆能力强，安全无毒，不会对环境产生污染，是一种理想的生物杀菌剂来源；基于该菌株的生防菌剂的制备方法简单，能够人工大规模培养，易于实现工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备和 应用
技术领域
本发明属于微生物学科领域，具体涉及一株用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备和应用。
背景技术
草莓是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）多年生常绿草本植物，是在世界范围内广泛栽培的重要经济作物。近年来，随着消费需求的提高，我国的草莓种植面积和产量不断增加，但是草莓的果皮极薄，外皮不能起到很好的保护作用，在采摘和贮运过程中极易受损，受损的草莓果实容易遭受病原菌的侵害而腐烂，进一步侵染同批运送的其他草莓。
灰霉病是草莓生长和采摘后易于爆发的一种常见病害，且危害日益严重，生长期的草莓处于温暖潮湿的环境条件中，十分有利于灰霉病的发生，发生灰霉病后，一般减产20％～30％，重者达50％以上，甚至绝收，主要为害花器、果实、叶柄和叶片，不同部位表现症状不尽相同。采摘后的草莓果实一旦受到灰霉病的侵染也会发生大面积腐烂的现象，造成严重的经济损失。
灰霉病是由灰葡萄孢霉( Botrytis cinerea)引起的，该病原菌的寄主范围极广，不仅会危害草莓，还危害侵染番茄、葡萄、黄瓜等多种经济作物，同时该菌有极强的腐生能力，可以在离体的组织上或土壤中旺盛生长。长期以来，化学药剂仍是防治植物灰霉病的主要措施，常用的药剂有多菌灵、扑海因、嘧霉胺等。值得重点关注的一点是，采后水果病害的防控是病害控制的最后一道防线，目前可使用的杀菌剂非常有限，而灰葡萄孢产孢量大，生长周期短，很容易对杀菌剂产生抗药性，导致防治效果大大下降，并且严重污染农产品和环境，严重的危及人畜的安全健康。
近年来，随着人们生活水平的不断提高、安全健康饮食的意识不断增强，对可食用产品的质量卫生要求越来越高，无公害、绿色食品甚至有机食品逐渐成为食品消费市场的主流，因此，毒害性小的生物防治技术的采用越来越受认可。其中，枯草芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，比较容易在土壤和植物表面定殖、产生抗生素、分泌刺激植物生长的激素，并能诱导寄主产生抗病性，且安全、对人畜无毒无害、不污染环境，是一种理想的微生物杀菌剂。如能应用枯草芽孢杆菌作为草莓灰霉病的拮抗菌将可控制草莓生长中及采后灰霉病的发生及发展，且相对化学药剂的使用而言无试剂残留，更加无毒无害，满足现代人的饮食需求。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一株用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌WZ，在防治草莓灰霉病、草莓采后保鲜中均有重要应用。
本发明的技术方案为：本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)新菌株WZ 已经于2018 年9 月4日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 16418。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ分离自镇江句容白兔镇采集的草莓灰霉病果中。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ在LB 培养基上恒温培养，菌落表面粗糙，不透明，呈现皱缩，白色，能够形成芽孢。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ为需氧型菌株。
该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ可在pH 值为6~8的环境中生长，适宜的生长温度为30~37℃。
以该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ为基础的生防菌剂的制备步骤如下：
1）菌种活化及种子液的制备：将低温保存的菌株WZ接种于LB液体培养基，将培养液于37℃的摇床培养箱中培养24-36小时，至OD600达到0.6-0.8，得到种子培养液；
2）发酵培养：将种子培养液以1-3%的接种量接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵液中菌株WZ的浓度至1×108~1×109 CFU/mL，获得所述生防菌剂。
发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，pH=7.2-7.4
该种用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ在防治草莓灰霉病和草莓采后保鲜中均有重要应用。
所述应用具体包括：
（1）制备含所述枯草芽孢杆菌WZ的生防菌剂；
（2）将所述的生防菌剂喷施在生长期的草莓植株上或浸泡采摘后的草莓。
喷施生防菌剂时，喷施至植物表面水珠流动即可。
本发明的有益效果是：
分离的枯草芽孢杆菌WZ对草莓生长过程及采后储存过程中灰霉病的产生均起到较好的防治作用；且该枯草芽孢杆菌WZ的繁殖速度快，抗逆能力强，安全无毒，不会对环境产生污染，是一种理想的生物杀菌剂；该枯草芽孢杆菌WZ生防菌剂的制备方法简单，能够人工大规模培养，易于实现工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌WZ拮抗草莓灰霉病菌的抗性平板图；
图2是基于16S rRNA 基因序列的枯草芽孢杆菌WZ系统发育树；
图3是枯草芽孢杆菌WZ的纯培养菌落图；
图4是不同浓度的枯草芽孢杆菌WZ生防菌剂对草莓腐烂率影响的统计图；
图5是枯草芽孢杆菌WZ的16S rRNA基因测序。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
实施例1：一株用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 16418，保藏日期为2018年9月4日。
枯草芽孢杆菌WZ菌株的采集、分离和鉴定
(1) 枯草芽孢杆菌WZ分离自镇江句容白兔镇采集的草莓灰霉病果中，首先切取患有灰霉病的草莓果实的未患病部分，用70%酒精对其表面进行消毒，然后在无菌的条件下进行研磨；用梯度稀释法在LB培养基中进行筛选；
(2)平板上出现单一菌落后，根据菌落形态、颜色的差异区分不同菌落，用接种环分别挑取不同菌落在PDA固体培养基平板上划线培养；
(3)进行拮抗菌初筛：取大小基本一致的灰霉菌块置于PDA平板中央，用接种环取划线培养的细菌在霉菌菌块周围划一条较短的线，在该平板上共做四种细菌的划线，置于25℃恒温培养箱培养3-5天，选出对病原菌生长有抑制作用，且被抑制病原菌菌丝边缘平齐，拮抗作用持久的细菌；
(4)进入拮抗菌复筛：采用对峙培养法，取大小一致的霉菌菌块置于PDA平板中央，用接种环挑取拮抗性好的细菌点接在距平板中央3 cm处的4个角点上，置于25℃培养箱培养3-5天，观察抑菌圈大小(细菌菌落中心至病原菌菌丝边缘)；
(5)对抑菌圈较大的拮抗菌用平板画线法进行纯化，先在平板上画一条线，然后将接种环上残菌烧掉，待接种环冷却后从上一条线的末端开始再画一条线，按此步骤连续画4-5条线，倒置于37℃恒温培养箱培养1至2天，长出单一菌落后按上述对峙培养法再做一次对峙实验；
(6)重复上述步骤(5)，即可培养出下一代细菌，连续继代培养3-4代，得到拮抗性能较好的菌株。
将分离得到的枯草芽孢杆菌WZ在LB培养基上进行恒温培养，如图3所示，菌落表面粗糙，不透明，呈现皱缩，白色，能够形成芽孢，需氧型。
枯草芽孢杆菌WZ可在pH 值为6～8环境中生长；适宜生长温度为30℃～37℃。
提取新菌株WZ的DNA，经PCR反应确定片段后进行16S rRNA基因测序，序列长度为1389 bp（如图5所示），序列在NCBI网站Blast比对并构建系统发育树（图2），从发育树结果结合形态观察和生理生化实验，确定新菌株WZ为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
实施例2 生防菌剂的制备
（1）将生防菌株WZ接种到LB 培养液中，37℃，220 r/min 振荡培养，24-36 小时后在超净工作台中分别取样测600 nm 处的OD值；
（2）当振荡培养至菌液的OD 值为0.6-0.8 之间时即为种子菌液，以1%的接种量接种至LB培养液（培养液组成为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L， pH 为7.2-7.4）中培养，培养液温度为37℃，天数为2天，转速为220 rpm，pH值为7.2-7.4。发酵培养后，加入5%的蔗糖，然后过滤并调节菌液细胞数为109 个/mL，即制得本发明的枯草芽孢杆菌WZ的生防菌剂。
实施例3 生防菌剂WZ对草莓采后自然腐烂率的影响
分别配制 1×107、1×108、1×109 CFU/ mL的枯草芽孢杆菌菌悬液, 以无菌水作对照。草莓果实不经消毒和清洗，直接在上述3种不同浓度的拮抗菌菌悬液或无菌水中浸泡1min，晾干后置于20℃下贮藏。4 d后测定果实的腐烂率。每组处理30个果实，重复 3 次。
结果如图4所示，从图中可以看出不同浓度的生防菌对草莓果实的腐烂均有一定的抑制作用，且随着菌悬液浓度的升高，对草莓果实腐烂的抑制作用越为明显，说明该生防菌剂可用于草莓的采后保鲜中。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (5)

1.用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ，于2018年9月4日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 16418。
2. 如权利要求1所述的用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ，其特征在于，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ分离自镇江句容白兔镇采集的草莓灰霉病果中；接种在LB培养基上恒温培养，菌落表面粗糙，不透明，呈现皱缩，白色，能够形成芽孢；可在pH值为6~8的环境中生长，适宜的生长温度为30~37℃。
3. 如权利要求1所述的用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ生防菌剂的制备方法，其特征在于，具体的制备步骤为：
1）菌种活化及种子液的制备：将低温保存的菌株WZ接种于LB液体培养基，将培养液于37℃的摇床培养箱中培养24-36小时，至OD600达到0.6-0.8，得到种子培养液；
2）发酵培养：将种子培养液以1-3%的接种量接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵液中菌株WZ的浓度至1×108~1×109 CFU/mL，获得所述生防菌剂。
4. 如权利要求3所述的用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ生防菌剂的制备方法，其特征在于，发酵培养基的配方为：1000 mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，pH=7.2-7.4。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的用于拮抗草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株WZ在防治草莓灰霉病和草莓采后保鲜中的应用。
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