CN103981137A - 一株拮抗枣缩果病病原菌的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株防治枣缩果病的拮抗菌菌株及其应用。本发明拮抗菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45，微生物保藏号为CGMCC No.9026。本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45是从健康枣树根部土壤中分离而获得，对枣树的枣缩果病菌的拮抗作用显著而且高效，可以有效的抑制枣缩果病病原菌细极链格孢菌菌丝的生长，可以防治枣缩果病原菌引起的植物病害，而且本发明的菌株可以用于防治枣缩果病的多种病原菌及枣果炭疽病和其它多种树木病害等方面，是一株防效高，环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株拮抗细菌菌株，特别涉及一株拮抗枣果实病害多种病原真菌的拮抗细菌及其应用。属于微生物领域，可用于林木、农作物保护，防治病害。
背景技术
枣树是我国最具代表性的民族果树之一，特别在山、沙、碱、贫地区对农民脱贫和财政自立中占有特殊的重要地位。20世纪50年代，一批严重影响枣生产的病害相继报道，其中以真菌引起的病害占90％以上。而枣疯病、枣缩果病和枣裂果病等危害最为严重。相对于由植原体Phytoplasma引起的枣疯病及生理性病害枣裂果病而言，枣缩果病是枣树三大病害中病原(涉及细菌、真菌及环境等多种因素)最繁杂、最难以综合治理的一种。枣缩果病又名枣铁皮病、枣干腰病、枣萎蔫果病、枣雾蔫病、枣黑斑病和枣褐腐病等。据2008年张潮红、2010年李东霞等报道，除细菌噬枣欧文氏菌Erwinia jujubovora Wang cai Feng et Gao，枣缩果病病原多为真菌，如：细极链格孢菌Alternaria tenuissima(Kunze)Wiltshire、链格孢菌A.alternata(Fr.)Keissler.、轮纹大茎点霉菌Maxrophoma hawatsuhaiHara.、聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria Sacc.、盾壳霉菌Coniaothyrium olivaceumBon和毁灭茎点霉菌Phoma destructive Plowr、七叶树壳梭孢菌Fusicoccum aesculiCorda(现拉丁名为Neofusicoccum ribis(Slippers,Crous&M.J.Wingf.)Crous,Slippers&A.J.L.Phillips)和头状茎点霉菌Phoma glomerata(Corda)Wollenw.&Hochapfel等。枣缩果病广泛分布于河南、河北、山西、陕西和新疆等枣主产区，具有发病快、集中暴发和易流行等特点；自20世纪70年代以来，在我国各大枣产区屡有发生，造成枣果品质降低、产量下降，直接制约枣营养价值和经济价值，严重威胁枣产业可持续发展，成为枣高产、稳产的最大阻碍。因此，提出同时高效防治枣缩果病多种病原菌的措施已成为枣产业亟待解决的难题。
目前，随着病害的深入研究，通过物理、化学、生物防治及抗病种质筛选等方法防治枣缩果病呈多元化趋势。其中，选育高抗品种(如曙光2号)防治枣缩果病，利用植物提取物(如万寿菊乙酸乙酯粗提物)抑制枣缩果病病原菌等方法已见成效，但存在生产周期较长，开发成本高等局限性。通过化学试剂防治枣缩果病在实际应用中最为普遍。由于长期应用化学药剂会造成病原菌产生抗药性，导致药效降低、成本高、环境污染和果实农药残留问题。本世纪人们的食品消费取向焦点集中在安全食品和生态环保产品，因此，将生物防治方法应用在枣缩果病防治中，不仅环保健康，而且不降低经济效益。
近年来，将微生物应用于枣病害防治已有报道。据报道，通过筛选拮抗细菌和拮抗酵母菌能有效抑制采摘后冬枣病害的发生。应用纳他霉素防治冬枣浆胞病已取得成效。采用明龟裂链霉菌防治灰枣红点软腐病菌(Botryosphaeria dothidea(Moug.exFr.)Ces.et de Not.)效果最好。将罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii(Kufferath)Skinner)和醚菌酯结合使用，对采摘后枣果褐腐菌(Monilinia fructicola)防治效果显著提高，上述研究成果为将生物防治方法应用于防治枣缩果病提供了思路。运用生防制剂防治枣缩果病不仅有益于打造健康枣产品，而且保护生态环境，并有助于可持续发展综合防治。本发明通过筛选拮抗细菌防治枣缩果病病原细极链隔孢菌；与此同时，研究该生防菌株对枣树其他病害病原真菌的防治作用。
发明内容
本发明目的之一是针对现有枣缩果病防治存在的技术问题提供一株能高效防治引起枣缩果病的多种病原菌的拮抗细菌菌株--枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisSTO-45，本发明的拮抗细菌菌株Bacillus subtilis STO-45是从健康枣树根部土壤中分离筛选获得的生防细菌菌株，本发明的菌株对枣缩果病病原菌细极链格孢菌(A.tenuissima)具有高效拮抗作用，应用本发明的拮抗细菌菌株Bacillus subtilisSTO-45能解决目前化学防治枣缩果病方法中农药残留、污染环境的问题，并且本发明的拮抗细菌菌株还能防治由多种病原引起的枣缩果病、胶孢炭疽菌引起的枣果炭疽病以及由黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌、桃干枯病菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌等引起的相关树木病害。
本发明的目的之二是提供上述拮抗细菌菌株Bacillus subtilis STO-45在防治枣缩果病方面的用途，尤其是拮抗细菌菌株Bacillus subtilis STO-45在防治枣缩果病、枣炭疽病，以及由黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌、桃干枯病菌，尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌引起的相关树木病害方面的多种应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供的一株细菌菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45，其微生物保藏号是：CGMCC No.9026；分类命名是：Bacillus subtilis；保藏时间：2014年4月9日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
其中，所述细菌菌株具有拮抗枣缩果病病原菌的作用，能够高效防治枣缩果病。
本发明所述细菌菌株的形态特征：
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45为革兰氏阳性杆菌，大小为0.5μm-0.8μm×2.0μm-3.1μm，无荚膜，芽孢中生，周生鞭毛，能运动。菌体在NA平板培养基上呈白色，不透明，粘稠，多数表面干燥光滑，边缘圆滑。
本发明的细菌菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的分离筛选方法：
1、取健康枣树根际土壤5g，置于灭菌的三角烧瓶中，用50mL无菌水浸泡土壤，于室温轻微震荡24h后取1ml悬浊液，采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-7、10-8、10-9浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中，28℃恒温倒置培养；
2、连续观察1-3d，挑取不同培养形态单菌落，在平板上进行划线纯化培养，获得多株健康枣树根际土壤细菌菌株，于4℃保藏备用；
3、将细极链格孢菌株接种于马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在25℃条件下，恒温培养7d后用0.5cm打孔器打取菌饼，并将细极链格孢菌菌饼置于另一PDA平板中央，并在距离菌饼2cm处的2个点对称接种步骤2)中分离并纯化的细菌，放置于恒温培养箱中25℃培养；
4、培养7d后观察并记录抑菌带的有无及大小，选出对细极链格孢菌具有最强抑制效果，抑菌带最宽的菌株。
观察结果表明STO-45菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，平均达0.7cm。
本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的筛选及防治枣缩果病病原菌特性测定采用的培养基配方如下：
NA培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉20g，水1000ml，pH7.0-7.2；
NB培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，水1000ml，pH7.0-7.2；
马铃薯琼脂(PDA)平板培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，自来水1000ml，自然pH；
基础培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，NaCl5g，KH2PO41g，K2HPO42g，水1000ml，pH7.0-7.2。
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株的培养特性及生理生化特性如下：
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45最适培养基为NA培养基，培养温度为25-43℃，最适生长温度为35℃；能够在NaCl浓度为2％-10％的培养基中生长，最适NaCl浓度为7％-10％；氧化酶反应、接触酶反应、V-P反应、产吲哚试验、硝酸盐还原反应、酪蛋白水解、明胶液化、淀粉水解、纤维素水解、果胶水解反应均呈阳性，甲基红试验呈阴性，能够利用葡萄糖发酵产酸、甘露醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵产酸，能够利用柠檬酸盐和丙酸盐。
根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株STO-45的形态特征、生理生化特性以及系统发育分析，鉴定菌株STO-45为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn。
本发明的细菌菌株还包括以上所述细菌菌株的能高效防治枣缩果病病原菌的菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45，微生物保藏号为CGMCC No.9026的各种代谢产物。
还包括：以所述菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45，微生物保藏号CGMCC No.9026为活性成分的生物菌剂。
特别是，所述菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
本发明细菌菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45通过培养得到的培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液，用于拮抗枣缩果病的病原菌的处理。
其中，所述细菌菌株发酵培养过程中使用的培养基为基础培养基。
特别是，所述基础培养基配方如下：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，NaCl5g，KH2PO41g，K2HPO42g，水1000ml，pH7.0-7.2。
液体培养时将本发明的菌株按5％(v/v)的接种量接入装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在往复式摇床(200rpm)上28℃下，进行恒温发酵培养，培养3天后，发酵液、发酵液离心处理后的上清液、上清液采用无菌滤膜过滤后的无菌滤液、发酵混合物即可用于拮抗枣缩果病病原菌。
所述应用包括抑制枣缩果病的病原菌；致畸枣缩果病的病原菌的菌丝；抑制枣缩果病的病原菌菌丝生长。
抑制枣缩果病病原菌是指抑制枣缩果病病原菌的生长，降低枣缩果病病原菌菌丝生长速率，本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株显著降低枣缩果病病原菌的生长速率，菌落生长速率，拮抗菌对枣缩果病病原菌菌丝生长量的抑制明显，抑制效率达90％以上。
本发明的生防菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的次生代谢产物对枣缩果病菌(尤其是细极链隔孢菌)菌丝生长抑制率达90％。
致畸枣缩果病病原菌的菌丝指：拮抗菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45无菌发酵滤液处理的枣缩果病病原菌的菌丝膨大，变短加粗，甚至破裂。
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液、发酵培养液离心处理后的上清液、发酵培养液采用无菌滤膜过滤后的无菌滤液对引起枣缩果病的细极链格孢菌A.tenuissima、链格孢菌A.alternara、七叶树壳梭孢菌Fusicoccum aesculi、头状茎点霉菌Phmoa glomerata；引起枣果炭疽病的胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz)Sacc.；引起苹果腐烂病的黑腐皮壳菌Valsa ceratosperma(Tode)Maire、苹果黑腐皮壳菌Valsamali Migabe&G.Yamada；引起桃干枯病的桃干枯病菌Leucostoma persoonii(Nitschke)以及引起黄栌枯萎病的尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Schl.、腐皮镰刀菌Fusarium solani(Mart.)Sacc.均具有明显抑制作用。
本发明细菌菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45在拮抗病原菌中的应用，其中，所述的病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌、胶孢炭疽菌、黑腐皮壳菌、核果黑腐皮壳菌、苹果壳囊孢菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
另一方面，本发明细菌菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的突变体、变异体或其衍生物、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液在拮抗病原菌中的应用，其中，所述的病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌、胶孢炭疽菌、黑腐皮壳菌、核果黑腐皮壳菌、苹果壳囊孢菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
其中，所述拮抗病原菌包括抑制病原菌的生长、致畸病原菌的菌丝，其中所述病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌，胶孢炭疽菌，黑腐皮壳菌、苹果壳囊孢菌，核果黑腐皮壳菌，尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
特别是，拮抗引起枣缩果病的细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌；引起枣果炭疽病的胶孢炭疽菌；引起苹果腐烂病的黑腐皮壳菌、苹果壳囊孢菌；引起桃干枯病的核果黑腐皮壳菌；引起黄栌枯萎病的尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
特别是，拮抗病原菌细极链格孢菌感染导致的枣缩果病；拮抗所述链格孢菌、七叶树壳梭孢、头状茎点霉菌感染导致的枣缩果病；拮抗所述胶孢炭疽菌感染导致的枣炭疽病；拮抗所述黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌感染导致的苹果腐烂病；拮抗所述桃干枯病菌感染导致的桃干枯病；拮抗所述尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌感染导致的黄栌枯萎病。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45发酵液抑菌显微观察试验证明：本发明生防菌株能作用于细极链隔孢菌菌丝并使其膨大畸形，几乎爆裂。
本发明的拮抗枣缩果病病原菌的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45在防治枣缩果病方面的作用极为显著，对枣缩果病病原菌有很强的抑制作用，能明显抑制枣缩果病病原菌菌丝的生长，并使菌丝畸变，也能明显抑制枣缩果病多种病原菌：链格孢菌、七叶树壳梭孢、头状茎点霉菌；引起枣炭疽病的病原菌胶孢炭疽菌；苹果腐烂病原菌：黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌；桃树干枯病的病原菌桃干枯病菌；黄栌枯萎病病原菌：尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌：同时具有良好的防治枣缩果病、枣炭疽病以及防治苹果腐烂病、桃干枯病、黄栌枯萎病的潜力。它作为一种生物防治菌株，为用于防治由细极链格孢、链格孢菌、七叶树壳梭孢、头状茎点霉菌引起的枣缩果病，胶孢炭疽菌引起的枣炭疽病，黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌引起的苹果腐烂病，桃干枯病菌引起的桃干枯病，尖孢镰刀菌及腐皮镰刀菌引起的黄栌枯萎病提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。
附图说明
图1是本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45显微形态图；
图2是本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45在NA平板培养基的菌落形态图；
图3是基于16S rDNA序列的系统发育树；
图中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。
STO-45和其克隆STO-45-1与模式菌株HE582781聚在同一个大的分支内，但两菌株在大分支内部形成独立分支。
图4是本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45发酵液对病原菌细极链隔孢菌(Alternaria tenuissima)的抑制活性；
CK为无菌NB培养基空白对照，细极链隔孢菌菌丝正常生长；a为菌株STO-45发酵液；b为菌株STO-45发酵上清液；c为菌株STO-45无菌发酵液；a、b、c细极链隔孢菌菌丝生长速率较CK降低。
图5本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的平皿抑制试验结果；其中：a为无菌的基础培养基空白对照；b-h依次为浓度1‰、2‰、4‰、5‰、8‰、10‰、20‰菌株STO-45无菌发酵液对细极链隔孢菌菌丝生长速率的抑制效果；
图6本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45不同浓度无菌滤液对病原菌细极链隔孢菌的抑菌率试验结果：随着滤液浓度增加，同一培养时间细极链隔孢菌菌落直径减小，抑菌率增加，最终抑菌率达90％；
图7本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45对细极链隔孢菌菌丝生长和对形态影响的试验结果，其中A为无菌的基础培养基空白对照，正常菌丝生长粗细均匀，有隔膜但分隔间距长；B-D为2d后菌株STO-45无菌发酵液对细极链隔孢菌菌丝的影响。B菌丝严重膨账，趋于破裂；C菌丝分隔间距缩短变粗；D菌丝分隔间距缩短变粗，甚至出现膨胀。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
下述实施例中的方法，无特别说明，均为微生物学常规操作方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为体积百分含量。
实施例1枣缩果病菌拮抗菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的分离、筛选与鉴定
1)枣树枣缩果病菌拮抗细菌Bacillus subtilis STO-45的分离
本发明的菌株采自新疆和田地区和田县伊里其乡依盖其村的健康枣树根系土壤。
1A)称取健康枣树根际土壤5g，置于灭菌的三角烧瓶中，用50mL无菌水浸泡土壤，于室温轻微震荡24h后取悬浊液1ml，采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9浓度梯度的稀释液，分别从10-7、10-8、10-9浓度梯度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养；连续观察1-3d，挑取不同培养形态单菌落，在平板上进行划线纯化培养。每个处理设置水平重复3组，NA平板培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉20g，水1000ml，pH7.0-7.2；
1B)将所有纯化获得的健康枣树根际土壤细菌菌株于4℃下保藏，备用。
2)拮抗细菌筛选：
2A)将细极链格孢菌株(提供自中国林业微生物保藏管理中心，保藏编号cfcc87968)接种于马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在25℃条件下，于恒温箱中培养7d，然后用0.5cm打孔器打取菌饼，并将菌饼置于另一PDA平板中央，并在距离菌饼2cm处的2个对称点接种步骤1)中分离并纯化的细菌，放置于恒温培养箱中25℃培养，设置水平重复3组，其中，PDA平板培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，自来水1000ml，自然pH；
2B)培养7d后观察并记录抑菌带的有无及大小，选出对细极链格孢菌具有最强抑制效果、抑菌带最宽的菌株，结果表明STO-45菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，平均达7mm。
3)菌株种属常规鉴定
参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社,2001:349-398)以及蔡妙英等人编著的《芽孢杆菌属》(北京:农业出版社,1983:19-108)中介绍的方法对STO-45菌株的形态及生理生化特性进行测定，测定结果如下：
3A)通过显微镜观察表明：STO-45菌体为杆状，大小为0.5μm-0.8μm×2.0μm-3.1μm，无荚膜，芽孢中生，周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性，如图1所示；
3B)STO-45菌株在NA平板培养基上生长24h后，菌落呈白色，不透明，粘稠，多数表面干燥光滑，边缘圆滑，如图2所示；
3C)生理生化特征见表1：
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
16S rDNA鉴定，以菌株STO-45和克隆菌株STO-45-1(即将4℃保藏的菌株STO-45同时接种活化于两个培养皿中)的活化物的DNA为模板，采用以下引物对：
正向引物(forward primer)63f(5'-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3')；
反向引物(reverse primer)1387r(5'-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3')(参见Marchesi JR等，Design and evaluation of useful bacterium-specific PCRprimers that amplify genes coding for bacterial16S rRNA，Applied andenvironmental microbiology,1998,64(2):795-799)进行PCR扩增反应，其中PCR扩增反应体系包含有10×TaqE缓冲液2μL、dNTP1.6μL、正反向引物各1μL、DNA Taq聚合酶0.1μL、DNA模板1μL，最后用去离子灭菌超纯水调整反应总体积为20μL；PCR反应条件：94℃预变性3min，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环。循环结束后72℃稳定10min，最后系统温度降至4℃，反应结束。
PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测得的序列用软件BioEdit编辑后，登陆NCBI基因库进行同源性比对分析，采用PAUP软件的最大简约法(Maximum-parsimony；MP)构建系统发育树(Hassan MA等，Productionand characterization of keratinolytic protease from new wool-degrading Bacillusspecies isolated from Egyptian ecosystem,Biomed research international,2013,http://dx.doi.org/10.1155/2013/175012及Didari M等，Alteribacillus bidgolensis gen.nov.,sp nov.,a moderately halophilic bacte-rium from a hypersaline lake,andreclassification of Bacillus persepolensis as Alteribacillus persepolensis comb.nov.,International journal of systematic and evolutionary microbiology,2012,62(11):2691-2697)。
基于系统发育分析(见图3)，菌株STO-45及其克隆菌株STO-45-1与菌株HE582781(枯草芽孢杆菌模式)聚在同一个大的分支内(支持率100％MP，1.00BPP)，结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌。但两菌株在大分支内部形成独立分支(支持率98％MP，1.00BPP)，说明该生防菌株与模式菌株不完全相同。
结合《常见细菌鉴定手册》，对照菌株STO-45的形态特征及生理生化特性及系统发育分析，确认本发明菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45。
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株已于2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No.9026。
本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株的保藏培养基为常规NA培养基，培养温度28℃。
实施例2枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株的发酵液抑菌活性测定
1、制备发酵液的无菌滤液
1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌苔，接种于盛有150mL NB培养基的250mL三角瓶中，28℃、200r/min振荡培养24h，获得的菌悬液作为种子液，其中NB培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，水1000ml，pH7.0-7.2；
1B)按5％(V/V)的接种量将种子液转接至含100mL基础培养基的250mL三角瓶中，28℃、200r/min振荡、发酵培养，其中基础培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，NaCl5g，KH2PO41g，K2HPO42g，水1000ml，pH7.0-7.2；
1C)将发酵培养72h后发酵液进行离心处理(13000r/min，离心10min)，获得离心上清液，然后取上清液用0.45μm无菌滤膜过滤，获得无菌滤液；
2、对细极链隔孢菌的活性抑制
通过平板对峙法，检测发酵液、离心上清液及无菌滤液对细极链隔孢菌的抑制效果。
2A)将活化后的细极链格孢菌株接种于马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在25℃条件下，于恒温箱中培养7d，然后用0.5cm打孔器打取菌饼，将菌饼置于另一装有PDA平板的直径为9cm的培养皿的中央，于25℃条件下恒温培养；
2B)培养1.5-2d后用直径为0.5cm的打孔器在距病原菌菌饼2cm的四个方向(上、下、左、右4个方向)各打一个孔，分别注入NB培养基(作为空白对照)、步骤1制备的发酵液、离心上清液、无菌滤液各20μL，然后置于25℃恒温培养箱中培养，连续观察，设置两组平行对照，观察4d后，结果如图4：菌株STO-45的发酵液、离心上清液及无菌发酵滤液对细极链隔孢菌均具有明显抑制活性。
3、对病原菌细极链隔孢菌的抑菌率测定
3A)趁热将PDA培养基分别与步骤1C)制备的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisSTO-45的无菌发酵滤液混合均匀，获得浓度分别为1‰、2‰、4‰、5‰、8‰、10‰、20‰的培养基(其中浓度为1‰的培养基中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisSTO-45的无菌发酵滤液的体积与培养基(液态时的)总体积之比为1：1000；以上浓度2‰、4‰、5‰、8‰、10‰和20‰的培养基中枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis STO-45的无菌发酵滤液的体积与培养基(液态时的)总体积之比依次分别为2：1000、4：1000、5：1000、8：1000、10：1000和20：1000)将上述培养基摇匀后倒平板，即倒入培养皿中，备用；
3B)以不接种拮抗菌的液体培养基与PDA培养基混合，作为空白对照CK；
3C)将细极链格孢菌株接种于马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在25℃条件下，于恒温箱中培养7d，接着用0.5cm打孔器在菌株边缘打取菌饼，然后将菌饼置于3A)制备的PDA平板中央，于25℃条件下恒温培养7d，观察滤液抑菌效果，测量菌落直径计算抑菌率，设置三组平行对照，抑菌试验结果如图5、6所示：
细极链隔孢菌在含有不同浓度枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的无菌滤液平板上生长受到不同程度的抑制(图5、6)，并且抑制效果与滤液浓度呈正比，10‰、20‰浓度的滤液抑菌率达90％以上(如图6)。
4、发酵液对病原菌细极链隔孢菌菌丝的影响
4A)在无菌培养皿底加入5ml无菌水后放入无菌滤纸，将两根无菌木条放于滤纸上备用；
4B)将步骤1C)制备的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45的无菌滤液与PDA培养基以5:1000混匀后倒入培养皿中，制得平板(厚度不大于2mm)，划取1cm边长的培养基块置于无菌载玻片上；
4C)将活化后的细极链格孢菌株接种于PDA平板上，在25℃条件下，于恒温箱中培养5d后挑取细极链格孢菌菌丝，接种于步骤4B)制备的培养基块上，盖上无菌盖玻片。放于步骤4A)准备的培养皿中的木条上，合盖置于恒温培养箱内，于25℃下恒温培养于滤纸保湿培养皿中，每12h镜检观察。
以未接菌的基础培养基代替无菌滤液为空白对照。培养2d后的显微镜镜检结果如图7所示：
空白对照的细极链隔孢菌的菌丝生长良好，细胞形态长而均匀，如图7A；采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45无菌发酵滤液处理后的细极链隔孢菌菌丝生长受到抑制，变短加粗(图7C、D)，明显膨胀(图7B、D)，甚至破裂
(图7B)。试验结果说明本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株发酵产物含有抑菌活性物质。
实施例3枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45对枣树多种病害及其他树木病原真菌拮抗效果试验
1)挑取在NA培养基上培养24h的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌苔于盛有150mL NB培养基的250mL三角瓶中，28℃200r/min恒温摇培24h，获得的菌悬液作为种子液，其中NB培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，水1000ml，pH7.0-7.2；
2)按5％(V/V)的接种量将种子液转接至含100mL基础培养基的250mL三角瓶中，28℃、200r/min振荡、发酵培养，其中基础培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，NaCl5g，KH2PO41g，K2HPO42g，水1000ml，pH7.0-7.2；
3)将发酵培养72h后的发酵液进行离心处理(13000r/min，离心10min)，获得离心上清液，然后取上清液用0.45μm无菌滤膜过滤，获得无菌滤液，备用；
4)将表2中所述9种病原菌活化后分别接种于马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在25℃条件下，于恒温箱中培养5-7d后，分别用直径0.5cm打孔器打取PDA平板上病原菌菌饼，将菌饼分别移至相应的9cm PDA平板中央，并在距离菌饼2cm处的2个对称点放置直径0.5cm无菌滤纸圆片，将5μL步骤3)制备的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45无菌滤液接种在无菌滤纸圆片中央，水平重复3组，于25℃条件下恒温培养，7d后观察并记录抑菌圈有无及大小；
以无菌水代替无菌滤液接种在无菌滤纸圆片中央，作为空白对照。
测定结果如表3所示，接种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45无菌滤液后，抑菌圈最大不超过40mm。
由表2、3可知：本发明的生防菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45对引起枣缩果病的多种病原菌具抑制作用；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis STO-45菌株对枣树其他病害及由相同病原引起的其他树木病害均具有抑制作用。该研究结果表明该菌株具有潜在应用价值。
Claims (10)
1.一株细菌菌株(Bacillus subtilis STO-45)，其微生物保藏号为CGMCC No.9026。
2.权利要求1所述的细菌菌株的突变体、变异体或其衍生物。
3.如权利要求1所述的细菌菌株得到的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。
4.如权利要求2所述的细菌菌株的突变体、变异体或其衍生物得到的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。
5.权利要求1所述的细菌菌株为活性成分的生物菌剂。
6.权利要求1所述的细菌菌株在拮抗枣缩果病中的应用。
7.权利要求1所述的细菌菌株在拮抗病原菌中的应用，其中，所述的病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌、胶孢炭疽菌、黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌、桃干枯病菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
8.权利要求2所述的细菌菌株的突变体、变异体或其衍生物在拮抗病原菌中的应用，其中所述病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌、胶孢炭疽菌、黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌、桃干枯病菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
9.如权利要求3或4所述的菌株培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液在拮抗病原菌中的应用，其中，所述病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌、胶孢炭疽菌、黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌、桃干枯病菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
10.如权利要求7、8或9所述的应用，其特征是所述拮抗病原菌包括抑制病原菌的生长、致畸病原菌的菌丝，其中所述病原菌为细极链格孢菌、链格孢菌、七叶树壳梭孢菌、头状茎点霉菌、胶孢炭疽菌、黑腐皮壳菌、苹果黑腐皮壳菌、桃干枯病菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌。
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