CN102876767A - 一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其中，按照下列步骤操作：a.在一种琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；b.于查彼培养液中振荡培养赤星病菌；c.粗提赤星病菌毒素；d.用生物测定的方法确定毒素的活性；e.加水稀释毒素液并制作培养基；f.121℃湿热灭菌含毒素培养基15-30min；g.消毒烟草种子；h.于毒素培养基上培育烟草种子；i.根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。本发明利用烟草赤星病菌产生的毒素制作含毒素培养基，并在此培养基上培养烟草品种的种子，能够快速、经济、方便、可靠的直接从烟草种子中筛选出烟草抗赤星病的种质材料，本方法能够替代田间试验筛选，在培养皿中即可完成筛选烟草抗赤星病种质材料。
Description
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法。
背景技术：
赤星病(Alternaria alternata)是一种重要的烟草叶斑病，烟草赤星病的病原为链格孢菌(Alternaria alternata(Fries)Keissler)，属半知菌亚门(Deuteromyccotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetoles)，链格孢属(Alternaria)。菌丝无色透明，有分隔。分生孢子单生或成串生长于分生孢子梗上，分生孢子梗聚集成堆，顶端弯曲，不规则，孢子呈倒棒锤形，有纵、横分隔，纵格1-3个，横格3-7个；在孢子链末端的分生孢子较小，椭圆形，只有一个分隔。分生孢子的大小形状，因其菌龄和产生孢子时间长短不同差异很大。烟草赤星病菌只能侵染烟属植物，其中普通烟亚属和黄花烟亚属比碧冬烟亚属更感病。但接种试验证明，赤星病菌可侵染19科56种植物，如茄科的马铃薯、番茄、茄子、辣椒、龙葵、曼陀罗、木氏蓼，酸浆属的大千生，以及烟田的一些杂草等可被侵染。
1892年美国首次报道发现该病，随后一直属于美国烟草上的次要病害，但是1956年该病在美国北卡罗来纳州突然爆发流行，随后一段时间内成为美国各烟区的毁灭性病害。至今，赤星病在世界各国均有发生，20世纪60年代和80年代曾在我国烟草上大发生，给我国的烟叶生产带来了巨大的损失，近几年在我国部分烟叶产区再度流行。如，烟草赤星病在山东俗称“红斑”，河南、安徽、辽宁俗称“斑病”，云南称“恨虎眼”，贵州称“火炮斑”。是一种广泛发生于世界各烟区的严重病害。赤星病不仅使烟叶残缺不全，在烘烤过程中病斑仍继续扩大，使烘烤叶片颜色不匀、叶片厚薄不均，等级下降，而且由于内在品质不协调，如总氮、蛋白质升高，总糖、还原糖降低，糖碱比值下降，使吃味变差，降低了工业使用价值。因此，选择与培育抗赤星病的烟草品种是防治该病的当务之急，也是防治该病最经济与有效的途径。
为了培育烟草抗赤星病的品种，需要不断地挖掘抗源，鉴定出抗烟草赤星病的种子材料。目前，烟草品种抗赤星病的常规鉴定方法主要有2种，一种是离体叶片法，另一种是幼苗浸根法。上述方法都是利用烟株，并且需要待植株长到一定大小才能开展。如，离体叶片法鉴定一个抗病品种需要时间很长，要等到烟株成熟时开展。再如，幼苗浸根法是利用烟草赤星病菌产生的毒素，浸泡烟株的根，很难排除毒素液中杂菌对植株幼根生长的影响。因此这些鉴定方法都存在着较大缺陷。为了快速培育抗赤星病的烟草品种，迫切需要一种快速、经济、方便、可靠的方法来解决这一技术难题。
寄主专化性毒素(Host Specific Toxins，HST)，是特定植物病原真菌产生的一类对其寄主植物种类或者栽培品种具有特异性生理活性和高度专化性作用的代谢产物，寄主专化性毒素是直接决定植物病原真菌致病性的重要因素。烟草赤星病菌能够产生寄主专化性毒素。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，发明一种利用烟草赤星病菌产生的毒素制作含毒素培养基，并在此培养基上培养烟草的种子，从而直接从烟草种子中筛选出烟草抗赤星病种质材料的快速、经济、方便、可靠的方法。
为实现上述目的，本发明公开了一种在培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其中，按照下部步骤操作：
a、在一种琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；
b、将直径为5mm的烟草赤星病菌菌饼接种于250ml查彼培养液中，28℃振荡培养28-30d；
c、纱布过滤除去菌丝体，再经3-5次离心，8000r/分钟，镜检无细胞，获得毒素粗提液；
d、用生物测定的方法确定毒素的活性；
e、用水将毒素粗提液稀释2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0％(W/V)琼脂配成含毒素培养基；
f、121℃湿热灭菌含毒素培养基15-30min；
g、消毒烟草种子；
h、用镊子将消毒后的烟草种子夹取到含毒素的培养基上，封口膜封口，于25-28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；
i、根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。
步骤b进一步包括配制查彼培养液：
步骤d用生物测定的方法确定毒素的活性，具体为：取6-8叶期的感病品种NC89烟苗，在成熟伸展的叶片背面用注射器的针头轻轻刺破叶片表皮，用去掉针头的注射器吸取毒素滤液，然后轻轻将毒素从刺破部分注入烟草叶片，以两叶脉间约1/3充满毒素滤液且不溢出叶脉为宜，以培养液和清水同样处理为对照。处理48h后观察，以注射部位出现坏死斑为毒素具有活性的标志。
步骤g、消毒烟草种子具体为：烟草种子80-100粒倒入1.5mL离心管，加75％(V/V)酒精中浸泡30s，吸出后无菌水换洗2次；加10％(V/V)双氧水浸泡10min，无菌水换洗5次。
步骤a进一步包括培养赤星病菌的步骤：于一种琼脂培养基上培养赤星病菌，待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼用于步骤b接种。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
1.直接利用种子鉴定，就可以在培养皿中完成烟草种质对赤星病的抗性鉴定，比常规鉴定试验省略了培养烟株的繁琐，节省了人力、物力与时间。通常常规试验需要大面积实验室条件和大面积的试验地。
2.使烟草对赤星病的抗性鉴定不受生长季节的限制，任何季节都能开展鉴定工作。并且在短时间内可以完成大量种质资源的筛选。
3.不受其他杂菌的干扰，亦不会产生类似悬滴接种法鉴定因孢子分布不均而出现接种强度不一致的现象，从而造成鉴定误差。
4.采用此种方法与已知抗感品种在大田中对赤星病的抗性表现一致。
附图说明：
图1为本发明筛选方法的流程示意图。
具体实施方式：
下面结合附图，对发明进行说明，如图1所示，为本发明筛选方法的流程示意图。本发明的实施例均按此附图流程操作。
实施例一、筛选方法如下
a、在马铃薯琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；b、待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼接种于250ml查彼培养液中，28℃振荡培养28-30d；c、纱布过滤除去菌丝体，再经3-5次离心，8000r/分钟，镜检无细胞，获得烟草赤星病菌毒素粗提液；d、用生物测定的方法确定毒素的活性；e、用水将毒素粗提液稀释2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0％(W/V)琼脂配成含毒素的培养基；f、于121℃条件下湿热灭菌含毒素培养基15-30min；g、消毒烟草种子；h、用镊子将消毒后的烟草种子夹取到含毒素的培养基上，封口膜封口，于25-28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；i、根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。
步骤d用生物测定的方法确定毒素的活性，具体为：取6-8叶期的感病品种NC89烟苗，在成熟伸展的叶片背面用注射器的针头轻轻刺破叶片表皮，用去掉针头的注射器吸取毒素滤液，然后轻轻将毒素从刺破部分注入烟草叶片，以两叶脉间约1/3充满毒素滤液且不溢出叶脉为宜，以培养液和清水同样处理为对照。处理48h后观察，以注射部位出现坏死斑为毒素具有活性的标志。步骤g、消毒烟草种子具体为：烟草种子80-100粒倒入1.5mL离心管，加75％(V/V)酒精中浸泡30s，吸出后无菌水换洗2次；加10％(V/V)双氧水浸泡10min，无菌水换洗5次。步骤a进一步包括培养赤星病菌的步骤：于一种琼脂培养基上培养赤星病菌，待病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼用于步骤b接种。
鉴定结果如下表
表1在不同浓度毒素培养基中烟草种子根系长进培养基中的株数比率(％)
| 品种 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
| 净叶黄(抗病品种) | 70.70 | 75.32 | 86.92 | 96.20 |
| NC89(感病品种) | 14.50 | 46.36 | 41.02 | 52.14 |
| Beinhart1000-1(抗病品种) | 85.00 | 88.10 | 92.31 | 90.91 |
| G140(感病品种) | 0.06 | 13.37 | 33.51 | 69.28 |
通过表1烟草种子根系长进培养基中的株数(％)得出，Beinhart1000-1和净叶黄为抗病品种。
实施例2、筛选方法如下
a、在燕麦片琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；b、待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼接种于250ml查彼培养液中，28℃振荡培养28-30d；c、纱布过滤除去菌丝体，再经3-5次离心，8000r/分钟，镜检无细胞，获得烟草赤星病菌毒素粗提液；d、用生物测定的方法确定毒素的活性；e、用水将毒素粗提液稀释2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0％(W/V)琼脂配成含毒素的培养基；f、于121℃条件下湿热灭菌含毒素培养基15-30min；g、消毒烟草种子；h、用镊子将消毒后的烟草种子夹取到含毒素的培养基上，封口膜封口，于25-28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；i、根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。
步骤d用生物测定的方法确定毒素的活性，具体为：取6-8叶期的感病品种NC89烟苗，在成熟伸展的叶片背面用注射器的针头轻轻刺破叶片表皮，用去掉针头的注射器吸取毒素滤液，然后轻轻将毒素从刺破部分注入烟草叶片，以两叶脉间约1/3充满毒素滤液且不溢出叶脉为宜，以培养液和清水同样处理为对照。处理48h后观察，以注射部位出现坏死斑为毒素具有活性的标志。步骤g、消毒烟草种子具体为：烟草种子80-100粒倒入1.5mL离心管，加75％(V/V)酒精中浸泡30s，吸出后无菌水换洗2次；加10％(V/V)双氧水浸泡10min，无菌水换洗5次。步骤a进一步包括培养赤星病菌的步骤：于一种琼脂培养基上培养赤星病菌，待病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼用于步骤b接种。
筛选结果如下表
表2在不同浓度毒素培养基中烟草种子根系长进培养基中的株数比率(％)
| 品种 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
| 净叶黄(抗病品种) | 72.73 | 95.32 | 76.92 | 96.20 |
| NC89(感病品种) | 12.50 | 36.36 | 40.00 | 50.04 |
| Beinhart1000-1(抗病品种) | 75.00 | 98.10 | 92.31 | 90.91 |
| G140(感病品种) | 0.00 | 33.33 | 46.51 | 74.98 |
通过表2烟草种子根系长进培养基中的株数(％)得出，Beinhart1000-1和净叶黄为抗病品种。
实施例3、筛选方法如下
a、在玉米粉琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；b、待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼接种于250ml查彼培养液中，28℃振荡培养28-30d；c、纱布过滤除去菌丝体，再经3-5次离心，8000r/分钟，镜检无细胞，获得烟草赤星病菌毒素粗提液；d、用生物测定的方法确定毒素的活性；e、用水将毒素粗提液稀释2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0％(W/V)琼脂配成含毒素的培养基；f、于121℃条件下湿热灭菌含毒素培养基15-30min；g、消毒烟草种子；h、周镊子将消毒后的烟草种子夹取到含毒素的培养基上，封口膜封口，于25-28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；i、根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。
步骤d用生物测定的方法确定毒素的活性，具体为：取6-8叶期的感病品种NC89烟苗，在成熟伸展的叶片背面用注射器的针头轻轻刺破叶片表皮，用去掉针头的注射器吸取毒素滤液，然后轻轻将毒素从刺破部分注入烟草叶片，以两叶脉间约1/3充满毒素滤液且不溢出叶脉为宜，以培养液和清水同样处理为对照。处理48h后观察，以注射部位出现坏死斑为毒素具有活性的标志。步骤g、消毒烟草种子具体为：烟草种子80-100粒倒入1.5mL离心管，加75％(V/V)酒精中浸泡30s，吸出后无菌水换洗2次；加10％(V/V)双氧水浸泡10min，无菌水换洗5次。步骤a进一步包括培养赤星病菌的步骤：于一种固体培养基上培养赤星病菌，待病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼用于步骤b接种。
鉴定结果如下表
表3在不同浓度毒素培养基中烟草种子根系长进培养基中的株数比率(％)
| 品种 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
| 净叶黄(抗病品种) | 62.05 | 85.32 | 86.00 | 92.20 |
| NC89(感病品种) | 8.71 | 29.36 | 39.00 | 68.04 |
| Beinhart1000-1(抗病品种) | 65.23 | 78.10 | 93.91 | 95.01 |
| G140(感病品种) | 3.05 | 26.33 | 39.77 | 67.99 |
通过表3烟草种子根系长进培养基中的株数(％)得出，Beinhart1000-1和净叶黄为抗病品种。
实施例4、筛选方法如下
a、在查彼琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；b、待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼接种于250ml查彼培养液中，28℃振荡培养28-30d；c、纱布过滤除去菌丝体，再经3-5次离心，8000r/分钟，镜检无细胞，获得烟草赤星病菌毒素粗提液；d、用生物测定的方法确定毒素的活性；e、用水将毒素粗提液稀释2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0％(W/V)琼脂配成含毒素的培养基；f、于121℃条件下湿热灭菌含毒素培养基15-30min；g、消毒烟草种子；h、用镊子将消毒后的烟草种子夹取到含毒素的培养基上，封口膜封口，于25-28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；i、根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。
步骤d用生物测定的方法确定毒素的活性，具体为：取6-8叶期的感病品种NC89烟苗，在成熟伸展的叶片背面用注射器的针头轻轻刺破叶片表皮，用去掉针头的注射器吸取毒素滤液，然后轻轻将毒素从刺破部分注入烟草叶片，以两叶脉间约1/3充满毒素滤液且不溢出叶脉为宜，以培养液和清水同样处理为对照。处理48h后观察，以注射部位出现坏死斑为毒素具有活性的标志。步骤g、消毒烟草种子具体为：烟草种子80-100粒倒入1.5mL离心管，加75％(V/V)酒精中浸泡30s，吸出后无菌水换洗2次；加10％(V/V)双氧水浸泡10min，无菌水换洗5次。步骤a进一步包括培养赤星病菌的步骤：于一种固体培养基上培养赤星病菌，待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼用于步骤b接种。
鉴定结果如下表：
表4在不同浓度毒素培养基中烟草种子根系长进培养基中的株数比率(％)
| 品种 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
| 净叶黄(抗病品种) | 52.73 | 95.62 | 79.92 | 96.20 |
| NC89(感病品种) | 7.05 | 12.06 | 33.01 | 42.04 |
| Beinhart1000-1(抗病品种) | 45.00 | 78.10 | 92.31 | 91.13 |
| G140(感病品种) | 10.00 | 28.33 | 26.51 | 61.01 |
通过表4烟草种子根系长进培养基中的株数(％)得出，Beinhart1000-1和净叶黄为抗病品种。
综上所述，本发明直接利用种子鉴定，就可以在培养皿中完成烟草种质对赤星病的抗性鉴定，比常规鉴定试验省略了培养烟株的繁琐、耗时与费工。通常常规试验需要大面积实验室条件和大面积的试验地。使烟草对赤星病的抗性鉴定不受生长季节的限制，任何季节都能开展鉴定工作。并且在短时间内可以完成大量种质资源和突变体的筛选。不受其他杂菌的干扰，亦不会产生类似悬滴接种法因孢子分布不均而接种强度不一致的误差。采用此种方法与已知抗感品种在大田中对赤星病的抗性表现一致。所以，本发明能直接从烟草种子中筛选出烟草抗赤星病种质材料，这种方法快速、经济、方便、可靠。
Claims (5)
1.一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其特征在于，按照下列步骤操作：
a、在一种琼脂培养基上培养烟草赤星病菌；
b、将直径为5mm的烟草赤星病菌菌饼接种于250ml查彼培养液中，28℃振荡培养28-30d；
c、纱布过滤除去菌丝体，再经3-5次离心，8000r/分钟，镜检无细胞，获得毒素粗提液；
d、用生物测定的方法确定毒素的活性；
e、用水将毒素粗提液稀释2-16(V/V)倍，加入1.8-2.0％(W/V)琼脂配成含毒素培养基；
f、121℃湿热灭菌含毒素培养基15-30min；
g、消毒烟草种子；
h、用镊子将消毒后的烟草种子夹取到含毒素的培养基上，封口膜封口，于25-28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；
i、根据烟苗根是否长进培养基中，鉴定出抗烟草赤星病的烟草种质材料。
2.根据权利要求1所述一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其特征在于，步骤b进一步包括配制查彼培养液：
3.根据权利要求1所述一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其特征在于，步骤d用生物测定的方法确定毒素的活性，具体为：取6-8叶期的感病品种NC89烟苗，在成熟伸展的叶片背面用注射器的针头轻轻刺破叶片表皮，用去掉针头的注射器吸取毒素滤液，然后轻轻将毒素从刺破部分注入烟草叶片，以两叶脉间约1/3充满毒素滤液且不溢出叶脉为宜，以培养液和清水同样处理为对照；处理48h后观察，以注射部位出现坏死斑为毒素具有活性的标志。
4.根据权利要求1所述一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其特征在于，步骤g、消毒烟草种子具体为：将80-100粒烟草种子倒入1.5mL离心管中，加入75％(V/V)酒精浸泡30s，用无菌水换洗2次；加入10％(V/V)双氧水浸泡10min，用无菌水换洗5次。
5.根据权利要求1所述一种培养皿中筛选烟草抗赤星病种质材料的方法，其特征在于，步骤a进一步包括培养赤星病菌的步骤：于一种琼脂培养基上培养赤星病菌，待赤星病菌长满培养基后，取直径5mm的烟草赤星病菌菌饼用于步骤b接种。
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