CN104450862A - 一种甘蔗梢腐病抗性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，是将配制好的甘蔗梢腐病病原菌孢悬液注射到甘蔗苗生长点上，同时设空白无菌水为对照，接种后的甘蔗苗培养10～15天后调查病原菌繁殖情况，根据发病程度和发病病情指数将甘蔗品种对甘蔗梢腐病的抗病性分为免疫、抗病、中抗和感病四个级别。本发明所采用的注射接种方式对甘蔗苗梢腐病进行鉴定，该方法更接近于田间甘蔗苗期感染梢腐病的实际情况，能直观的表现出不同品种甘蔗苗对甘蔗梢腐病的抗性水平。

Description

一种甘蔗梢腐病抗性鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，属于作物病害抗性鉴定技术领域。 

背景技术

甘蔗梢腐病(Pokkah Boeng Disease)病原为串珠镰孢(Fusarium moniliformae)，无性阶段可产生串珠状分生孢子或者假头状产孢，有性态为串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis)。甘蔗梢腐病主要发生在甘蔗的幼嫩叶片和梢部，感病后引起植株梢部腐烂，故名梢腐病。植株感染后心叶呈现梯形凹凸扭曲，有纵裂，梢头部叶片常缠在一起发生变形，并出现明显的褐色皱纹。植株受害严重时，其生长点周围的组织会变软变褐，心叶坏死，形成梢腐，导致整株甘蔗枯死，对甘蔗的产量和品质产生很大的影响。1921在印度尼西亚爪哇首次报道了该病，目前该病几乎遍及所有的甘蔗生产国和地区，已发展成一种世界性病害。 

在我国，由于新台糖22的大面积推广种植，品种单一，梢腐病在我国蔗区的发生呈逐渐加重趋势，导致该病已成为甘蔗生长前中期的主要病害。甘蔗梢腐病在我国蔗区普遍发生，在高温高湿天气持续时间长的年份，部分地区梢腐病发病率在25％以上，最高达40％，已对我国甘蔗生产和糖业的可持续发展构成严重威胁。 

但至今尚未建立高效、准确的甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，鉴于我国甘蔗梢腐病发生逐渐加重的趋势，因此建立一套快速有效的甘蔗梢腐病抗性鉴定方法并筛选抗性种质资源和品种势在必行。 

发明内容

针对我国甘蔗梢腐病抗性鉴定方法的空白，本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确的甘蔗梢腐病抗性鉴定方法。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方法如下： 

一种甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，包括以下步骤： 

1)配制甘蔗梢腐病病原菌孢悬液 

将甘蔗梢腐病病原菌接种于PDA培养基上活化，挑取边缘菌丝接种在灭菌后的马铃薯葡萄糖水培养基中震荡培养，离心、过滤收集菌体，用无菌水制成浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU/ml的甘蔗梢腐病病原菌孢悬液备用； 

2)参试甘蔗苗的准备 

将各品种的甘蔗种消毒、播种，出苗后长至3～4片完全叶，备用； 

3)接种鉴定 

将步骤1)得到的甘蔗梢腐病病原菌孢悬液接种到步骤2)所述的各品种的甘蔗苗生长点，同时对各品种的甘蔗苗都设空白无菌水为对照； 

4)病情调查 

接种后的甘蔗苗培养10～15天后调查梢腐病病原菌繁殖情况，根据发病程度和病原拓展面积，按发病等级划分标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行甘蔗品种的梢腐病抗性水平评价，甘蔗梢腐病品种抗性等级划分标准如下： 

对于注射接种法，所述的发病等级划分标准如下： 

0级 叶片无症状； 

1级 新叶无症状，一片叶片发病，接种后病原拓展面积占发病叶片面积小于5％； 

2级 新叶无症状，一片叶片发病，接种后病原拓展面积占发病叶片面积5％～15％之间，包括5％； 

3级 新叶无症状，两片叶片发病，接种后病原拓展面积占发病叶片面积15％～25％之间，包括15％； 

4级 新叶部分发病，紧挨新叶的叶片有明显黄褐色病斑，接种后病原拓展面积占发病叶片面积25％～35％之间，包括25％； 

5级 新叶大部分或全部死亡，紧挨新叶的叶片有大面积黄褐色病斑，接种后病原拓展面积占发病叶片面积的35％以上。 

对于剪叶接种法，所述的发病等级划分标准如下： 

0级 无病症； 

1级 剪口处黑色无扩展，<1mm失绿； 

2级 病斑从剪口向外扩展，1～3mm坏死斑； 

3级 病斑从剪口向外扩展，3～5mm褐斑； 

4级 病斑从剪口向外扩展，5～7mm黄褐色病斑； 

5级 病斑从剪口向外扩展，>7mm以上黄褐色病斑。 

所述的病情指数计算公式为： 

病情指数＝[Σ(发病等级数×相应等级的发病棵数)/(最高发病等级数×总调查棵数)]×100。 

所述的病情指数计算公式同时适用于剪叶接种法和注射接种法。 

优选的，步骤1)中，所述甘蔗梢腐病病原菌活化时间为2～8天。 

优选的，步骤1)中，所述甘蔗梢腐病病原菌震荡培养时间为2～8天。 

优选的，步骤3)中，所述孢悬液注射量为10～100μl。 

优选的，步骤3)中，接种方法为剪叶法或注射法。 

本发明的有益效果是： 

1、本发明通过注射接种方式对甘蔗苗梢腐病进行鉴定，该方法更接近于田间甘蔗苗感染梢腐病的实际情况，能直观的表现出不同品种甘蔗苗对甘蔗梢腐病的抗性水平。 

2、本鉴定方法快速、操作简便，对实验设备要求不高，各育种单位均能通过此法开展鉴定工作。 

3、该鉴定方法为甘蔗抗病育种前期提供技术支持，剔除部分感病品种，为后期品种筛选减轻人力物力，该方法的推广使用，对于筛选抗病品种和指导甘蔗抗病育种具有重要意义和现实作用。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1 

1、接种体的制备 

分别制备甘蔗梢腐病病原菌菌株CNO～1和菌株YN41(广西大学甘蔗种质资源创新与遗传改良实验室提供)孢悬液。两种菌株孢悬液的制备方法相同，具体为：将甘蔗梢腐病病原菌接种于PDA培养基上活化3天，挑取边缘菌丝接种在灭菌的马铃薯葡萄糖水培养基中震荡培养3天，离心收集菌体，用灭菌的脱脂棉过滤，用无菌水调节孢子浓度至1×10⁶CFU/ml浓度。获得菌株CNO～1孢悬液和菌株YN41孢悬液。 

2、接种材料的处理 

选取不同的甘蔗品种为接种材料，包括新台糖22、福桂1号、福桂2号和福桂3号，用0.3％多菌灵浸种20min，每桶种植10芽于温室中，出苗后正常管理，长出3～4片完全叶时进行接种。 

3、接种 

3.1剪叶接种法 

操作要点为：首先，用无菌剪刀沾取待接孢悬液；然后，在最顶部一片完全叶叶片中间剪5mm大小伤口。要求无菌剪刀沾取一次孢悬液，只剪切一次叶片，剪切下一张叶片前，必须重新沾取孢悬液。 

3.2注射接种法 

操作要点为：用1ml医用注射器将20μl孢子悬浮液注射到甘蔗生长点。 

3.3试验方案设计 

①取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，分别用剪叶接种法接种，接种体为菌株CNO～1孢悬液；再取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，以沾无菌水剪叶为对照。 

②取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，分别用剪叶接种法接种，接种体为菌株YN41孢悬液；再取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，以沾无菌水剪叶为对照。 

③取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，分别用注射接种法接种，接种体为菌株CNO～1孢悬液；再取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，以注射无菌水为对照。 

④取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，分别用注射接种法接种，接种体为菌株YN41孢悬液；再取长势相同的各品种甘蔗苗各10株，以注射无菌水为对照。 

4、病情调查 

4.1发病等级划分标准： 

接种后的甘蔗苗培养10天后调查梢腐病病原菌繁殖情况，根据发病程度和病原拓展面积，按发病等级划分标准进行分级并计算病情指数，发病等级划分标准见表1。 

表1 发病等级划分标准 

4.2不同接种方式优劣性评价如表2所示： 

表2 不同接种方式优劣性评价 

4.3所述的病情指数计算公式为： 

病情指数＝[Σ(发病等级数×相应等级的发病棵数)/(最高发病等级数×总调查棵数)]×100。 

4.4根据病情指数进行甘蔗品种的梢腐病抗性水平评价，甘蔗梢腐病品种抗性等级划分标准如下： 

5、抗性鉴定结果 

5.1不同甘蔗品种注射接种法接种甘蔗梢腐病病原菌菌株CNO～1孢悬液和菌株YN41孢悬液的抗性鉴定结果如表3所示。 

表3 不同甘蔗品种注射接种法接种不同梢腐病病原菌菌株孢悬液的抗性评价 

5.2不同甘蔗品种剪叶接种法接种甘蔗梢腐病病原菌菌株CNO～1孢悬液和菌株YN41孢悬液的抗性鉴定结果如表4所示。 

表4 不同甘蔗品种剪叶接种法接种不同梢腐病病原菌菌株孢悬液的抗性评价 

5.3结论 

在苗期用两种不同的方式接种甘蔗梢腐病病原菌，并通过病情指数评价抗病性，鉴定结果为：注射法为苗期评价甘蔗抗梢腐病鉴定的有效方法，新台糖22对甘蔗梢腐病病原菌CN0-1和YN41均为感病，福桂1号和福桂2号对甘蔗梢腐病病原菌CN0-1和YN41均为中抗；福桂3号对甘蔗梢腐病病原菌CNO-1为中抗，对YN41为抗病。 

Claims (8)

1.一种甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配制甘蔗梢腐病病原菌孢悬液

将甘蔗梢腐病病原菌接种于PDA培养基上活化，挑取边缘菌丝接种在灭菌后的马铃薯葡萄糖水培养基中震荡培养，离心、过滤收集菌体，用无菌水制成浓度为1×10⁶～1×10⁷CFU/ml的甘蔗梢腐病病原菌孢悬液备用；

2)参试甘蔗苗的准备

将各品种的甘蔗种消毒、播种，出苗后长至3～4片完全叶，备用；

3)接种鉴定

将步骤1)得到的甘蔗梢腐病病原菌孢悬液接种到步骤2)所述的各品种的甘蔗苗生长点，同时对各品种的甘蔗苗都设空白无菌水为对照；

4)病情调查

接种后的甘蔗苗培养10～15天后调查梢腐病病原菌繁殖情况，根据发病程度和病原拓展面积，按发病等级划分标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行甘蔗品种的梢腐病抗性水平评价，甘蔗梢腐病品种抗性等级划分标准如下：

免疫   病情指数≤0.01；

抗病   0.01＜病情指数≤30.0；

中抗   30.0＜病情指数≤50.0；

感病   50.0＜病情指数。

2.根据权利要求1所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，接种方法为剪叶接种法或注射接种法。

3.根据权利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，对于注射接种法，所述的发病等级划分标准如下：

0级   叶片无症状；

1级   新叶无症状，一片叶片发病，接种后病原拓展面积占发病叶片面积小于5％；

2级   新叶无症状，一片叶片发病，接种后病原拓展面积占发病叶片面积5％～15％之间，包括5％；

3级   新叶无症状，两片叶片发病，接种后病原拓展面积占发病叶片面积15％～25％之间，包括15％；

4级   新叶部分发病，紧挨新叶的叶片有明显黄褐色病斑，接种后病原拓展面积占发病叶片面积25％～35％之间，包括25％；

5级   新叶大部分或全部死亡，紧挨新叶的叶片有大面积黄褐色病斑，接种后病原拓展面积占发病叶片面积的35％以上。

4.根据权利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，对于剪叶接种法，所述的发病等级划分标准如下：

0级   无病症；

1级   剪口处黑色无扩展，<1mm失绿；

2级   病斑从剪口向外扩展，1～3mm坏死斑；

3级   病斑从剪口向外扩展，3～5mm褐斑；

4级   病斑从剪口向外扩展，5～7mm黄褐色病斑；

5级   病斑从剪口向外扩展，>7mm以上黄褐色病斑。

5.根据权利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，所述的病情指数计算公式为：

病情指数＝[Σ(发病等级数×相应等级的发病棵数)/(最高发病等级数×总调查棵数)]×100；

所述的病情指数计算公式同时适用于剪叶接种法和注射接种法。

6.根据权利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述甘蔗梢腐病病原菌活化时间为2～8天。

7.根据权利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述甘蔗梢腐病病原菌震荡培养时间为2～8天。

8.根据权利要求2所述甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述孢悬液注射量为10～100μl。