CN111424007A - 一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养方法 - Google Patents

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黄应昆
张荣跃
王晓燕
单红丽
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Abstract

本发明涉及一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养方法。培养基配方：KH2PO4 1g/L，KNO3 1g/L，蔗糖0.5g/L，维生素B1 3mg/L，维生素B2 1.5mg/L，维生素B6 0.2mg/L，烟酰胺10mg/L，泛酸钙1mg/L，维生素C 100mg/L。取甘蔗梢腐病病菌分生孢子或菌丝放入上述液体培养基200rpm，27℃±2℃培养3d，离心后用蒸馏水重悬，即获得大量梢腐病菌分生孢子。本发明产孢量多、产孢速度快，有效解决了甘蔗梢腐病病菌培养过程中产孢少的问题。

Description

一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养方法
技术领域
发明属于植物保护技术领域，涉及一种大量获得梢腐病病菌分生孢子的培养基及其培养方法。
背景技术
甘蔗梢腐病是一种为害甘蔗叶片的流行性真菌病害，1896年最先在爪哇发现，随后在美国、澳大利亚、菲律宾、毛里求斯、波多黎各、夏威夷、马来西亚及我国台湾等多个国家和地区广泛发生，现已成为一种世界性病害。我国福建、台湾、广东、广西、云南、四川及海南等省均有该病发生的报道，但一般都是零星发生，未曾给甘蔗生产造成威胁。近年来，由于受病原、耕作制度及气候条件多种因素变化的影响，甘蔗梢腐病的发生呈逐年上升趋势。防治不及时、不到位，易导致其暴发为害成灾，引起甘蔗严重的减产减糖，给蔗糖产业造成巨大的经济损失。甘蔗梢腐病随气流和雨水传播为害梢头嫩叶部位，引起叶片褪绿黄化，皱缩扭曲，影响叶片光合作用，严重时生长点腐烂，整株甘蔗枯死，导致甘蔗产量和糖分下降。防治该病害的主要措施是监测梢腐病病菌致病力动态、监测病菌的致病力差异和发病初期喷施药剂防控等，而监测病菌的致病力差异、筛选绿色高效杀菌剂等应用研究，均需要获得大量的病菌分生孢子。
目前，甘蔗梢腐病病菌分子孢子的获得方法主要有：(1)植物组织培养(康乃馨叶琼脂培养基)，将甘蔗梢腐病病菌的菌丝接到康乃馨叶琼脂培养基上，培养一段时间后会产生分生孢子。该方法是诱导甘蔗梢腐病病菌产生分子孢子的主要方法，产孢时间较短，适用范围较广，但是要想获得大量分子孢子需要较多的植物组织，操作繁琐。(2)KCI培养基(添加4-8g KCI至1L 1.5％水琼脂)诱导培养，经过实验证明，产孢效果不佳。
发明内容
为了克服现有培养技术的产孢量少、培养时间长的缺点与不足，本发明提供一种可在短时间内大量获得甘蔗梢腐病病菌分生孢子培养基及其培养方法。
本发明所提供的一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养基由以下成分组成：
KH2PO4 1g/L，KNO3 1g/L，蔗糖0.5g/L，维生素B1 3mg/L，维生素B2 1.5mg/L，维生素B6 0.2mg/L，烟酰胺10mg/L，泛酸钙1mg/L和维生素C100mg/L。
本发明所提供的一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养方法，包括：取甘蔗梢腐病病菌的分生孢子或菌丝，接种在上述甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养基中，在27℃±2℃，200rpm条件下，培养3d，离心5min，收集沉淀，无菌蒸馏水重悬，即获得了大量的甘蔗梢腐病病菌的分生孢子。
与现有技术相比，本发明的主要优点及有益效果：
使用本发明方法培养3d即可得到大量分生孢子，在40倍显微镜下每个视野20-30个分生孢子，与传统方法相比，每个视野分生孢子增加1倍以上，培养时间节省4-7d。
附图说明
图1为使用本发明方法培养产生的大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子。
图2为甘蔗梢腐病病菌菌落正反面，图2中左图为菌落正面，右图为菌落背面。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实验操作需要的材料或设备：普通超净工作台、灭菌锅、培养箱、培养皿、三角瓶、接种针、摇床、培养基、蒸馏水。
本发明的一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养基配制(以下简称：产分生孢子培养基)：盛有100mL蒸馏水的容器中加入KH2PO4 1g，KNO3 1g，蔗糖0.5g，维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B6 0.2mg，烟酰胺10mg，泛酸钙1mg，维生素C100mg，再用蒸馏水定容至1L。产分生孢子培养基分装100mL或250mL三角瓶内，121℃灭菌20min冷却备用。
采集感染甘蔗梢腐病的病叶，采用组织分离法分离病菌，在马铃薯固体培养基上培养，28℃,3d后挑取边缘菌丝，在PDA固体培养基上进行纯化培养。用全基因组DNA试剂盒，提取菌丝DNA，用通用引物ITS1+ITS4进行扩增，扩增得到的片段送华大基因公司测序，测序得到的片段在NCBI数据库进行比对，如果片段与数据库登录的甘蔗梢腐菌菌株序列片段一致性为100％，则确定获得的菌株是甘蔗梢腐病病菌。
将纯化培养的甘蔗梢腐病病菌的菌丝用无菌手术刀刮取后，汇集到上述已灭菌的产分生孢子培养基中，在200rpm，27℃±2℃下培养3d，再将产分生孢子培养基分装到无菌的50mL离心管中，在12000rpm转速下，离心5min，弃上清，收集沉淀，用无菌蒸馏水重悬，即可获得大量的甘蔗梢腐病病菌的分生孢子(在40倍显微镜下观察20-40个视野，平均每个视野观察到20-30个分生孢子)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，凡依本发明专利范围所做的均等变化，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养基，其特征在于，所述培养基由以下成分组成：
KH2PO4 1g/L，KNO3 1g/L，蔗糖0.5g/L，维生素B1 3mg/L，维生素B2 1.5mg/L，维生素B60.2mg/L，烟酰胺10mg/L，泛酸钙1mg/L和维生素C100mg/L。
2.一种快速获得大量甘蔗梢腐病病菌分生孢子的培养方法，其特征在于：
取甘蔗梢腐病病菌的分生孢子或菌丝，接种在权利要求1所述的培养基中，在27℃±2℃，200rpm条件下，培养3d，离心5min，收集沉淀，无菌蒸馏水重悬，即获得甘蔗梢腐病病菌的分生孢子。
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