CN111088292A - 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法 - Google Patents

一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111088292A
CN111088292A CN201911389829.4A CN201911389829A CN111088292A CN 111088292 A CN111088292 A CN 111088292A CN 201911389829 A CN201911389829 A CN 201911389829A CN 111088292 A CN111088292 A CN 111088292A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cacao
culture
shaking
conidiophores
hypha
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911389829.4A
Other languages
English (en)
Inventor
于志明
刘源松
张扬
唐睿琳
王皓炜
赵博识
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN201911389829.4A priority Critical patent/CN111088292A/zh
Publication of CN111088292A publication Critical patent/CN111088292A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法。工艺步骤包括1)将可可球二孢菌接种至PDA培养基中培养成熟；2)配制液体培养基并进行灭菌处理；3)将扩大后的可可球二孢菌接种至液体培养基内，振荡培养为菌丝振荡液；4)取菌丝振荡液于平板培养皿中，培养得到成熟的可可球二孢菌菌落。本发明提供的由液体培养瓶至生物培养皿的分段式培养方法可以明显提高可可球二孢的色素产量和生长速度，大大的节省了培养时间，缩短了生产周期，并降低了生产成本，可以应用于可可球二孢菌的大批量生产。

Description

一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养 方法
技术领域
本发明涉及的是一种采用分段式培养来提高可可球二孢菌的色素产量与生长速度的培养方法，属于微生物和制药领域。
背景技术
可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)属半知菌，球壳孢目，广泛分布于热带、亚热带与温带，不但引起植物病害，还是引起橡胶木和马尾松等热带阔叶树木材蓝变的主要真菌之一。可可球二孢菌的生长最适温度30℃左右，最低温度0℃，最高温度50℃。可可球二孢在PDA平板培养基上以温度30℃和湿度70％的条件下生长旺盛，菌落初为灰白色，后变为灰褐至褐黑色，培养基为黑色，气生菌丝为绒毛状、灰蓝色。培养四天后，菌落直径达到10cm，10天后开始形成分生孢子，15天后完全成熟，产生黑色近球状子实体，子座表面附满菌丝，一个子座内有多个分生孢子器，近球形。成熟的分生孢子双细胞褐色至黑色，表面有黑白相间的纵条纹。
目前国外对可可球二孢已进行了大量研究，但国内研究尚少。本发明采用分段式培养法，先将可可球二孢菌在PDA培养基中培养成熟，接种于液体培养瓶中振荡培养成菌丝振荡液，再取菌丝振荡液于平板培养皿中分离培养至成熟，来提升可可球二孢菌的色素产量与生长速度。
发明内容
本发明提出的是一种采用分段式培养，提高可可球二孢菌的色素产量与生长速度的培养方法，其目的是先将可可球二孢菌在PDA培养基中培养成熟，然后接种于液体培养瓶中振荡培养成菌丝振荡液，再取菌丝振荡液于平板培养皿中，培养得到成熟的可可球二孢菌菌落。该分段式培养方法可以明显提升可可球二孢菌的色素产量与生长速度，可以应用于可可球二孢菌的大批量生产。
本发明的技术解决方案包括如下工艺步骤：
1)在超净工作台上用直径为10～15mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度28～35℃、湿度75～85％的恒温恒湿箱中培养10～15d，得到色素分泌2～3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为60～80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉3～10g，葡萄糖10～30g，牛肉膏3～5g，维生素B6 5～25mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至5.5～6.5。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
3)在超净工作台上用直径为10～15mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在28～35℃，振荡速度150～200r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养3～5d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于平板培养皿中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度28～35℃、湿度85％以上的恒温恒湿箱中培养3～7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落；
具体实施方式
实施例1：液体培养基成分为马铃薯淀粉10g，葡萄糖20g，牛肉膏5g，维生素B610mg，蒸馏水1000ml，PH为6；在28℃，振荡速度200r/min条件下振荡培养3d；平板培养皿为马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)固体培养基
步骤1)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养12d，得到色素分泌3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
步骤2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉10g，葡萄糖20g，牛肉膏5g，维生素B6 10mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至6。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
步骤3)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在28℃，振荡速度200r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养3d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
步骤4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)固体培养基中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。
实施例2：液体培养基成分为马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B625mg，蒸馏水1000ml，PH为6.5；在28℃，振荡速度150r/min条件下振荡培养3d；平板培养皿为改良马丁培养基，配方为蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6
步骤1)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养12d，得到色素分泌3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
步骤2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B 625mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至6.5。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
步骤3)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在28℃，振荡速度150r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养3d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
步骤4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于改良马丁培养基中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。
实施例3：液体培养基成分为马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B625mg，蒸馏水1000ml，PH为6.5；在30℃，振荡速度200r/min条件下振荡培养5d；平板培养皿为察氏培养基，配方为硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.2
步骤1)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养12d，得到色素分泌3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
步骤2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B625mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至6.5。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
步骤3)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在30℃，振荡速度200r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养5d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
步骤4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于察氏培养基中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。

Claims (7)

1.一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：先将可可球二孢菌在PDA培养基中培养成熟，接种于液体培养瓶中振荡培养成菌丝振荡液，再取菌丝振荡液于平板培养皿中分离培养至成熟的分段式培养方法。
2.一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征包括以下步骤：
1)将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株接种于PDA培养基中培养10～15d后得到扩大菌株，培养环境为恒温28～35℃、恒湿75～85％RH；
2)配制液体培养基，配方：马铃薯淀粉3～10g，葡萄糖10～30g，牛肉膏3～5g，维生素B65～25mg，蒸馏水1000ml，采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至5.5～6.5；
3)将所述1)中的扩大菌株取出3～5菌环于所述2)中的液体培养瓶中振荡培养3～5d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
4)取3)所述的菌丝振荡液于平板培养皿中，在恒温28～35℃、恒湿85％RH以上的培养环境中培养3～7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。
3.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤1)所述扩大菌株为色素分泌2～3d的可可球二孢菌，即为可可球二孢菌菌株活性最高的时期。
4.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤2)所述马铃薯淀粉为将马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为60～80℃环境下充分干燥制成。
5.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤3)所述菌环为直径为10～15mm的无菌打孔器注入菌落中获得；所述可可球二孢菌菌丝振荡液为菌环于加热式振荡器中振荡培养，振荡速度为150～200r/min，温度为28～35℃。
6.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤4)所述生物培养皿中盛放的菌丝振荡液液面不超过菌丝高度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：在接种步骤中均需要在无菌操作台进行无菌操作，通过液体培养瓶至生物培养皿的分段式培养提高可可球二孢菌产量以及生长速度。
CN201911389829.4A 2019-12-30 2019-12-30 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法 Pending CN111088292A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911389829.4A CN111088292A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911389829.4A CN111088292A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111088292A true CN111088292A (zh) 2020-05-01

Family

ID=70397703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911389829.4A Pending CN111088292A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111088292A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373061A (zh) * 2021-06-22 2021-09-10 湖北省农业科学院果树茶叶研究所 一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001070033A1 (en) * 2000-03-23 2001-09-27 Nagarjuna Holdings Private Limited Herbicides comprising phytotoxins of lasiodiplodia theobromae, their production and use
CN102080051A (zh) * 2010-12-10 2011-06-01 福建省农业科学院植物保护研究所 一种可可球二孢菌产孢培养基配方
CN106047728A (zh) * 2016-07-28 2016-10-26 中国石油天然气股份有限公司 一种复合微生物调剖菌剂及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001070033A1 (en) * 2000-03-23 2001-09-27 Nagarjuna Holdings Private Limited Herbicides comprising phytotoxins of lasiodiplodia theobromae, their production and use
CN102080051A (zh) * 2010-12-10 2011-06-01 福建省农业科学院植物保护研究所 一种可可球二孢菌产孢培养基配方
CN106047728A (zh) * 2016-07-28 2016-10-26 中国石油天然气股份有限公司 一种复合微生物调剖菌剂及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R SULAIMAN 等: "First Report of Lasiodiplodia theobromae Causing Stem Canker of Jatropha curcas in Malaysia", 《PLANT DIS》 *
S F CHEN 等: "First Report of Lasiodiplodia theobromae Associated with Stem Canker of Almond in California", 《PLANT DIS》 *
刘树森等: "培养条件及杀菌剂对玉米穗腐病菌可可毛色二孢生长的影响", 《热带作物学报》 *
包兴涛等: "茶树病害病原菌Lasiodiplodia theobromae生物学特性研究", 《中国植保导刊》 *
陈旭玉等: "2株促进沉香形成的色二孢(Lasiodiplodia theobromae)的生物学特性研究", 《江西农业学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373061A (zh) * 2021-06-22 2021-09-10 湖北省农业科学院果树茶叶研究所 一种在果树组织内获取葡萄座腔菌分生孢子器的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cao et al. Fruiting body production of the medicinal Chinese caterpillar mushroom, Ophiocordyceps sinensis (Ascomycetes), in artificial medium
CN103270887B (zh) 蚕蛹北冬虫夏草工厂化栽培技术
CN102796673A (zh) 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法
US20220369648A1 (en) Endophytic falciphora oryzae fo-r20 and its application
CN113652367A (zh) 一种火龙果溃疡病杀菌剂及其应用
CN113265367B (zh) 一种快速获得羊肚菌分生孢子的培养其及其制备方法
CN103060208B (zh) 高效表达β-1,4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株及其应用
CN110184200A (zh) 一种高产绣球菌菌丝体发酵培养基及制备方法
CN105255742B (zh) 一株拮抗四种镰孢属真菌的内生青霉菌及其应用
CN102827777B (zh) 海绵共附生土曲霉及制备(+)-terrein的用途
CN104805017A (zh) 一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用
CN110684702B (zh) 一种博斯氏菌属y4及其在促进真姬菇生长中的应用
CN111088292A (zh) 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法
CN106755182B (zh) 一种促进灵芝液体发酵产胞外多糖的方法
CN105624232B (zh) 提高猴头菌发酵多糖的方法
CN109136100B (zh) 一株塔宾曲霉菌株及在发酵青砖茶上的应用
CN110699342A (zh) 米曲霉lccc30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用
CN102199545B (zh) 一株辛格粒毛盘菌及其液态发酵制备胞内黑色素的方法
CN101608209A (zh) 核糖体抗性诱变选育万古霉素生产菌株及其应用
CN115992054A (zh) 一种金耳菌株zjje004及其工厂化栽培方法
CN114292759A (zh) 一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌
CN110117548B (zh) 一种薄皮纤孔菌新菌株及其人工栽培方法和用途
KR100474662B1 (ko) 버섯 생장을 촉진시키는 슈도모나스 푸티다 미생물 및상기 미생물을 이용한 버섯재배 방법
CN106797801A (zh) 一种蝉花的人工培养方法
CN114806922B (zh) 一种防治食用菌病害的生防菌剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200501