CN111088292A - 一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法 - Google Patents

一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法。工艺步骤包括1)将可可球二孢菌接种至PDA培养基中培养成熟；2)配制液体培养基并进行灭菌处理；3)将扩大后的可可球二孢菌接种至液体培养基内，振荡培养为菌丝振荡液；4)取菌丝振荡液于平板培养皿中，培养得到成熟的可可球二孢菌菌落。本发明提供的由液体培养瓶至生物培养皿的分段式培养方法可以明显提高可可球二孢的色素产量和生长速度，大大的节省了培养时间，缩短了生产周期，并降低了生产成本，可以应用于可可球二孢菌的大批量生产。

Description

一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养 方法
技术领域
本发明涉及的是一种采用分段式培养来提高可可球二孢菌的色素产量与生长速度的培养方法，属于微生物和制药领域。
背景技术
可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)属半知菌，球壳孢目，广泛分布于热带、亚热带与温带，不但引起植物病害，还是引起橡胶木和马尾松等热带阔叶树木材蓝变的主要真菌之一。可可球二孢菌的生长最适温度30℃左右，最低温度0℃，最高温度50℃。可可球二孢在PDA平板培养基上以温度30℃和湿度70％的条件下生长旺盛，菌落初为灰白色，后变为灰褐至褐黑色，培养基为黑色，气生菌丝为绒毛状、灰蓝色。培养四天后，菌落直径达到10cm，10天后开始形成分生孢子，15天后完全成熟，产生黑色近球状子实体，子座表面附满菌丝，一个子座内有多个分生孢子器，近球形。成熟的分生孢子双细胞褐色至黑色，表面有黑白相间的纵条纹。
目前国外对可可球二孢已进行了大量研究，但国内研究尚少。本发明采用分段式培养法，先将可可球二孢菌在PDA培养基中培养成熟，接种于液体培养瓶中振荡培养成菌丝振荡液，再取菌丝振荡液于平板培养皿中分离培养至成熟，来提升可可球二孢菌的色素产量与生长速度。
发明内容
本发明提出的是一种采用分段式培养，提高可可球二孢菌的色素产量与生长速度的培养方法，其目的是先将可可球二孢菌在PDA培养基中培养成熟，然后接种于液体培养瓶中振荡培养成菌丝振荡液，再取菌丝振荡液于平板培养皿中，培养得到成熟的可可球二孢菌菌落。该分段式培养方法可以明显提升可可球二孢菌的色素产量与生长速度，可以应用于可可球二孢菌的大批量生产。
本发明的技术解决方案包括如下工艺步骤：
1)在超净工作台上用直径为10～15mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度28～35℃、湿度75～85％的恒温恒湿箱中培养10～15d，得到色素分泌2～3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为60～80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉3～10g，葡萄糖10～30g，牛肉膏3～5g，维生素B6 5～25mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至5.5～6.5。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
3)在超净工作台上用直径为10～15mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在28～35℃，振荡速度150～200r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养3～5d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于平板培养皿中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度28～35℃、湿度85％以上的恒温恒湿箱中培养3～7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落；
具体实施方式
实施例1：液体培养基成分为马铃薯淀粉10g，葡萄糖20g，牛肉膏5g，维生素B610mg，蒸馏水1000ml，PH为6；在28℃，振荡速度200r/min条件下振荡培养3d；平板培养皿为马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)固体培养基
步骤1)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养12d，得到色素分泌3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
步骤2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉10g，葡萄糖20g，牛肉膏5g，维生素B6 10mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至6。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
步骤3)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在28℃，振荡速度200r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养3d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
步骤4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)固体培养基中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。
实施例2：液体培养基成分为马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B625mg，蒸馏水1000ml，PH为6.5；在28℃，振荡速度150r/min条件下振荡培养3d；平板培养皿为改良马丁培养基，配方为蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6
步骤1)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养12d，得到色素分泌3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
步骤2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B 625mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至6.5。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
步骤3)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在28℃，振荡速度150r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养3d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
步骤4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于改良马丁培养基中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。
实施例3：液体培养基成分为马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B625mg，蒸馏水1000ml，PH为6.5；在30℃，振荡速度200r/min条件下振荡培养5d；平板培养皿为察氏培养基，配方为硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.2
步骤1)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株沿菌落边缘依次切取带有菌丝体的琼脂柱，用针挑取琼脂柱移植至PDA培养基中，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养12d，得到色素分泌3d，菌株活性最高时期的可可球二孢菌的扩大菌株；
步骤2)将新鲜的马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为80℃环境下充分干燥24h制得马铃薯淀粉。称量马铃薯淀粉5g，葡萄糖30g，牛肉膏3g，维生素B625mg，蒸馏水1000ml，配制液体培养基。采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至6.5。将液体培养基在高压灭菌锅内以温度121℃，加压压力0.11MPa条件下进行灭菌；
步骤3)在超净工作台上用直径为10mm的无菌打孔器将可可球二孢的扩大菌株沿菌落边缘依次切取3～5个带有菌丝体的菌环，用针挑取菌环接种至无菌液体培养基中，在30℃，振荡速度200r/min条件下于加热式振荡器中振荡培养5d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
步骤4)在超净工作台上取可可球二孢菌菌丝振荡液于察氏培养基中，菌丝振荡液液面不超过菌丝高度，在培养环境为温度30℃、湿度90％的恒温恒湿箱中培养7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。

Claims (7)

1.一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：先将可可球二孢菌在PDA培养基中培养成熟，接种于液体培养瓶中振荡培养成菌丝振荡液，再取菌丝振荡液于平板培养皿中分离培养至成熟的分段式培养方法。
2.一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征包括以下步骤：
1)将可可球二孢菌(Lasiodiplodia Theobromae)菌株接种于PDA培养基中培养10～15d后得到扩大菌株，培养环境为恒温28～35℃、恒湿75～85％RH；
2)配制液体培养基，配方：马铃薯淀粉3～10g，葡萄糖10～30g，牛肉膏3～5g，维生素B65～25mg，蒸馏水1000ml，采用浓度为0.5～1mol/L的盐酸溶液将液体培养基pH调节至5.5～6.5；
3)将所述1)中的扩大菌株取出3～5菌环于所述2)中的液体培养瓶中振荡培养3～5d，得到可可球二孢菌菌丝振荡液；
4)取3)所述的菌丝振荡液于平板培养皿中，在恒温28～35℃、恒湿85％RH以上的培养环境中培养3～7d，得到生长成熟的可可球二孢菌菌落。
3.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤1)所述扩大菌株为色素分泌2～3d的可可球二孢菌，即为可可球二孢菌菌株活性最高的时期。
4.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤2)所述马铃薯淀粉为将马铃薯绞成浆料后经5层纱布过滤3～5次，过滤液自然沉淀，将马铃薯沉淀物置于温度为60～80℃环境下充分干燥制成。
5.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤3)所述菌环为直径为10～15mm的无菌打孔器注入菌落中获得；所述可可球二孢菌菌丝振荡液为菌环于加热式振荡器中振荡培养，振荡速度为150～200r/min，温度为28～35℃。
6.根据权利要求2中一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：步骤4)所述生物培养皿中盛放的菌丝振荡液液面不超过菌丝高度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的一种可提高可可球二孢菌色素产量和生长速度的分段式培养方法，其特征在于：在接种步骤中均需要在无菌操作台进行无菌操作，通过液体培养瓶至生物培养皿的分段式培养提高可可球二孢菌产量以及生长速度。
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