CN104805017A

CN104805017A - 一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用

Info

Publication number: CN104805017A
Application number: CN201410690275.2A
Authority: CN
Inventors: 赵伯涛; 闫淑珍; 陈斌; 钱骅; 黄晓德; 朱羽尧
Original assignee: Institution Of Comprehensive Utllization Of Wild Plants All China Federation Of Supply And Maketing C00peratives
Current assignee: Institution Of Comprehensive Utllization Of Wild Plants All China Federation Of Supply And Maketing C00peratives
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2015-07-29

Abstract

本发明公开了一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用，具体为腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9580。本腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）为从天南星科 (Araceae）半夏属（Pinellia Tenore）植物的植株中分离获得的内生菌，通过在液体培养基中添加含β-1，4糖苷键的底物成分进行培养，鉴定筛选出产β-葡萄糖苷酶菌株，该菌株在产酶培养基中培养72小时后，培养液β-葡萄糖苷酶酶活达77.83±0.42 U/mL，所产β-葡萄糖苷酶反应的最适温度是在45-50℃之间，最适pH在7-8之间，在温度5-40℃、pH 6-9条件下，酶活较稳定，其最适反应时间为40min。

Description

一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从天南星科 (Araceae）半夏属（Pinellia Tenore）植物植株中分离筛选出一株高产β-葡萄糖苷酶的内生真菌及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，它也是纤维素酶复合酶系发挥协同作用的关键酶。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现，后来的研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于自然界中许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉和细菌体内。它参与生物体的糖酵解，对维持生物体正常生理功能起着重要的作用。

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的一个重要组成部分，在医疗、食品、生物质转化中有重要的应用价值，它将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质。近年来国内对β-葡萄糖苷酶的研究已经成为热点，已由过去的研究从大豆、蚕豆、茶叶、香菇、微生物等材料中简单提取β-葡萄糖苷酶到现在微生物的培养条件优化、酶基因的克隆以及粗酶液的纯化。β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达已经得到实现，新构建的工程菌已经应用到生产实践中，国内已有利用β-葡萄糖苷酶工程菌制备β-葡萄糖苷酶的报道，但工艺复杂、生产成本过高严重制约了其产业化发展。所以筛选、鉴定、培养高产β-葡萄糖苷酶微生物，并从培养基或微生物中提取β-葡萄糖苷酶依然是目前解决β-葡萄糖苷酶来源的主要途径。

栀子蓝色素是以栀子苷为原料，采用生物技术制得的一种安全无毒的食用天然色素，我国于1999年在制定新增食品添加剂的使用卫生标准时已将其列入其中。目前，栀子蓝色素的制备主要有微生物发酵法和β-葡萄糖苷酶水解转化法。专利CN101016421A和专利CN102559796A分别用黑曲霉和酵母菌发酵制备栀子蓝，但这两种微生物对栀子苷的生物转化率较低，使得制备的栀子蓝色素色价不高。专利CN102021202A、CN102732050A、CN201310504179.X采用市售的纤维素酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶，其水解专一性较差或活力较低，使栀子苷转化率和所产栀子蓝色素色价都较低。

发明内容

1、菌种筛选：

取新鲜天南星科 (Araceae）半夏属（Pinellia Tenore）植物植株，用无菌水冲洗干净，切成0.5cm×0.5cm的小块，经过紫外消毒，75％乙醇消毒1min，2.5％次氯酸钠消毒10min，再用75％乙醇消毒1min，无菌水冲洗2～3 次，接入已倒好的PDA固体平板培养基上。将培养皿置于28℃培养箱中倒置培养3～7 天。待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养,采用菌丝顶端纯化法逐步纯化得到3株植物内生真菌分别命名为ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3，将他们分别添加到含β-葡萄糖苷酶水解底物的培养基中培养，该培养基中：β-葡萄糖苷酶水解底物为栀子苷、水杨苷、大豆异黄酮中的一种，含量为1%-10%；氮源为NaNO3、KNO3、NH4NO3，浓度为0.1%-1%；缓冲盐为K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4，浓度为0.5%-2%；PH为6-9；摇床转速为100-200rpm/min，培养10-100小时后，测定底物转化率ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3中底物栀子苷转化率分别为96.7%、47.8%、35.6%，选择底物转化率最高的菌种ZZG-1作为菌种鉴定的对象。

2、菌种鉴定

将菌种用PDA固体培养基活化后，从培养基上挑取菌丝至显微镜下观察：菌株气生菌丝较发达，菌丛具条纹，密厚；小孢子产生早而多，大孢子产生于多分枝的分生孢子梗上白色，后期培养皿反面变为蓝绿色。

该菌种接种于PDA固体培养基中活化后，再转接至PDA液体培养基中，离心后取菌丝，参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，完成后经1%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍摄结果。将得到的菌株ITS序列用GenBanK中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行分析，结果其与腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）属菌种相似性达100%，故判断其为腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）。本菌株已于2014年9月1日起，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.9580。

3、菌种培养

从保藏培养基（PDA）中挑取腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）菌丝接种于PDA固体培养基（去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为水，自然pH 值）中，于25-35℃培养72-120h，挑取PDA固体培养基中的菌丝接种与PDA液体培养基（PDA液体培养基中加琼脂20g/L）中活化培养48-72h，按体积比3-10% 接种量，转接入液体产酶培养基（50%栀子苷20g/L，NaNO₃3g/L，KH₂PO₄40g/L其余为水,用NaOH调pH至7.5）,25-35℃下，培养72-120 h。

4、酶学特性

产酶培养基离心去除菌丝后，测得培养液β-葡萄糖苷酶酶活达77.83±0.42 U/mL，盐析收集沉淀、透析除盐后用聚乙二醇-6000包埋浓缩备用。

对该酶的最适反应温度及热稳定性、最适pH及PH稳定性、反应时间对酶活性的影响、金属离子和有机溶剂对酶活性的影响进行检测：该酶最适反应温度在45-50℃之间，最适pH 在7-8 之间；在温度5-40℃，pH 为6-9 条件下，酶可以保持较高活力，最适反应时间为40min，金属离子和有机溶剂都对酶活性影响都很大。

附图说明

附图1栀子蓝色素扫描光谱。

附图2腐皮镰孢菌系统发生树。

附图3酶学特性。

附图4发酵前后培养基中栀子苷的HPLC图谱。

具体实施方式

实例1菌种筛选

取新鲜盾叶半夏植株，用无菌水冲洗干净，切成0.5cm× 0.5cm 的小块，经过紫外消毒，75％乙醇消毒1min，2.5％次氯酸钠消毒10min，再用75％乙醇消毒1min，无菌水冲洗2～3 次，接入已倒好的PDA固体平板培养基上。将培养皿置于28℃培养箱中倒置培养3～7 天。待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养,采用菌丝顶端纯化法逐步纯化得到3株植物内生真菌分别命名为ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3，将他们分别添加到栀子苷粗提物培养基培养，该培养基中：栀子苷含量为2%、氮源为NaNO₃、浓度为0.3%、缓冲盐为K₂HPO₄/KH₂PO₄、浓度为0.5%；pH为7.5；摇床转速为150rpm/min，培养100小时后，检测其最大吸收波长为594nm（其扫描光谱见附图1），在594nm波长下检测各组培养液吸光值，选择吸光值最大培养液中添加的菌种ZZG1作为菌种鉴定的对象。

实例2菌种鉴定

该菌种接种于PDA固体培养基中活化后，再转接至PDA液体培养基中，离心后取菌丝，参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，将PCR扩增产物进行纯化，完成后经1%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍摄结果。测得片段长度为554bp（见核苷酸序列附加文件）将该序列提交Gene Bank进行Blast同源序列分析，亲缘关系相近的序列大部分为腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）属的菌株，构建系统发生树（见图2），该菌种与它们都具有100%的同源性，该菌种为腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）。

实例3产酶菌种培养

从保藏培养基（PDA）中挑取腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）菌丝接种于PDA固体培养基（去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为水，自然pH 值）中，于28℃培养72h，挑取PDA固体培养基中的菌丝接种与PDA液体培养基（PDA液体培养基中加琼脂20g/L）中活化培养72h，按体积比3% 接种量，转接入液体产酶培养基（50%栀子苷20g/L，NaNO₃3g/L，KH₂PO₄40g/L其余为水,用NaOH调pH至7.5）,32℃下，培养120 h。在试管中取0.1 m L培养液，加入0.9 mLpH 6.2的0.2 mol/L Na₂HPO₄-0.1 mol/L柠檬酸缓冲溶液,于45 ℃水浴预热10min；加入已预热10 min的1mL 5mmol/L栀子苷溶液，反应 10min后立即用沸水浴终止反应，冷水冲淋后，室温放置5min，HPLC测定发酵液中栀子苷含量，同时检测发酵液中β-葡萄糖苷酶酶活力达77.83±0.42 U/mL。

实例4 酶学特性

1、酶的最适反应温度及热稳定性

在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的不同温度下，测定酶活力，确定温度对酶活力的影响；在4℃和上述各温度下各保温10h 后，在最适反应温度下测酶活，确定酶的热稳定性。该酶的最适反应温度在45-50℃之间，当温度超过60℃时，酶活力迅速下降，而当温度低于最适温度时随温度的升高酶活力逐渐上升（见附图3）。该酶在 5～40℃条件下储藏，其酶活较稳定（见附图3），提示该酶可以在常温下储藏。

2、酶的最适pH及PH稳定性

用pH 值为3-12 的缓冲液配制底物溶液，测酶活，确定最适pH；在1.50mL不同pH 缓冲液中加粗酶液0.50mL，在最适温度下保温10h后，于最适温度下测酶活。该β- 葡萄糖苷酶的最适pH在7-8 之间， pH 超过8时，相对酶活明显下降；pH 为6-9 时，β- 葡萄糖苷酶的活力较好，达70%以上（见附图3）。该酶的pH稳定性较差，在PH小于5和大于11的条件下酶活力均下降超50%（见附图3）。

3、反应时间对酶活性的影响

在最适温度，最适pH下，分别测反应时间5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45mi、50min、55min和60min时的酶活力。该酶反应时间40分钟时酶活力达到最大值。反应时间少于40分钟，随着反应时间的增加，酶活力逐渐增加。反应时间多于40分钟，随着反应时间的增加酶活力维持在最大活力的97%左右（见附图3）。

4 、金属离子对酶活性的影响

配制浓度0.001mg/L各种金属离子添加至各反应底物溶液中，在最适温度及pH下10h后测酶活。以未添加金属离子的酶活为100%，0.001mg/mL的Zn²⁺、Fe²⁺、Sn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺和Ba²⁺均可使该酶的活力提高50%以上，其中Ba²⁺可使酶活力提高300%； Al³⁺、K⁺和Cr³⁺会使该酶的活力损失50%以上，其中Al³⁺使该酶活力的损失达70%以上（见附图3）。

5 、有机溶剂对酶活性的影响

添加不同有机溶剂至各底物溶液中，使有机溶剂的终浓度10%、20%、30%、40%、50%和60%。在最适温度和pH下测酶活。以未添加有机溶剂的酶活为100%，各有机溶剂对该菌种所产的β- 葡萄糖苷酶的活性均具有明显的抑制作用，在体积分数为0%-60%范围内随着浓度的升高，酶活性也呈下降趋势。当体积分数达到60%时乙酸乙酯、甲醇可使酶活力损失近50%，乙醇、乙腈、丙酮使酶活力损失超过60%（见附图3）。

实例5 应用实例

在20L气升式发酵罐中加入底物栀子苷800g,氮源NaNO₃为60g，缓冲盐KH₂PO₄ 为200g，谷氨酸钠为600g，PH调为7.5，灭菌冷却后接种腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）悬液接种量为800mL，前期风量通风比0.8:1，后期通风比为1:1，28℃条件下发酵120小时后取出发酵液。经HPLC检测，栀子苷转化率达97%。将发酵液经离心、过滤、纯化后得栀子蓝色素蓝黑色粉末，取0.1mg该粉末，定容稀释至适当倍数，取此试样液置于1cm比色皿中，以纯化水做空白对照，用分光光度计测定其在波长594nm处的吸光度，计算色价E_594nm ^1cm(1%)=120。

核苷酸序列表

<110> 中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所

<120> 一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用

<160> 554

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 554bp

<212> DNA

<213> Fusarium solani (Mart.)

<220>

<221> allele

<222> (1)…(554)

<400> 1

GCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTAAACGTTG 60

CCTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTGAAAACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAAC 120

TCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAAC 180

GGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT 240

GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCG 300

GGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCG 360

GCGGAGGCCCTCCGTGGGCACACGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCT 420

TCCATCGCGTAGTAGCTAACACCTCGCGACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACC 480

CCCAACTCTTCTGAAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 540

CAATAAGCGGAGGA 554

Claims

1.一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用，其特征为所述的植物内生真菌为腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9580。

2.权利要求1所述的腐皮镰孢菌，其特征为从天南星科 (Araceae）半夏属（Pinellia Tenore）植物植株中分离、培养筛选获得的植物内生真菌。

3.权利要求2所述半夏属（Pinellia Tenore）植物为虎掌、或半夏、或盾叶半夏、或石蜘蛛中的一种。

4.权利要求2所述的腐皮镰孢菌筛选所用液体培养条件为：β-葡萄糖苷酶水解的底物为栀子苷、水杨苷、大豆异黄酮中的一种，含量为1%-10%；氮源为NaNO₃、KNO₃、NH₄NO₃中的一种，浓度为0.1%-1%，缓冲盐为K₂HPO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄，浓度为0.5%-2%，PH为6-9，培养时间为10-100小时，摇床转速100-200rpm/min。

5.权利要求1所述的腐皮镰孢菌，其特征为，将该菌种接种于PDA固体培养基中活化后，再转接至PDA液体培养基中培养，离心取菌丝，提取菌种基因组DNA，在PCR仪上进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，将得到的菌株ITS序列用GenBanK中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行分析，鉴定其为腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）。

6.权利要求1 所述的腐皮镰孢菌菌株的应用方法，其特征在于,所述腐皮镰孢菌（Fusarium solani (Mart.)）经液体发酵，产β-葡萄糖苷酶。

7.根据权利要求6 所述的腐皮镰孢菌株的应用方法，其特征在于，所述的腐皮镰孢菌产酶过程为：将斜面培养的菌丝接至PDA固体平板25-35℃培养72-120小时，再转接至PDA 液体培养基25-35℃活化48-72小时，按体积比3-10% 接种量，转接入液体产酶培养基中，pH 至6-9，25-35℃下，培养72小时至120 小时。

8.根据权利要求7所述的腐皮镰孢菌株的应用方法，其特征在于，所述的PDA液体和固体培养基为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为水，自然pH 值，固体培养基外加琼脂20g/L。

9.根据权利要求8所述的腐皮镰孢菌株的应用方法，其特征在于，所述的液体产酶培养基为：含量50%栀子苷20g/L，NaNO₃3g/L，KH₂PO₄40g/L其余为水,用NaOH调pH至7.5。

10.根据权利要求9所述腐皮镰孢菌所产β-葡萄糖苷酶酶学特性为：该真菌所产β-葡萄糖苷酶反应的最适温度在45-50℃之间，最适pH 在7-8 之间，在温度5-40℃、pH 6-9 时，酶活较稳定，其最适反应时间为40min。

11.根据权利要求9所述腐皮镰孢菌所产β-葡萄糖苷酶活力受金属离子和有机溶剂影响：0.001mg/mL的Zn²⁺、Fe²⁺、Sn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺ 和Ba²⁺均可该酶的活力提高50%以上，其中Ba²⁺可使该酶活力提升300%，0.001mg/mLAl³⁺、K⁺和Cr³⁺会使该酶的活力损失50%以上，其中Al³⁺使该酶的活力损失70%；在体积分数为0%-60%范围内随着有机溶剂浓度的升高，酶活性逐步下降，当体积分数达60%时乙酸乙酯、甲醇可使酶活损失近50%，乙醇、乙腈、丙酮使酶活损失超过60%。