CN102250823B

CN102250823B - 一种提高真菌孢子产量的方法

Info

Publication number: CN102250823B
Application number: CN 201110188287
Authority: CN
Inventors: 徐玲玲; 陶贵荣; 郭斌; 孟长军
Original assignee: Xian University
Current assignee: Xian Unversity of Arts and Science; Xian University
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: CN102250823A

Abstract

本发明公开了一种提高真菌孢子产量的方法，该方法将真菌接种到培养基上，在合适的培养温度下培养5-10天，然后向真菌营养体表面喷洒500μl适量浓度的强氧化剂溶液，再用0.6m/s风速的无菌风吹送10分钟；继续于相同的培养温度下培养真菌3天，收集真菌产生的孢子。该方法利用强氧化剂对真菌产生一定的胁迫，促使真菌产生对环境具有更强适应性的器官—孢子，从而提高真菌孢子的产量。

Description

一种提高真菌孢子产量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提高真菌孢子产量的方法，该方法通过适当浓度的强氧化剂处理真菌的营养菌丝，对真菌产生一定的胁迫促使真菌产生对环境具有更强适应性的器官—孢子，从而达到促使真菌产孢以提高其孢子产量。

背景技术

真菌孢子通常较其体细胞和菌丝体稳定，因而能够在恶劣的环境中生存，因此被广泛地用于生物防治或其它商业真菌产品制剂的制备（Shah FA, et al, Biol Control，2007，40，246-252；Decal A，et al, Recent Res Dev Appl Microbiol & Biotechnol，2003，1，161-175）。在商业生产上，经常需要对真菌进行人工培养，但许多真菌会因为在人工培养基上多次继代而减弱甚至丧失其产孢的能力（Kashket ER and Cao ZY，1995，FEMS Microbiol Rev，17，307-315）。

科学家们曾尝试过许多提高真菌孢子产量的研究以提高其商业生产的可行性，如低温处理，在黑暗中预培养，扫刷菌丝表面，用近紫外线处理等方法（Wang J，et al，2005，Mycosystema，24，590-596）。目前最有效和常用的方法是近紫外线处理的方法（Marsh PB，et al，1959，Pl Dis Reptr Supple，261，251-312）。已发现将壶菌，结合菌，子囊菌和担子菌的某些菌株暴露在近紫外线下都能诱导其产生孢子。但是，该方法具有一定的缺陷而不适用于商业生产。首先，受到温度的制约，例如，豌豆褐斑病（Ascochyta pisi）在5℃~30℃生长（最适温度22℃~27℃）而其在近紫外线诱导下柄子壳形态发生的温度却限制在10℃~25℃（Leach CM，1962，Can J Bot，40，1577-1602）。其次，不同菌株对某些近紫外波长有不同的阈值（Rakoczy L，1965，Acta Soc Bot Pol，34，97-112），过度的辐射还会抑制产孢（Rakoczy L，1963，Acta Soc Bot Pol，11，559-562；Rakoczy L，1965，Acta Soc Bot Pol，34，97-112）。第三，某些真菌需要近紫外光和黑暗的交替处理，例如，白菜黑斑病（Alternaria brassicae）、胡麻叶斑病（Helminthosporium oryzae）和葱叶枯病（Stemphylium botryosum）（Leach CM，1961，Can J Bot，39，705-715； Leach CM，1967，Can J Bot，39，705-715）。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种提高真菌孢子产量的方法；

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种提高真菌孢子产量的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1）将真菌接种到培养基上，在适宜的温度下培养5-10天；

2）向培养5-10天的真菌营养体表面喷洒500μl合适浓度的强氧化剂溶液；

3）用0.6 m/s风速的无菌风对喷洒强氧化剂溶液的真菌营养体吹送10分钟；

4）真菌营养体继续在相同的培养温度下培养3天，收集真菌产生的孢子。

本发明通过适当浓度的强氧化剂处理真菌的营养菌丝，对真菌产生一定的胁迫促使真菌产生对环境具有更强适应性的器官—孢子，从而诱导真菌产孢以提高其孢子产量。通过查新，目前尚未见有通过强氧化剂促使真菌产孢以提高其孢子产量的报道。

具体实施方式

申请人通过研究发现，适当浓度的强氧化剂能够广泛地促进各类真菌孢子的产生。

按照本发明的技术方案，一种提高真菌孢子产量的方法，按以下步骤进行：1）将真菌接种到培养基上，在适宜的温度下培养5-10天；2）向培养5-10天的真菌营养体表面喷洒500μl合适浓度的强氧化剂溶液；3）用0.6 m/s风速的无菌风对喷洒强氧化剂溶液的真菌营养体吹送10分钟；4）真菌营养体继续在相同的培养温度下培养3天，收集真菌产生的孢子。

以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，在以下的实施例中，强氧化剂可以是三价钴盐、过硫酸盐、过氧化物、重铬酸钾、高锰酸钾、氧酸盐和浓硫酸等。

真菌包括真菌菌丝和各类孢子。

合适的培养温度是指在该温度下，所选择的真菌的生长速率最快。

培养基可以选择常规的培养基，例如马铃薯培养基（PDA；Difco Laboratories，Detroit, Mich.），水琼脂培养基（Saikawa and Kadowaki，2002），玉米粉培养基（CMA；Difco Laboratories，Detroit, Mich.），脱脂大麻籽培养基（Gams W et al.，1977，Persoonia，9，381-391），大麻籽培养基（Kuhlman, 1972），干草浸出物培养基（Gams W et al.，1975，Centraalbureau voor Schiummelcultures），麦芽提取物培养基（Linnemann，1958），麦芽提取物-酵母提取物-胰蛋白胨培养基（Carreiro MM and Koske RE，1992，Mycologia, 84，886-900），土壤提取物培养基（Gams W et al.，1975，Centraalbureau voor Schiummelcultures），索顿标准培养基（Thorton HG，1922，Ann. Appl. Biol.，9，241-274；Benny GL and Blackwell M，2004，Mycologia，96，143-149），麦芽培养基(Benny GL，1972，Mycologia，64，854-862)其中的任一种，这些培养基是以液体或固体的形式存在，当真菌选定后，可以选择真菌培养的合适的常用培养基。

所述的合适浓度的强氧化剂溶液，是指使用该强氧化剂的浓度不会造成真菌死亡的最大浓度。例如高锰酸钾溶液的合适浓度为0.5 %，双氧水溶液的合适浓度为0.2 %。

实施例1：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20 ml马铃薯培养基上，于25℃培养5-10天；向培养5-10天的链格孢营养体表面喷洒500μl浓度（质量）为0.5%的高锰酸钾溶液；用0.6 m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的链格孢营养体10分钟；再继续于25℃培养链格孢3天，收集孢子。

对照使用相同的20 ml马铃薯培养基，一直于25℃培养，不用浓度0.5%的高锰酸钾溶液处理。

经高锰酸钾溶液处理的链格孢其分生孢子产量为9×10⁷/cm²，对照的分生孢子产量为2×10⁷/cm²。采用0.5%高锰酸钾溶液处理过的链格孢分生孢子产量是其对照的4.5倍。

实施例2：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20 ml马铃薯培养基上，于25℃培养5-10天；向培养5-10天的链格孢营养体表面喷洒500μl 浓度为0.2 % (w/v)的双氧水；用0.6 m/s风速的无菌风吹送双氧水处理过的链格孢营养体10分钟；再继续培养链格孢3天，收集孢子。

对照使用相同的20 ml马铃薯培养基，一直于25℃培养，不用0.2%的双氧水处理。

经双氧水处理的链格孢其分生孢子产量为7×10⁷/cm²，对照的分生孢子产量为2×10⁷/cm²，采用0.2%的双氧水处理过的链格孢分生孢子产量是其对照的3.5倍。

实施例3：

将绿粘帚霉（Gliocladium virens）菌丝接种在20ml马铃薯培养基上，于25℃培养5-10天；向培养5-10天的链格孢营养体表面喷洒500μl 浓度（质量）0.5%的高锰酸钾溶液；用0.6m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的绿粘帚霉10分钟；再继续培养链格孢3天，收集孢子。

对照使用相同的20ml马铃薯培养基，一直于25℃培养，不用0.5%的高锰酸钾溶液处理。

经0.5%的高锰酸钾溶液处理的绿粘帚霉其厚垣孢子产量为2×10⁶/cm²，对照的厚垣孢子产量为9×10⁵/cm²，0.5%的高锰酸钾溶液处理过的绿粘帚霉其厚垣孢子产量是其对照的2.2倍。

实施例4：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20ml马铃薯培养基上，于16℃培养5-10天；向培养5-10天的链格孢营养体表面喷洒500μl 0.5%的高锰酸钾溶液；用0.6m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的链格孢10分钟；再继续培养链格孢三天后收集孢子。

对照使用相同的20 ml马铃薯培养基，一直于25℃培养，不用0.5%的高锰酸钾溶液处理。

经高锰酸钾溶液处理的链格孢其分生孢子产量为4×10²/cm²，对照的分生孢子产量为3×10²/cm²，0.5%的高锰酸钾溶液处理过的链格孢分生孢子产量是其对照的1.3倍。但由于温度不适宜该菌株的生长，其分生孢子产量极低。

实施例5：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20ml的水琼脂培养基上，于25℃培养5-10天；向培养5-10天的链格孢营养体表面喷洒500μl浓度（质量）0.5%的高锰酸钾溶液；用0.6m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的链格孢营养体10分钟；再25℃条件下继续培养链格孢3天，收集孢子。

对照使用相同的20 ml的牛肉膏琼脂培养基，一直于25℃培养，不用0.5%的高锰酸钾溶液进行处理。

经高锰酸钾溶液处理的链格孢其孢子产量为6×10⁷/cm²，对照的孢子产量为2×10⁷/cm²，0.5%的高锰酸钾溶液处理过的链格孢分生孢子产量是其对照的3倍。

实施例6：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20ml马铃薯培养基（液体）上，于25℃ 160转每分转速的摇床上培养5-10天；向培养5-10天的链格孢培养物中喷洒500μl浓度（质量）0.5%的高锰酸钾溶液并混匀；用0.6m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的链格孢培养物10分钟；再继续培养链格孢3天，收集孢子。

对照使用相同的20 ml马铃薯培养基（液体），一直于25℃培养，不用0.5%的高锰酸钾溶液处理。

经浓度0.5%的高锰酸钾溶液处理的链格孢其分生孢子产量为8×10⁸/cm²，对照的分生孢子产量为2×10⁸/cm²，0.5%的高锰酸钾溶液处理过的链格孢分生孢子产量是其对照的4倍.

实施例7：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20ml马铃薯培养基上，于25℃培养5-10天；向培养5-10天的链格孢液体培养物中加入500 μl 0.1%的高锰酸钾溶液并混匀；用0.6m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的链格孢培养物10分钟；再继续培养链格孢3天，收集孢子。

经浓度0.5%的高锰酸钾溶液处理的链格孢其分生孢子产量为2×10⁷/cm²，对照的分生孢子产量为2×10⁷/cm²，0.1%的高锰酸钾溶液处理过的链格孢分生孢子产量基本不变，过低浓度的强氧化剂其促产孢效果不明显。

实施例8：

将链格孢（Arternaria alternata）菌丝接种在20ml马铃薯液体培养基（液体）上，于25℃条件下，在每分60转的摇床上培养5-10天；向培养5-10天的链格孢营养体表面喷洒500μl 浓度（质量）0.5%的高锰酸钾溶液；用0.6m/s风速的无菌风吹送高锰酸钾溶液处理过的链格孢营养体10分钟；再继续培养链格孢3天，收集孢子。

经高锰酸钾溶液处理的链格孢其分生孢子产量为2×10²/cm²，对照的分生孢子产量为1×10²/cm，0.5%的高锰酸钾溶液处理过的链格孢分生孢子产量是其对照的2倍，但过低的转速会造成其分生孢子产量的大大降低。

Claims

1.一种提高真菌孢子产量的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1）将链格孢（Arternaria alternata）菌丝或绿粘帚霉（Gliocladium virens）菌丝接种到培养基上，在适宜的温度下培养5-10天；

2）向培养5-10天的真菌营养体表面喷洒500μl、浓度为0.5%的高锰酸钾，或500μl、浓度为0.2 % (w/v)的双氧水；

3）用0.6 m/s风速的无菌风对喷洒高锰酸钾或双氧水的真菌营养体吹送10分钟；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基是马铃薯培养基，水琼脂培养基，玉米粉培养基，麦芽提取物-酵母提取物-胰蛋白胨培养基其中之一。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种链格孢（Arternaria alternata）菌丝或绿粘帚霉（Gliocladium virens）菌丝后的培养基在每分钟120-180转的摇床上进行培养。