CN114836326B - 一种使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进葡萄白腐病菌快速产孢的培养基及产孢培养方法。该培养基为硫酸铵葡萄枝条培养基，由硫酸铵、葡萄枝条和水制成。使用本发明的硫酸铵葡萄枝条培养基可有效解决葡萄白腐病菌产孢时间长，产孢量不稳定的问题，为研究葡萄白腐病菌致病机制、侵染规律、菌植互作和葡萄的抗病育种等方面奠定了基础。

Description

一种使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基及其应用。

背景技术

当前，随着葡萄产业的快速发展和葡萄种植面积的不断扩大，葡萄病害的发生也逐年增加。葡萄白腐病是葡萄上一种重要的真菌病害，在世界各地的葡萄产区均有发生，其病原菌主要有Coniella diplodiella(Speg.)、C.fragariae、Pilidiella castaneicola和Coniella vitis，Coniella vitis是我国葡萄白腐病的主要病原菌。该病原菌主要侵染果穗(包括果梗、果粒)，也可危害葡萄新梢和嫩叶。目前，关于葡萄白腐病菌Coniella vitis的研究主要集中在分离鉴定、形态学特征及致病性等方面，其致病机理的相关研究还处于起步阶段。致病机制的研究将有助于该病害提出高效、精准、绿色的防控策略的提出，获取大量分生孢子是研究病原菌基因功能、侵染过程和葡萄抗病育种的重要环节。

目前，Coniella vitis产孢的培养基为PDA培养基，但是其利用PDA固体培养基的产孢时间较长(一般10-14天产孢)，分离获得的分生孢子量较少而且产孢量不稳定，是制约葡萄白腐病研究的关键因素。因此，开发一种促进葡萄白腐病菌快速产孢的培养基及产孢培养方法，为顺利进行后续的侵染过程、致病机制和抗病品种鉴定等研究奠定了基础，是本领域亟待解决的关键技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何使葡萄白腐病菌快速产孢。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基。

本发明的使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基，由包括硫酸铵、葡萄枝条和水的原料制成。

上述培养基中，所述原料由硫酸铵、葡萄枝条和水组成。

上述培养基中，所述硫酸铵的含量为1.5g/L，所述葡萄枝条的含量为以干重计10-20g/L。优选的，所述培养基中所述硫酸铵的含量为1.5g/L，所述葡萄枝条的含量为以干重计10g/L。

上述硫酸铵葡萄枝条培养基中，所述葡萄枝条的长度为1-3cm，直径0.2-0.5cm。

上述硫酸铵葡萄枝条培养基中，葡萄的品种可选自巨峰、红绣球、夏黑、赤霞珠、品丽珠、摩尔多瓦等中的任一种。

本发明还提供上述硫酸铵葡萄枝条培养基的制备方法，包括将硫酸铵和葡萄枝条溶于水中，定容，121℃灭菌20min。

本发明还提供一株垫壳孢属菌株，所述垫壳孢属菌株为Coniella vitis，菌株编号GP1，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23888。

本发明还提供使葡萄白腐病菌产生孢子的方法，，包括以上述硫酸铵葡萄枝条培养基培养葡萄白腐病菌，得到葡萄白腐病菌的孢子。

上述方法中，所述培养的为所述培养的为于28℃、180rpm、每天12小时光照和12小时黑暗条件下培养7天。

上述方法中，所述葡萄白腐病菌(Coniella vitis)为保藏中心登记入册编号CGMCC No.23888的菌株GP1。

本发明还提供了上述硫酸铵葡萄枝条培养基的制备方法在葡萄白腐病菌产孢中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

本发明提供的促进葡萄白腐病快速产孢的培养基，不仅能缩短葡萄白腐病菌的产孢时间(从10-14天产孢缩短为7天)，且能使葡萄白腐病菌在液体环境更加稳定的大量产孢(高达2.35×10⁶个孢子/mL)，有利于后续开展侵染、致病机制和葡萄抗病鉴定研究。与本发明相比，已报道的在PDA固体平板产孢存在产孢时间长(10-14天)，产孢量不稳定，配制孢子悬浮液程序复杂(需要从平板刮取后用无菌水配置孢子悬浮液)等局限性。

本发明中培养基原料简单，成本低廉，制备过程简单易操作，利用本发明中的产孢培养方法能够促进葡萄白腐菌快速产孢，在病原菌致病机理、病原菌与寄主互作、抗病机制研究中具有较高的应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例中菌株GP1的菌落形态及孢子形态。其中，图1的A为菌落形态(PDA平板正面)；图1的B为菌落形态(PDA平板反面)；图1的C为分子孢子形态；图1的D为分生孢子形态(含油球)。

图2为本发明实施例中菌株GP1基于3个看家基因序列采用邻近法构建的系统发育进化树。

图3为本发明实施例3不同葡萄品种的硫酸铵葡萄枝条培养基的产孢量结果图。

保藏说明

拉丁名：Coniella vitis

菌株编号：GP1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年12月01日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23888

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中葡萄白腐病菌菌株GP1的分离及鉴定如下：

病原菌分离

葡萄白腐病菌菌株GP1是本课题组于2020年10月在山东省的发病葡萄叶片上分离的。采用常规组织分离法对并葡萄病组织进行病原菌的分离，在发病叶片病健交界处切取小块组织，置于75％的酒精中消毒1min，然后用无菌水冲洗3次，将小块组织置于无菌的培养皿中在操作台中吹干后放在马铃薯琼脂培养基(PDA)平板上，置于28℃培养箱中培养。2d后挑取病叶组织边缘的菌丝进行纯化培养，纯化得到的菌株储存于4℃冰箱备用。

形态学鉴定

将菌株GP1在PDA平板上活化3d后，用无菌的打孔器在菌落边缘打菌饼(直径8mm)，将菌饼接在PDA培养基上，置于28℃的培养箱中培养3d，并记录菌落正面反面的形态特征。待其在PDA培养基上产孢后，在显微镜下观察分子孢子器及分生孢子的大小和形状。形态学观察发现，该病原菌在PDA平板上菌丝初为白色，在PDA培养基上10天产生分生孢子器，分生孢子器单个或几个聚集着生在PDA上。分生孢子器呈球形或椭球形，单室、具有孔口，初期透明后期变为棕褐色或黑色，长为145.46±17.01μm，宽为131.12±12.07μm(n＝30)。分生孢子长为7.92±1.20μm，宽5.18±0.61μm(n＝30)，长:宽为2.0，未成熟时透明变淡棕色，窄椭球形或梭形，通常在一侧稍变平，两侧逐渐变细，内部含1-3个油球(参见图1)。

分子生物学鉴定

将菌株GP1在PDA培养基上培养5d，收集菌丝至无菌的1.5mL的离心管，利用组织研磨仪将其磨碎，采用Omega真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA。

用ITS1和ITS4组成的引物对ITS基因进行扩增，具体引物序列如下：

ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；

ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

用TEF1-728F和TEF1-986R组成的引物对EF-1a基因进行扩增，具体引物序列如下：

TEF1-728F:5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’；

TEF1-986R:5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’。

用LR7和LROR组成的引物对LSU基因进行扩增，具体引物序列如下：

LR 7:5’-TACTACCACCAAGATCT-3’；

LROR:5’-ACCCGCTGAACTTAA GC-3’。

上述扩增的反应体系(50μL)均如下：2×Taq Master Mix(Dye Plus)(南京诺维赞)25μL、上下游引物各(25pmol/L)1.0μL，模板DNA(50ng/μL)1.0μL、RNA free H₂O 22μL。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，将目的片段大小正确的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，ITS基因的序列如序列表中序列1所示，EF-1a基因的序列如序列表中序列2所示，LSU基因的序列如序列表中序列3所示。测序得到的序列在NCBI网站上进行比对，并在NCBI下载相关菌株的ITS、EF-1a和LUS序列，用MEGA 7软件进行系统发育分析。

结果发现菌株GP1与Coniella vitis JZB370001、Coniella vitis JZB370006、Coniella vitis JZB370009等菌株聚在一个分支，亲缘关系最近，而与其他Coniella属的菌株类群位于不同的分支，亲缘关系较远，说明该病原菌为Coniella vitis(参见图2)。

实验例1：促进葡萄白腐菌产孢培养基的筛选

配置8种不同的培养基，包括：硫酸铵培养基、硫酸铵葡萄枝条培养基、CMC培养基、CMC葡萄枝条培养基、CM培养基、CM葡萄枝条培养基、10％PD培养基、10％PD葡萄枝条培养基、查比克培养基和查比克葡萄枝条培养基。各培养基配置方法如下：

硫酸铵培养基配置方法(以1L为例)：(NH₄)₂SO₄ 3g，加蒸馏水至1000mL。

硫酸铵葡萄枝条培养基配置方法(以1L为例)：(NH₄)₂SO₄ 3g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

CMC培养基配置方法(以1L为例)：羧甲基纤维素(CMC)15g，酵母提取物(YeastExtract)1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NH₄NO₃ 1g，补蒸馏水至1000mL。

CMC葡萄枝条培养基配置方法(以1L为例)：CMC 15g，酵母提取物1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NH₄NO₃ 1g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

CM培养基配置方法(又名完全培养基，以1L为例)：酵母提取物6g，酸水解酪蛋白6g，蔗糖10g，加蒸馏水至1000mL。

CM葡萄枝条培养基配置方法(以1L为例):酵母提取物6g，酸水解酪蛋白6g，蔗糖10g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

10％PD培养基配置方法(以1L为例):马铃薯浸粉0.6g，葡萄糖2g，加蒸馏水至1000mL。

10％PD葡萄枝条培养基配置方法(以1L为例):马铃薯浸粉0.6g，葡萄糖2g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

查比克培养基配置方法(以1L为例)：NaNO₃ 2g，KCL 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，KHPO₄ 1g，MgSO₄7H₂O 0.5g，蔗糖30g，加蒸馏水至1000mL。

查比克葡萄枝条培养基配置方法(以1L为例)：NaNO₃ 2g，KCL 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，KHPO₄ 1g，MgSO₄7H₂O 0.5g，蔗糖30g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

上述葡萄枝条采自一年生自巨峰葡萄植株，葡萄枝条的直径为0.2-0.5cm，剪成1-3cm小段，利用烘箱烘干后待用。

上述各培养基在充分混匀后，于121℃高压湿热灭菌20min。

将葡萄白腐病菌菌株GP1(CGMCC No.23888)在PDA平板上于28℃下培养3天，然后在无菌条件下用打孔器从菌落边缘打取直径为8mm的菌饼，将5块菌饼移入装有上述方法制得的不同培养基上的三角瓶中，每个三角瓶(250mL)含有100mL培养基，每种培养基重复数为3次。

上述接种后的培养基，于28℃、180rpm、半光照半黑暗条件(每日12小时光照/12小时黑暗)下震荡培养7天。对不同类型培养基产孢数量进行统计，具体结果见表1。

表1不同类型培养基的产孢量

注：表1中“/”代表不产孢，不同大写字母表示差异性显著，P<0.05。

表1表明以硫酸铵葡萄枝条培养基培育葡萄白腐病菌菌株GP1的产孢量最高，达到3.67×10⁵个孢子/mL。以下实施例针对硫酸铵葡萄枝条培养基进行优化。

实施例2硫酸铵葡萄枝条培养基成分含量优化

配置不同组分含量的硫酸铵葡萄枝条培养基，具体配置方法如下(以1L为例)：

(1)硫酸铵1.5g，葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(2)硫酸铵1.5g，葡萄枝条20g，加蒸馏水至1000mL。

(3)硫酸铵1.5g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

(4)硫酸铵3g，葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(5)硫酸铵3g，葡萄枝条20g，加蒸馏水至1000mL。

(6)硫酸铵3g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

(7)硫酸铵6g，葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(8)硫酸铵6g，葡萄枝条20g，加蒸馏水至1000mL。

(9)硫酸铵6g，葡萄枝条40g，加蒸馏水至1000mL。

上述葡萄枝条采自一年生自红葡萄植株，葡萄枝条的直径为0.2-0.5cm，剪成1-3cm小段，利用烘箱烘干后待用。

上述各不同组分含量的硫酸铵培养基于121℃高压湿热灭菌20min。

将葡萄白腐病菌菌株GP1(CGMCC No.23888)在PDA平板上于28℃常规条件下培养3天，然后在无菌条件下用打孔器从菌落边缘打取直径为8mm的菌饼，将5块菌饼移入装有上述方法制得的不同培养基上的三角瓶中，每个三角瓶(250mL)含有100mL培养基，每种培养基重复数为3次。

上述接种后的培养基，于28℃，180rpm半光照半黑暗条件(每日12小时光照/12小时黑暗)下培养7天。

对葡萄白腐病菌在不同组分含量的硫酸铵葡萄枝条培养基中产孢数量进行统计，具体结果见表2。

表2不同组分含量的硫酸铵葡萄枝条培养基产孢量

注：表中不同大写字母表示差异性显著，P<0.05。

表2表明硫酸铵葡萄枝条培养基中硫酸铵的含量为1.5g/L、葡萄枝条含量为10g/L时，硫酸铵葡萄枝条培养基培育葡萄白腐病菌菌株GP1的产孢量最高，达到2.35×10⁶个孢子/mL。

实施例3不同品种的葡萄枝条对硫酸铵培养基产孢的影响

配置不同葡萄品种的硫酸铵葡萄枝条培养基，配置方法如下(以1L为例)：

(1)硫酸铵1.5g，巨峰葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(2)硫酸铵含量1.5g，红绣球葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(3)硫酸铵含量1.5g，夏黑葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(4)硫酸铵含量1.5g，赤霞珠葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(5)硫酸铵含量1.5g，品丽珠葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

(6)硫酸铵含量1.5g，摩尔多瓦葡萄枝条10g，加蒸馏水至1000mL。

上述葡萄枝条为采自一年生自红提葡萄植株，葡萄枝条的直径为0.2-0.5cm，剪成1-3cm小段，利用烘箱烘干后待用。

上述各不同组分含量的硫酸铵培养基于121℃高压湿热灭菌20min。

将葡萄白腐病菌菌株GP1(CGMCC No.23888)在PDA平板上于28℃常规条件下培养3天，然后在无菌条件下用打孔器从菌落边缘打取直径为8mm的菌饼，将5块菌饼移入装有上述方法制得的不同培养基上的三角瓶中，每个三角瓶(250mL)含有100mL培养基，每种培养基重复数为3次。

上述接种后的培养基，于28℃，180rpm半光照半黑暗条件(每日12小时光照/12小时黑暗)下培养7天。

统计采用不同品种的葡萄枝条的硫酸铵葡萄枝条培养基对葡萄白腐病菌菌产孢数量的影响，利用SPSS 22.0对不同葡萄品种的硫酸铵葡萄枝条培养基的产孢量进行单因素方差分析，所得数据均以平均数±标准差。采用LSD-t检验对三组数据进行两两比较，P<0.05时，表示差异显著。

具体结果见图3，表明各品种的葡萄枝条均取得了较好的产孢数量，葡萄的品种对产孢量影响无显著性差异。

这些结果说明以本发明公开的硫酸铵葡萄枝条培养基能提高葡萄白腐病菌菌株产孢数量，效果最佳的硫酸铵葡萄枝条培养基的配置方法为：以硫酸铵、巨峰葡萄枝条、蒸馏水制备的培养基，该培养基中硫酸铵的含量为1.5g/L，巨峰葡萄枝条含量为10g/L。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 山东省葡萄研究院

<120> 一种使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基及其应用

<130> GNCSY220294

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggaagctga tgtgtcgcag gacacaaccc cagataccct ttgtgaactt attcttatat 60

cgttgcctcg gcgttgagct gggggcttct ttccaaggag ctctcccatg gtctctcggg 120

acgatggagc aagcccgccg gcggcccttc taaactcttg tttttatcac gtatctcttc 180

tgagttattc aaaacaaaat gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat 240

cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 300

gaatctttga acgcacattg cgcccgctgg aattccagcg ggcatgcctg ttcgagcgtc 360

atttcacccc tcaagccttg cttggtgttg gagcactacc gtttgtataa agcggtaggc 420

tctgaaattc agtggcgggc tcgctaagac tctgagcgta gtagtttatc acctcgcttt 480

ggaagaatta gcggtgctct tgccgtaaaa ccccccaaat ttctgaattt tgacctcgga 540

tcaggtagga atacccgctg aacttaagca tatcaaaagc ccggaggaa 589

<210> 2

<211> 323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcattcctc cctatagtct ttcacacatt ccaaacaagc aatctcggtt tgaacgccaa 60

taaagcgttc gcgccttcaa gagatcaaga aatttggtat caagctttca gacctgacga 120

gttttgtccc atcgcacatt ccttgttttt ttcggtgcgg ggtacactct tatctcgaat 180

aaaacgtgac ccacccacgc tacggcacca caacgcttct ctcggcactc gcctacctct 240

acgtcaacat tgcaggcgaa atcaagatgc taacatgact cctatcacag ctgctgagct 300

cggtaagggt tcccttcaag taa 323

<210> 3

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagggaga accaacaggg attgccctag taacggcgag tgaagcggca acagctcaaa 60

tttgaaatct ggctctcggc cccgctttga tttttgcaga aggtgcttgg ggcgacgccc 120

cttccgattt ccgtggcacg gcaccccata gggggtgaga cccccgtgcg ggcgtgcccc 180

taccgtctga gaatctcctt ccaagactcg aatattgtga aagtgctgct caatgtgaga 240

ggtatctctc ttctaaatct atatagcgcc cagacaccga tagcgcacaa atagagagct 300

caaaatatga aaagcctttt gaaaggagag ttacaaaacg tgtgattgtg gaaaaaggga 360

agctctcatg accacttgtg ctgtggccct catatccggt tctctccggt gtgttctccc 420

cccgtccagg ccacctccat ttttgctggg ggaataaaac gggaggaact ggggccccct 480

tcggaagggt gttataccct accgtacgat accctggcgg ctgtcgaggt tgccgcatct 540

gcaatgatgc tgtaatggtg gtcatcgacg acccttcttg acggaggacc aaggagtctt 600

ccatgcagtg ttcgtttgtg tgtccccccg cacgcgtaat gagagtgata ttagagtgat 660

agcttcgcat cctcaccgac cgatcctgat gttctacgga tgtgatttga gtaagagtct 720

ttagcggaac cacccaaaag acaatgaact atgcttgtat atgatgaaga cagaggaaac 780

tctggaggga ggctcgcatc gcttctgacc tgcaaaacca tcgtcaaata tgagcttggc 840

gacgactact aatcccatct gtctagtagc tgtctaccaa cgatgtctcc ctcaagataa 900

cattgatgac attcagtttt gtgaggtaaa tcgaatgatt atcgactcgc gcgc 954

Claims (6)

1. 使葡萄白腐病菌产生孢子的培养基，其特征在于，所述培养基由硫酸铵、葡萄枝条和水的原料制成，所述培养基中硫酸铵的含量为1.5g/L，葡萄枝条的含量为以干重计10-20g/L；所述葡萄白腐病菌为垫壳孢属菌株，所述垫壳孢属菌株为Coniella vitis，菌株编号GP1，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23888。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中硫酸铵的含量为1.5g/L，葡萄枝条的含量为以干重计10g/L。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述葡萄枝条的长度为1-3cm，直径0.2-0.5cm。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述葡萄的品种选自巨峰、红绣球、夏黑、赤霞珠、品丽珠、摩尔多瓦中的任一种。

5. 使葡萄白腐病菌产生孢子的方法，其特征在于：以权利要求1-4任一所述的培养基培养葡萄白腐病菌，得到葡萄白腐病菌的孢子；所述葡萄白腐病菌为垫壳孢属菌株，所述垫壳孢属菌株为 Coniella vitis，菌株编号GP1，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23888。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养为于28℃、每天12小时光照和12小时黑暗条件下培养7天。