CN106635839B - 一种从土壤中分离长喙壳菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种从土壤中分离长喙壳菌的方法。本发明采用胡萝卜进行长喙壳菌的富集，并通过挑取单个子囊孢子团划线的方法进行长喙壳菌的分离纯化，有效的从土壤中分离到长喙壳菌，本发明因部分操作无需严格的无菌条件，适合野外考察、田间调查过程中的菌株收集，大大提高了工作效率；挑取单个子囊孢子团划线进行靶标菌的分离纯化，有效的提高了分离纯化效率，节省时间；另外本发明成本低、使用范围广、安全环保。

Description

一种从土壤中分离长喙壳菌的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种从土壤中分离长喙壳菌的方法。

背景技术

长喙壳菌(Ceratocystis spp.)是一种对农作物、经济林木具有严重危害的土壤习居菌，其寄主广泛，可危害14个属30余种木本及草本植物。在我国，长喙壳菌主要危害甘薯、石榴、芋头、枇杷、桉树、三角椰和天南星等植物，近年来其危害的发生有蔓延加剧之势。该菌危害块茎类作物，主要引起腐烂等症状；危害木本植物，主要引起溃疡、萎蔫等症状，严重时造成整株植物枯萎死亡。我国疆土辽阔，作物种类丰富，土壤类型多样，农田和自然生态土壤中潜藏着长喙壳属真菌，在土壤微生物菌群和植物长期共同进化过程中，该菌存在引发病害并给农业生产带来重大损失的风险。

土壤中病原菌的分离作为植物病理研究以及病害防控研究中最基本的步骤，目前，土壤中病原菌的分离方法大多采用稀释平板法。该方法将适量土壤样品置于蒸馏水中摇培2h，静置30min后取其上清液作为土壤浸提液，通过系列稀释的方法设置3-5个稀释浓度，随后分别取各浓度下的稀释液200μL涂布于培养基后进行观察培养及靶标菌的分离。该方法的不足在于：1)整个分菌过程均需在实验室内进行，且要求严格的无菌条件，所用实验器材及仪器设备较多，这为野外考察、田间调查过程中病样直接分离获得靶标菌种带来不便；2)用该方法分离土壤中的靶标菌时工作量较大，不同的土壤样品在分离靶标菌时土壤浸提液的稀释倍数较难把控，对长喙壳菌等一些生长较慢的靶标菌的分离效率极低。

目前，研究人员在分离长喙壳菌侵染的植物组织上的靶标菌时，主要采用PDA平板分离法或胡萝卜诱导分离法，而鲜有从土壤样品中分离长喙壳菌的报道，至今尚无研究阐述从土壤样品中利用植物材料富集和分离长喙壳菌的方法。因此，为提高病原研究效率及病害的前期防控，开发一种简单、有效、易操作的从土壤生境中分离长喙壳菌的方法是必要的。

发明内容

本发明的目的是提出一种从土壤中分离长喙壳菌的方法，具体技术方案如下：

一种从土壤中分离长喙壳菌的方法，具体包括如下步骤：

1)胡萝卜用自来水清洗干净，去表皮后置于乙醇中消毒，用餐巾纸将其表面的乙醇吸干，用解剖刀切成厚度均匀的薄片，之后用打孔器在薄片中央制取相等直径的碟片，备用；

2)将步骤1)中的胡萝卜碟片置于培养皿中，两两重叠，土壤样品置于胡萝卜碟片之间，25～28℃培养3～10天，富集长喙壳菌；

3)用接种环挑取步骤2)中富集的长喙壳菌的子囊壳喙顶端的单个子囊孢子团，在MYEA培养基上划线，25～28℃培养3～5天，挑取单个菌落在新的MYEA培养基上划线，即得长喙壳菌株的单菌落；

4)将步骤3)获得的靶标菌的纯菌落在MYEA培养基上培养2周后，在光学显微镜下观察其菌丝、子囊壳、分生孢子、厚垣孢子及子囊孢子形态；另外，刮取菌落表面的菌丝及孢子的混合物，提取总DNA，并进行PCR扩增，并进行序列比对；结合序列鉴定和形态观察结果确定分离到的标靶菌为长喙壳属的真菌。

步骤1)中乙醇的体积浓度为70～75％，消毒时间为1～2min，薄片的厚度为3～5mm，碟片的直径为2.5cm。

步骤2)中培养皿的中央放置一团无菌水浸湿的棉花。

步骤2)中土壤样品的质量为1g。

步骤3)和步骤4)中MYEA培养基的组成为：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂16g/L和100mg/L氯霉素。

步骤4)中PCR扩增的引物为：

上游引物ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和

下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

步骤4)中靶标菌的形态特征为：菌株能产生芳香性活性挥发物，子囊壳直立生长于培养基上，喙顶端着生子囊孢子团，粘稠、黄色至金黄色，形状不规则。子囊壳棕色至黑色，基部球形，喙修长，喙端孔口菌丝无色透明，呈分散状或聚合状。子囊孢子为典型的帽盔状，分生孢子棒形，粉孢子厚壁、表面光滑、单生或串生、棕色至浅棕色。

步骤4)中扩增序列如SEQ ID No.1所示

所述解剖刀、打孔器及接种环用95％的乙醇消毒，并在酒精灯的外焰上反复灼烧2～3遍。

本发明的有益效果为：

(1)菌株分离效率高：本发明从土壤中分离长喙壳菌的方法在程度上规避了稀释平板法不同土壤样品的靶标菌分离时土壤浸提液的稀释倍数较难把控的难题，减少了工作量；胡萝卜作为有效的分离长喙壳菌的植物材料，能显著提高长喙壳菌等一些生长较慢的靶标菌的分离效率；本发明结合长喙壳菌的形态特征，采用挑取单个子囊孢子团划线的方法进行靶标菌的分离纯化，提高了分离纯化效率，节省时间。

(2)仪器设备简单：部分操作无需严格的无菌条件，需无菌操作的步骤在超净台内即可完成。

(3)培养过程简单：分离过程仅需一种植物材料和一种培养基。

(4)成本低：菌株分离全过程所用到的仪器简单，诱导富集靶标菌所用的植物材料价格便宜，易购买。

(5)适用范围广：本发明因部分操作无需严格的无菌条件，植物材料胡萝卜可预先在实验室内备好，因此适合野外考察、田间调查过程中的菌株收集，大大提高了工作效率；同时可减少因土壤样品的长时间保存引起的微生物大量滋生而给靶标菌分离带来的干扰，有效的提高了分离效率。

(6)安全环保：分离过程中植物材料胡萝卜选用乙醇消毒，避免了常用的烈性消毒剂如次氯酸钠、升汞等，整个操作过程更加安全、环保。

附图说明

图1为胡萝卜诱导富集土壤样品中长喙壳菌的方法示意图，其中A为胡萝卜碟片，B为棉花团。

图2为胡萝卜碟片富集的长喙壳菌株示意图，其中A为胡萝卜碟片，B为长喙壳菌株子囊壳修长的喙，C为喙顶端子囊孢子团。

图3为长喙壳菌株子囊壳喙顶端的单个子囊孢子团的分离纯化示意图。

图4为长喙壳菌单菌落的形态特征图，其中A为菌落形态，B为子囊壳形态。

图5为长喙壳菌株子囊壳和子囊孢子团形态特征图。

图6为长喙壳菌株显微结构特征图，其中A为分生孢子，B为子囊壳，C粉孢子，D为菌丝，E喙端孔口菌丝形态。

具体实施方式

本发明提出了一种从土壤中分离长喙壳菌的方法，下面结合实施例对本发明做进一步介绍。

下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可通过商业途径购买到。

实施例1：长喙壳菌的分离纯化

(1)新鲜且健康的胡萝卜用自来水冲洗干净，去其表皮后置于体积浓度为75％的乙醇中消毒1～2min，用洁净的餐巾纸吸干其表面乙醇，之后切成厚度为3～5mm且均匀的薄片，再用直径为2.5cm的打孔器在胡萝卜薄片中央取相等直径的碟片，备用；

(2)将步骤(1)中的胡萝卜碟片置于直径为9cm的培养皿中，每个培养皿中放置12片胡萝卜碟片，两两重叠，同时用电子天平秤取从云南蒙自采集的土壤样品，1g/份；将称好的土壤样品置于两片重叠的胡萝卜碟片之间，并在培养皿的中央放置一团无菌水浸湿的棉花保湿(如图1)；置于26℃恒温培养箱中培养3～10天，观察胡萝卜碟片上长喙壳菌的富集情况(如图2)；从胡萝卜碟片诱导分菌的第3天起，每隔一天观察胡萝卜碟片上富集到的真菌中是否有长喙壳菌的子囊壳形成，此外注意观察培养皿内水气的产生量，若培养皿内有可流动的水滴，应在超净工作台内将其晾干；

(3)用接种环挑取步骤(2)中胡萝卜碟片上富集到的长喙壳菌的子囊壳喙顶端的单个子囊孢子团，在MYEA培养基上以划线的方法分离、纯化，于26℃恒温培养箱中培养3天(如图3)后挑取单个菌落在新的MYEA培养基上划线，纯化培养，如此重复1-2次，即得长喙壳菌的纯菌落(如图4)。

MYEA培养基的配置方法：1L蒸馏水中加入麦芽提取物20g、酵母2g、琼脂16g、氯霉素0.1g，加热至各溶质溶化后用蒸馏水定容至1L，高温121℃，灭菌20min，倒入9cm×1.5cm平皿中，每皿20ml培养基，培养基凝固后备用。

实施例2：分离物的鉴定

(1)序列鉴定

将步骤(3)获得的靶标菌的纯菌落在MYEA培养基上培养2周后，用解剖刀(解剖刀手柄型号为4号，刀片型号为24号)刮取200mg的菌落表面的菌丝及孢子的混合物，用CTAB法提取总DNA，提取的总DNA采用下述引物对进行PCR扩增：

上游引物ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和

下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，

扩增序列如SEQ ID No.1所示。PCR产物用质量分数1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后送博迈德公司测序，并将测序结果在NCBI数据库中比对分析以进一步确定分离物。

PCR反应体系：

PCR反应程序：95℃预变性5min；随后94℃变性45s，56℃退火40s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃延伸10min，置于4℃保持。

(2)形态观察

将步骤(3)获得的靶标菌的纯菌落在MYEA培养基上培养2周后，在光学显微镜下观察其菌丝、子囊壳、分生孢子、厚垣孢子及子囊孢子形态，如图5和6。靶标菌能产生芳香气味，子囊壳直立生长于培养基上，喙顶端着生子囊孢子团，粘稠、黄色，形状不规则；子囊壳黑色，基部球形，喙修长，喙端孔口菌丝无色透明，呈分散状；子囊孢子为典型的帽盔状，分生孢子棒形，粉孢子厚壁、表面光滑、单生或串生、棕色至浅棕色。结合《真菌鉴定手册》分类方法进行鉴定。

结合上述序列鉴定和形态观察可以确定分离到的标靶菌为长喙壳属的真菌。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种从土壤中分离长喙壳菌的方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 667

<212> DNA

<213> 扩增序列

<400> 1

tttcctccgc cttattgata tgcttaagtt cagcgggtat tcctacctga tccgaggtca 60

accttgtgaa aagttcaaca aaagttgagc gggtttagcg gcgtgttaca caagaacttc 120

aaagtgtaaa aattagaaat tttatactac acaggggagt tggcaagtat aacagccgat 180

acatttcggc ggcctgttca ggggagaaca ggacctccaa cgccaagaac aaaagagtct 240

tgagtggtga aatgacgctc ggacaggcat gcctggcaga atactgccag gcgcaatgtg 300

cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc gcatttcgct 360

gcgttcttca tcgatgctag agccaagaga tccgttgttg aaagttttaa ctttttttat 420

agttatgcca ctcagcaatg aaaaatctag aaaataataa aaagagttta cagtggcgaa 480

gactaatact gctggcagcg gtgccctctc ttcagaaggg ccctaccacc aaaacagcat 540

tcatctcact acaagatagg gtacgttcac acatggttta tagagtacaa aaactcagta 600

atgatccctc cgctggttca ccaacggaga ccttgttacg acttttactt cctctaaatg 660

accaaga 667

Claims (6)

1.一种从土壤中分离长喙壳菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)胡萝卜用自来水清洗干净，去表皮后置于乙醇中消毒，用餐巾纸将其表面的乙醇吸干，用解剖刀切成厚度均匀的薄片，之后用打孔器在薄片中央制取相等直径的碟片，备用；

2)将步骤1)中的胡萝卜碟片置于培养皿中，两两重叠，土壤样品置于胡萝卜碟片之间，25～28℃培养3～10天，富集长喙壳菌；

3)用接种环挑取步骤2)中富集的长喙壳菌的子囊壳喙顶端的单个子囊孢子团，在MYEA培养基上划线，25～28℃培养3～5天，挑取单个菌落在新的MYEA培养基上划线，得靶标菌的纯菌落；

4)将步骤3)获得的靶标菌的纯菌落在MYEA培养基上培养2周后，在光学显微镜下观察其菌丝、子囊壳、分生孢子、厚垣孢子及子囊孢子形态；另外，刮取菌落表面的菌丝及孢子的混合物，提取总DNA，并进行PCR扩增，并进行序列比对；结合序列鉴定和形态观察结果确定分离到的标靶菌为长喙壳属的真菌；

步骤3)和步骤4)中MYEA培养基的组成为：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂16g/L和100mg/L氯霉素；步骤1)中乙醇的体积浓度为70～75％，消毒时间为1～2min，薄片的厚度为3～5mm，碟片的直径为2.5cm；步骤2)中培养皿的中央放置一团无菌水浸湿的棉花。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中土壤样品的质量为1g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中PCR扩增的引物为：

上游引物ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和

下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中靶标菌的形态特征为：菌株能产生芳香性活性挥发物，子囊壳直立生长于培养基上，喙顶端着生子囊孢子团，粘稠、黄色至金黄色，形状不规则；子囊壳棕色至黑色，基部球形，喙修长，喙端孔口菌丝无色透明，呈分散状或聚合状；子囊孢子为典型的帽盔状，分生孢子棒形，粉孢子厚壁、表面光滑、单生或串生、棕色至浅棕色。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中扩增序列如SEQ ID No.1所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解剖刀、打孔器及接种环用95％的乙醇消毒，并在酒精灯的外焰上反复灼烧2～3遍。

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