CN106967612A - 产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌及其获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种稻绿核菌，尤其是一种产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌及其获取方法。通过采集源的分离和纯化后获得。采用上述方法获得的稻绿核菌可以产五种毒素，该稻曲病菌(稻绿核菌)ZZY‑2(Ustilaginoidea virens ZZY‑2)已于2016年4月26日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2016230。

Description

产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌及其获取方法
技术领域
本发明涉及一种稻绿核菌，尤其是一种产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌及其获取方法。
背景技术
稻曲病是一种水稻真菌病害，由绿核菌属绿核菌Ustilaginodea virens(Cooke)Takahashi侵染水稻穗部引起。稻曲病发生较为普遍，在中国、日本、美国、印度、菲律宾等多个国家均有出现，属于世界性水稻病害(Fu et al，2015；Ashizawa et al，2010；Hamed etal，2014)。20世纪80年代前，稻曲病仅零星分布于中晚稻田，为水稻次要病害；但随着水稻品种、耕作方式、施肥用量及气候环境等因素改变，近年来，稻曲病已由过去的零星分布转变成为水稻生产中的主要病害之一(王文斌等，2014)。稻曲病不但在水稻穗部形成稻曲球，严重影响谷粒的生长，降低水稻的产量与品质，而且其病原真菌一一稻绿核菌Ustilaginodea virens(Cooke)Takahashi所产生的稻曲病菌毒素对人畜具有毒害作用(杨丽敏等，2012；范允卿等，2012)。目前，已逐渐引起了专家学者对稻曲病产生菌以及所产稻曲病菌毒素的广泛关注 (王伟刚等，2009)。
稻曲病菌属于一种寄生性较强腐生性较弱的真菌，稻曲球营养丰富，而且又暴露于自然环境中，常伴生大量的腐生细菌和真菌及其它病原菌，再加上稻绿核菌生长非常缓慢，故在培养的过程中极易受到其他病原菌的污染，因此，相对其他真菌来说，稻绿核菌的分离成功率很低。然而在实际的分离过程中，研究人员普遍发现采用稻曲球内层组织分离法可以成功分离到稻曲病菌，但其培养时间较长，分离速度较慢，比较耗时。但该方法由于选用的是内部菌丝，杂菌较少，成功分离的机率较高。厚垣孢子悬液法，稻曲球经无菌水冲洗即可配制成厚垣孢子悬浮液，由于稻曲球表层伴有大量其他病原菌，它们的生长速度快于稻曲病菌的生长速度，极易污染稻曲病菌，而且生长速度过快的杂菌覆盖于少量馒头状的稻曲病菌单菌落上，加大分离纯化的难度。稻曲球法的缺点是多种病原菌伴生于稻曲球，在培养过程中亦可迅速生长而污染目标菌。菌核萌发法较易成功，有研究证明菌核是稻曲病菌高效分离的首选材料，但菌核形成受环境条件限制，不易收集获取菌核；而且南方稻区少见，采用此法分离南方稻曲病菌效果并不理想。孢子振落法，由于稻曲表面不作消毒处理，稻曲表面大量的杂菌易在培养基表面快速生长，影响厚垣孢子萌发、生长及菌落的纯化，同厚垣孢子悬浮液法一样易受其他病菌污染，不易成功获得稻曲病菌株。
因此，在传统的稻绿核菌只能得到一种毒素。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种可以产五种稻曲病菌毒素的产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌及其获取方法。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌，保藏号为CCTCC NO：M2016230，通过如下方法获得：将采集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒钟，然后放于酒精灯上自燃5秒钟，用无菌滤纸吸干表面的水分，将表层的组织在无菌操作状态下清理干净，然后用无菌手术刀将稻曲球切开，夹取中间层，接种到含终浓度为0.05g/L氯霉素的无菌PSA平板培养基上，每皿接种3个点，每一样品设3个重复，接种后的培养皿于28℃恒温培养箱培养，待菌落长出后(3-5d)，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落或者挑取边缘的菌丝移至新鲜配制且已灭菌的PSA平板培养基中，进行反复纯化；将纯化后的菌株接种到新鲜配制的无菌PSA平板上进行活化，活化后的菌株接种于50mL PS 的250mL三角瓶种，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养7-10 天，即得到菌丝孢子混合液；将此混合液经四层纱布过滤后所得滤液，即为薄壁分生孢子液；采用250mL锥形瓶装有50mL马铃薯蔗糖培养基，将培养的孢子接入其中，调节孢子数量为1×106个/瓶，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养15d，每组设3个重复，将培养15d的PS培养液混匀后离心收集上清液，取10mL 上清液加入等体积二氯甲烷充分振摇，于7000r/min下离心15 min，使其分层，再次收集上清液，将其配成2mL 5％甲酸样品粗提液作为待净化液，采用PCX小柱进行净化，优化得到以含5％甲酸为最佳上柱环境和5％氨水甲醇溶液为洗脱剂的净化条件，根据液体培养液中毒素的含量筛选出产毒素最高的一株稻绿核菌菌株。
采用上述方法获得的稻绿核菌可以产五种毒素，该稻曲病菌(稻绿核菌) ZZY-2(Ustilaginoidea virens(Cke.)Tak.ZZY-2)已于2016年4月26日送交 湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号 为CCTCC NO：M2016230。
附图说明
图1为5种稻曲病菌所产毒素含量的测定结果。
具体实施方式
本发明一种产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌，保藏号为 CCTCC NO：M2016230，通过如下方法获得：将采集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒钟，然后放于酒精灯上自燃5秒钟，用无菌滤纸吸干表面的水分，将表层的组织在无菌操作状态下清理干净，然后用无菌手术刀将稻曲球切开，夹取中间层，接种到含终浓度为0.05g/L氯霉素的无菌PSA平板培养基上，每皿接种3个点，每一样品设3个重复，接种后的培养皿于28℃恒温培养箱培养，待菌落长出后(3-5d)，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落或者挑取边缘的菌丝移至新鲜配制且已灭菌的PSA平板培养基中，进行反复纯化；将纯化后的菌株接种到新鲜配制的无菌PSA平板上进行活化，活化后的菌株接种于50mL PS的250mL三角瓶种，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养7-10天，即得到菌丝孢子混合液；将此混合液经四层纱布过滤后所得滤液，即为薄壁分生孢子液；采用250mL锥形瓶装有50mL马铃薯蔗糖培养基，将培养的孢子接入其中，调节孢子数量为1×106个/瓶，置于150r/min、 28℃恒温摇床中培养15d，每组设3个重复，将培养15d的PS 培养液混匀后离心收集上清液，取10mL上清液加入等体积二氯甲烷充分振摇，于7000r/min下离心15min，使其分层，再次收集上清液，将其配成2mL 5％甲酸样品粗提液作为待净化液，采用PCX小柱进行净化，优化得到以含5％甲酸为最佳上柱环境和 5％氨水甲醇溶液为洗脱剂的净化条件，根据液体培养液中毒素的含量筛选出产毒素最高的一株稻绿核菌菌株。
菌株鉴定：
从PSA分离平板上挑取纯化后的菌株接种于PS液体培养基中，于150r/min、28℃条件中培养7d后，用离心管收集菌丝后，采用报道的CTAB法提取菌丝总DNA，利用真菌18S引物(ITS1： 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；NS8ITS4：5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增，PCR扩增的体系为：10×Taq缓冲液5μl、10pmol的ITS1引物和ITS4引物各1μl、真菌DNA提取液2μl、1UTaq DNA聚合酶1μl、2.5mM MgCl2 2μl、2mmol/L dNTPs 3μl，无菌水补足至50μl；扩增条件为：95℃变性3min，95℃ 1min，59℃ 1min，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用PCR回收试剂盒回收纯化得到目的片段，然后将扩增产物送于生工生物工程股份有限公司进行序列分析，返回的测序结果提交到GenBank数据库，获得相应登录号。将测序结果在NCBI数据库利用Blast软件进行比对分析。根据筛选到的菌株序列与稻曲病菌属菌株序列的同源性判断筛选到的菌株是否为稻曲病菌。结果为：分离到的菌株编号为ZZY-2，GenBank数据库登录号为No. KU306368，同源性比对结果显示，该菌株与稻绿核菌的同源性为 99.9％，结合形态观察结果，确定分离到的菌株为稻曲病菌——稻绿核菌。
毒素鉴定：
5种毒素的检测：取培养15d的大米培养基，按米粉∶水＝1∶5 的比例进行提取毒素，提取净化后的毒素利用TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱仪进行检测。检测结果如图1。
由图1可以看出，大米培养基中水分含量对稻曲病菌产毒效果的影响很大，其中，效果最好的2号培养基，即30g米粉中加入15mL无菌水，5种毒素(A-D，F)均有检出，且不管是单一毒素含量还是5种毒素总含量均远高于其他两种培养基配比，总含量为7301.2ng/g，分离到的菌株经本实验室分离纯化的标样进行上机检测，该菌株在大米培养基上能够产生5种稻曲病菌毒素，且含量很高。
本发明为稻曲病毒素的提取提供了新的不受采摘时间、发病程度限制而且杂质较少的提取源。从稻曲病菌高产毒菌株中同时获得5种毒素纯品且各种毒素及总其含量均较高的情况，目前国内未见报道。
显然，上述实施例仅仅是为了清楚的说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌，保藏号为CCTCC NO：M2016230，通过如下方法获得：
将采集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒钟，然后放于酒精灯上自燃5秒钟，用无菌滤纸吸干表面的水分，将表层的组织在无菌操作状态下清理干净，然后用无菌手术刀将稻曲球切开，夹取中间层，接种到含终浓度为0.05g/L氯霉素的无菌PSA平板培养基上，每皿接种3个点，每一样品设3个重复，接种后的培养皿于28℃恒温培养箱培养，待菌落长出后(3-5d)，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落或者挑取边缘的菌丝移至新鲜配制且已灭菌的PSA平板培养基中，进行反复纯化；将纯化后的菌株接种到新鲜配制的无菌PSA平板上进行活化，活化后的菌株接种于50mL PS的250mL三角瓶种，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养7-10天，即得到菌丝孢子混合液；将此混合液经四层纱布过滤后所得滤液，即为薄壁分生孢子液；采用250mL锥形瓶装有50mL马铃薯蔗糖培养基，将培养的孢子接入其中，调节孢子数量为1×106个/瓶，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养15d，每组设3个重复，将培养15d的PS培养液混匀后离心收集上清液，取10mL上清液加入等体积二氯甲烷充分振摇，于7000r/min下离心15min，使其分层，再次收集上清液，将其配成2mL 5％甲酸样品粗提液作为待净化液，采用PCX小柱进行净化，优化得到以含5％甲酸为最佳上柱环境和5％氨水甲醇溶液为洗脱剂的净化条件，根据液体培养液中毒素的含量筛选出产毒素最高的一株稻曲病菌菌株。
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