CN103484377A - 拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物防治领域的拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途。所述木霉菌菌株为深绿木霉（Trichoderma atroviride）SG3403CGMCC No.6479；同时，本发明还涉及前述木霉菌菌株在制备防治玉米茎腐病和纹枯病农药中的用途。本发明提供的木霉菌菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌抑制率分别达71.91%、74.77%、73.11%，几丁质酶酶活为4.1452U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.5969U，胞外蛋白酶酶活为2.4845U；本发明的菌株能够用于生产高效且快速防治玉米茎腐病和纹枯病的生物农药。

Description

拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途

技术领域

本发明属于生物防治领域，涉及一株木霉菌菌株及其用途，尤其涉及一株拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株及其用途。

背景技术

近年来，随着耕作和栽培制度的改变、品种轮换及高油高淀粉品种大面积种植，玉米的土传病害有逐年加重的趋势，一般年份发病率大约在10-30%，严重年份甚至可以达到60%以上，从而导致玉米产量显著降低。因此，土传病害已成为玉米稳产、高产的主要制约因素之一。而我国玉米的主要土传病害有4种，即茎基腐病、丝黑穗病、纹枯病和全蚀病，其中茎基腐病和纹枯病的危害尤为严重。

玉米茎腐病(Corn Stalk Rot)，又称玉米青枯病，其分布广、危害重，世界玉米各产区均普遍发生，给玉米生产造成很大损失，一般年份发病率为10-20%，严重时可达50%以上，导致玉米减产20-30%。绝大多数研究证明，引起玉米茎腐病的病原菌是一个致病菌的群体，而且不同地区的病原菌不完全相同，或完全不同。目前，从病残体中分离到的致病菌有腐霉菌、镰刀菌、干腐菌、炭疽菌和细菌等。国内近年来有关茎腐病病原菌的种类存在3种不同的观点：腐霉菌是主要的致病菌；镰刀菌是主要致病菌；腐霉菌和镰刀菌复合侵染所致。

玉米纹枯病(Rhizoctonia solani)是世界上玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一，在我国始见于1966年的吉林省，后在四川、贵州、江苏、浙江、河南、河北、安徽、辽宁、黑龙江、吉林、山西、陕西、山东等省及两湖、两广地区的春、夏、秋玉米均有发生。20世纪70年代后，随着玉米种植面积的扩大，杂交种的推广应用，施肥量及种植密度的提高，玉米纹枯病的发生、发展和蔓延日趋严重；特别在我国西南玉米种植地区，由于玉米生长期气温高、湿度大，纹枯病已经成为玉米第一大病害研究发现，目前其纹主要病原菌是立枯丝核菌。

为了有效防治以上玉米病害、保证我国玉米产量稳定增长，必然需要进行玉米病害的综合防治，即从玉米田间生态系统的整体观念出发，以农业防治为基础，协调运用生物防治和化学防治等各项措施，将病害的发生为害控制在经济允许损失水平以下，实现经济、生态和社会的三大效益。其中，生物防治广受政府、农庄及农户关注，生防微生物资源研究中高效拮抗菌株成为重中之重。而木霉菌，作为国际公认的生防菌，寻找具高效生防能力的木霉菌株迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是通过对峙培养测定、拮抗相关酶活测定、盆栽接种试验及抗生性次生代谢物提取分析的方法，提供一种高拮抗性、强专化性的拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株，该菌株能够用于生产高效且快速防治玉米茎腐病和纹枯病的生物农药。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株为深绿木霉（Trichoderma atroviride）SG3403CGMCC No.6479。

优选地，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明还涉及前述木霉菌菌株在制备防治玉米茎腐病和纹枯病农药中的用途。

本发明提供的木霉菌菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101；本发明菌株的信息为：深绿木霉（Trichoderma atroviride）SG3403；保藏号为CGMCC No.6479；保藏日期为2012.8.28。

菌株培养特征包括：在PDA和SNA上的最适合生长温度为25-30℃，25℃PDA培养3d，菌落半径为42.8-60.5mm；25℃SNA培养3d，菌落半径为22.2-35.5mm。在PDA上30℃培养96h，菌落边界清晰，中央有一菌丝相对致密的圆盘状结构，是分生孢子的主要产生区域；一般没有分生孢子堆，有椰子气味（甜味）。

菌株形态特征包括：分生孢子梗的可育延伸物没有或者很少产生，没有不育的菌毛；虽然成对着生的分枝比较常见，但分生孢子梗的典型分枝方式为单侧分枝，分枝角度为近似90°。瓶梗长度为4.2～15.0μm，长宽比值为1.1～6.3，直或者弯曲，有时候为钩状；2～4个呈漩涡状排列，常为单生；漩涡状排列中的最顶端瓶梗及单生瓶梗一般为圆柱形，只在尖端下部缢缩，形成细颈样形状；尖端下面着生的瓶梗为烧瓶形，中部膨大，至顶缢缩，基部稍微缢缩；瓶梗的支持细胞宽度与瓶梗基部相似。没有间生瓶梗。分生孢子绿色，亚球形至卵圆形，没有明显的脱落痕迹，光滑，3.0～5.0μm×2.3～4.0μm，长宽比值为0.8～1.6，干燥。

本发明采集华东地区农田土壤，并于4℃保藏，再分离纯化菌株，然后依次进行离体对峙病原菌抑制试验（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）、检测拮抗相关酶酶活（几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶）和活体接菌防效试验，经过以上步骤反复筛选，最终选出高拮抗性、强专化性的杀玉米茎腐病和纹枯病病害的木霉菌菌株，编号为SG3403。为了该菌株更好地开发利用，进行了抗生性次生代谢物质分析，明确了在拮抗中起作用的物质的比例。通过菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析，其ITS序列如序列表中的序列1所示，从而确定了该菌株的分类地位：木霉属（Trichoderma Pers.ex Fr.），深绿木霉（Trichoderma atroviride）。

本发明提供的木霉菌菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）抑制率分别达71.91%、74.77%、73.11%，几丁质酶酶活为4.1452U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.5969U，胞外蛋白酶酶活为2.4845U。该菌株能够用于生产高效且快速防治玉米茎腐病和纹枯病的生物农药。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明SG3403菌株中不同类型的抗生性次生代谢物分配比例结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明通过采集山东省寿光市芹菜蔬菜地土壤，并于4℃保藏土壤，再分离纯化野生菌株1026株木霉菌，然后依次进行离体对峙病原菌抑制试验（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）、检测拮抗相关酶酶活（几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶）、活体接菌防效试验和抗生性次生代谢物提取分析，经过以上步骤反复筛选，最终选出高拮抗性、强专化性的杀玉米茎腐病和纹枯病病害的木霉菌菌株，编号为木霉菌SG3403。并通过菌株的菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析确定该菌株的分类地位。

实施例1为离体对峙抑菌试验，实施例2～4为拮抗相关酶的酶活检测试验，实施例5为活体接菌防效试验，实施例6～7为抗生性次生代谢物提取分析试验。

实施例1、离体对峙抑菌试验

制备PDA平板，用打孔器自培养3d的供试木霉菌和3株病原菌（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）菌落边缘分别打取直径5mm的菌块，分别移植在平板相对的两侧中央，相距约5cm，28℃恒温倒置培养，重复3次，以仅接种病原菌的平板作为对照。接种144h后分别测量三株病原菌的直线生长距离和S_ck，按如下公式计算抑制率：抑制率(%)=（S_ck-S_t）/S_ck×100%，其中S_ck表示对照组接种病原菌株144h后的直线生长距离；S_t表示对峙培养组接种病原菌株144h后的直线生长距离。

表1菌株离体抑菌率的测定结果

由表1可以看出，SG3403对三株病原菌（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）的抑制作用较好，分别为71.91%、74.77%、73.11%。

实施例2、几丁质酶酶活力检测

将木霉菌株接种到PDA培养基平板（直径90mm）上，在光照恒温恒湿培养箱25℃、60%湿度培养5d。把长满木霉的平板用灭菌水浸泡3-5min，用棉签轻轻刮洗下孢子及菌丝体，脱脂棉或4层纱布过滤除去菌丝体，滤液即为孢子悬浮液。根据血球记数板法进行计数，稀释后孢子悬浮液浓度为10⁶个·mL^-1孢子量。

配制N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）（色谱纯，Sigma Chemical Co.P.O.，Germany）的1mg·mL^-1的标准溶液，取6支25×250mm试管，按表2加入试剂，将各管混匀，在沸水中准确煮5min，取出后立即冷却至室温，再向各试管加入21.5mL蒸馏水，摇均。稀释后各管NAG的浓度依次为0、8、12、16、20、24、28（μg/mL）。先对7管样品通过紫外分光光度计在200-700nm范围进行全波扫描，得到其最大吸收值的波长。再对上述7支管在最大光吸收（OD）值的波长下按NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度（μg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线。

表2建立NAG标准曲线的试剂

	0(CK)	1	2	3	4	5
							NAG标准液（mg/mL）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
相当于NAG量（mg）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							蒸馏水（mL）	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
DNS试剂（mL）	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

每瓶产几丁质酶发酵液(培养基组分：NH₄NO₃3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgS0₄·7H₂00.6g/L，FeS0₄·7H₂00.1g/L，胶体几丁质5g/L粉状，pH5～6，1000mL蒸馏水)接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r·min^-1、28℃培养。采取DNS比色法测几丁质酶活：取0.5mL发酵液，加入0.05M pH6.0磷酸盐缓冲液2mL，再加入0.5mL胶体几丁质，每样品三个重复，一个对照，反应在25×250mm试管里进行；然后立即在恒温水浴锅（37℃下准确保温水浴1h，再迅速在4℃下11000g离心10min，取上清液2mL，加入DNS试剂1.5mL，沸水浴准确煮沸10min，取出后立即冷却至室温。对照为0.5mL发酵液，加0.05M pH6.0磷酸盐缓冲液2mL，混合液在沸水浴中煮10min，取出后用冷水冷却至室温，再加入0.5mL胶体几丁质，然后11000r·min^-1离心10min，其它操作同上。

上述反应液混匀，取1mL反应混合液分别于第3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定，通过紫外分光光度计在530nm处测定光吸收（OD）值，把测得的OD值与NAG标准曲线对照，定量几丁质酶的活性。

几丁质酶酶活：一个几丁质酶酶活单位(1U)定义为在特定条件下（37℃、pH6.0），每分钟酶催化胶体几丁质反应释放1μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

表3菌株SG3403不同培养天数的几丁质酶酶活

天数（d）	3	4	5	6	7	8	9	10
									酶活（U）	1.0597	2.6104	4.1452	3.6994	2.9862	2.6041	2.1710	1.2922

由表3可以看出，随着培养天数的增加，SG3403几丁质酶酶活力呈先上升再下降的趋势；几丁质酶活力在第5d时最高，为4.1452U。

实施例3、β-1,3-葡聚糖酶酶活力检测

葡萄糖标准曲线的制作，参照杨艳红的方法（杨艳红．华山松疱锈病原菌重寄生菌的筛选及其作用机理初步研究．昆明：西南林学院，2004），按表4加入试剂，取1mg/mL标准葡萄糖溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL，再各加蒸馏水补足至2mL，然后分别加入0.75mL DNS溶液充分混匀，于沸水浴中准确反应15min后，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，再加5mL蒸馏水充分混匀。于722型分光光度计540nm处测定光吸收值，以标准葡萄糖溶液的浓度为横坐标，以对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

表4建立葡萄糖标准曲线的试剂

	0(CK)	1	2	3	4	5
							葡萄糖标准液	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
相当于葡萄糖量（mg）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							蒸馏水（mL）	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
DNS试剂（mL）	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75

每瓶TLE产酶诱导培养液（成分：1g细菌用蛋白胨，0.3g尿素，2g KH₂PO₄，1.4g(NH₄)₂SO₄，0.3g MgSO₄.7H₂O，0.3g葡萄糖，0.005g FeSO₄，0.0017g MnSO₄，0.0014g ZnSO₄，0.002g CaCl₂，1000mL蒸馏水）接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r/min28℃培养。培养3d后的发酵液样液2mL纱布过滤，4℃5000r/min下离心20min，上清液即为粗酶液。参照Bara的方法并稍加改动测酶活，吸取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg/mL的昆布多糖溶液1mL，50mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）0.5mL，混匀．于40℃下准确反应1h后，立即加入0.75mL DNS溶液以终止反应，混匀，再于沸水浴中准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃下放置2min，再加入5mL蒸馏水充分混匀。

上述反应液混匀，取1mL反应混合液分别于第3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定β-1,3-葡聚糖酶酶活，通过紫外分光光度计在540nm处测定光吸收（OD）值，所测得OD值与标准曲线对照，定量β-1,3-葡聚糖酶的活性，根据标准曲线求出样品中葡萄糖含量，每个处理三次重复。

β-1,3-葡聚糖酶酶活：一个β-1,3-葡聚糖酶酶活单位（1U）定义为，在特定40℃、pH5.0条件下，1h催化分解昆布多糖产生lμg葡萄糖的酶量。

表5菌株不同培养天数的β-1,3-葡聚糖酶酶活

天数（d）	3	4	5	6	7	8	9	10
									酶活（U）	0.5421	0.5969	0.4544	0.1887	0.1285	0.0244	0.0162	0.0025

由表5可以看出，随着培养天数的增加，SG3403β-1,3-葡聚糖酶酶活力呈先上升再下降的趋势；β-1,3-葡聚糖酶酶活力在第4d时最高，为0.5969U。

实施例4、胞外蛋白酶酶活力检测

牛血清白蛋白（BSA）标准曲线的制作：按表6加入试剂，取0.1mg·mL^-1标准牛血清溶液0，20，40，60，80，100μL，再各加入蒸馏水补足至200μL，然后分别加入0.02mL SK5031-1溶液A和0.98mL SK5031-2溶液B充分混匀，于室温下静置准确反应10min后，立即加入100μL Folin-酚试剂迅速混匀，室温下静置30min，于紫外分光光度计750nm处测定光吸收值，以标准牛血清白蛋白溶液的浓度为横坐标，以对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

表6建立BSA标准曲线的试剂

	0(CK)	1	2	3	4	5
							BSA标准溶液（μL）A	0	20	40	60	80	100
蒸馏水（μL）	200	180	160	140	120	100

BSA终浓度（mg/μL）

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

每瓶MYG产酶诱导培养液（成分：10.0g葡萄糖，5.0g麦芽糖，5.0g酵母膏，1000mL蒸馏水）接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r·min^-1、28℃培养。发酵液每天取样，样液2mL经离心（10000r·min^-1，4℃，20min）后，取上清液于-20℃保存备用。

采用Lovrien的方法（Lovrien RE，Gusek T，Hart B.Cellulase and proteasespecific activities of commercially available cellulase preparations.J ApplBiochem，1985，7：258-272）进行蛋白酶酶活测定。取各样品蛋白酶溶液200μL，分别加入0.02mL SK5031-1溶液A(该溶液为本领域的常规选择，源于型号为SK5031的Folin-Phenol Reagent福林酚蛋白浓度测定试剂，购自生工生物工程（上海）有限公司，SK5031-2溶液B、Folin-酚试剂与之来源相同)和0.98mL SK5031-2溶液B充分混匀，于室温下静置准确反应10min后，立即加入100μL Folin-酚试剂迅速混匀，室温下静置30min,取1mL反应混合液于紫外分光光度计750nm处测定光吸收值，分别于第1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d测定胞外蛋白酶酶活。每个处理三次重复测定。

胞外蛋白酶酶活力：以每分钟催化分解蛋白质生成1g牛血清白蛋白的酶量为一个酶活性单位（Pu）。

表7菌株不同培养天数的胞外蛋白酶酶活

天数（d）	1	2	3	4	5	6	7	8
									酶活（U）	1.4128	2.4845	2.0802	1.3701	0.8410	1.1169	1.2923	1.0271

由表7可以看出，随着培养天数的增加，SG3403胞外蛋白酶酶活力呈先上升再下降的趋势；蛋白酶酶活力在第2d时最高，为2.4845U。

实施例5、温室活体防治试验

玉米种子放在50～55℃的热水中温汤浸种10min，以促进种子萌发并起到表面消毒的作用。将温汤浸种后的种子放在10⁷个/mL木霉菌孢子液中进行包衣，晾干后放在培养皿中，置于28℃培养箱中培养3d。待出芽后取出，放在常温条件下继续培养，并向培养液中加入镰孢菌10⁵/mL的孢子液，10d开始观察玉米生长及根部腐烂褐变情况，根据腐烂褐变根占总根数的比例计算防效。

表8菌株SG3403处理对玉米生长及防病的影响

处理	主根数（个）	腐烂褐变根比例（%）	接种部位腐烂直径（cm）	茎长（cm）
					SG3403	10.00±0.57	20.80±0.64	0.30±0.20	38.00±1.50
CK	6.00±0.60	83.33±5.28	1.50±0.22	23.00±1.60

SG3403对玉米生长具有很好的促进作用，株高及根系发达程度均较显著。对于玉米根腐病防效测定结果表明，SG3403处理腐烂褐变根比例为20.80±0.64%，显著降低了腐烂褐变，防效非常显著。

实施例6、木霉菌分生孢子中抗生物质的提取

用50倍体积的CH₂Cl₂于4℃低温浸提6g干燥的分生孢子2d，浸提液经5％活性炭振荡吸附2h，用已灭菌的四层纱布过滤除杂，上清液加入等体积的3％碳酸钠溶液萃取，重复一次，将碳酸钠溶液合并后留取CH₂Cl₂部分，用少许CH₂Cl₂洗涤回收后并人洗涤液，洗涤液加无水硫酸钠脱水，再用快速滤纸进行过滤，最后将脱水洗涤液于40℃下真空减压浓缩后得到1mL的粘稠状含抗生物质的粗提物。

实施例7、提取物化学成分GS-MS分析

采用气相色谱-质谱联用仪对提取物成分进行分析，仪器型号为Agilent6890-5973NGC—MS，参数设置为：离子源为EI，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为280℃，质量扫描范围为290amu-500amu，起始柱温50℃，恒温5min后以5℃/min升温到300℃，汽化室温度为300℃，载气为氦气，分流比为10:1，进样量为1μL。

采用气相色谱-质谱联用仪进行定性分析，结合计算机检索技术对化学成分进行分离鉴定，应用气相色谱峰面积归一化法测定各成分的相对含量。

表9菌株抗生性次生代谢物分析结果

由表9可知，木霉菌菌株SG3403抗生性次生代谢物物质较多，共检测分析到44馏分，抗生性次生代谢物类型分类汇总如图1所示，其中羧酸及其衍生物比重最大，其次是烷烃类、萜烯类物质较多，醇类、醛类最少。总体来看，菌株SG3403中起主要拮抗作用的抗生性次生代谢物是萜烯类和羧酸及其衍生物类。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (3)

1.一种拮抗玉米茎腐病和纹枯病的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株为深绿木霉（Trichoderma atroviride）SG3403CGMCC No.6479。

2.根据权利要求1所述的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求1所述的木霉菌菌株在制备防治玉米茎腐病和纹枯病农药中的用途。