CN102277302A - 木霉菌-油菜联合吸附农田土壤重金属镉和锌的构建方法 - Google Patents

Abstract

一种金属吸附技术领域的拮抗木霉菌-甘蓝型油菜联合吸附农田土壤重金属镉和锌的构建方法，通过将吸附重属拮抗木霉菌株制备的菌剂接种至含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤上，进一步用于栽培甘蓝型油菜并得到木霉菌-油菜高效吸附重金属共生体。本发明实现对农田土壤重金属污染的生物修复、兼治土传病害的双重目的，其修复效果好、费用低、易于管理与操作、不产生二次污染，因此具有很高的田间普遍使用价值。

Description

木霉菌-油菜联合吸附农田土壤重金属镉和锌的构建方法

技术领域

本发明涉及的是一种金属吸附技术领域的方法，具体是一种拮抗木霉菌-甘蓝型油菜联合吸附农田土壤重金属镉和锌的构建方法。 

背景技术

农田土壤重金属超标污染是农产品安全生产的源头障碍，对人体或动物的健康危害很大。20世纪90年代初通过对占上海郊区蔬菜种植面积达50.5％的农田土壤重金属污染物调查，分析了近20年来上海蔬菜农田土壤中重金属污染物的累积状况及其累积原因。结果表明，Cd、Hg和Zn是上海蔬菜农田土壤中主要的重金属累积污染物。为了降低重金属引起的土壤污染，科学家们提出了物理的、化学的方法，如客土换土法、冲洗法、热处理、固化、玻璃化、电动修复法等，由于其技术要求高或经济成本高昂，需要特殊的仪器和专门的技术人员；而且还会破坏土壤微生物区系，造成“二次污染”。近年来生物修复(phytoremediation)已成为经济有效、不会造成二次污染的新的环境修复技术。生物修复主要包植物修复和微生物修复。植物修复是通过某些植物超量积累某种或某些化学元素的特点实现的。微生物修复是通过某种微生物细胞具有富集环境中重金属的特点，减少重金属对环境的污染。目前国际上一个重要发展趋势是将具有高或超富集作用的植物和微生物相结合进而提高修复环境的效率。 

油菜(Oilseed rape)是中国主要农作物之一，在我国大部分地区广泛种植，具有吸附，耐受重金属的潜力。经过对现有技术的检索发现，苏德纯和黄焕忠(2002)从1999年至2000年期间，曾经从安徽、湖北等地挑选了30多个芥菜型油菜品种分别在中国农业大学植物营养系和香港浸会大学生物系做耐镉毒和吸收镉潜力的水培和土培试验，筛选出了两份具有积累吸收镉特征，同时具有较高生物量的芥菜型油菜(苏德纯，黄焕忠，2002.油菜作为超积累植物修复镉污染土壤的潜力.中国环境科学22，34-38)，但芥菜型油菜主要适合于云贵高原区和蒙新内陆区种植，主要分布在新疆、云南，仅占全国油菜种植面积的10％，而甘蓝型油菜在我国南北方均有种植，占油菜总种植面积的90％，因此筛选适合我国南、北方广泛种植的高吸附重金属的甘蓝型油菜对于大面积推广该类土壤修复技术具有重要价值。目前基于吸附土壤重金属为目标的甘蓝型油菜筛选工作还没有相关报道。木霉菌已经证明具有吸附金属的功能(Anand et al.，2006)。 

经过对现有技术的检索发现，通过木霉菌促进芥菜型油菜吸附重金属仅有个别报导，Lixiang Cao等(2008)研究表明：与对照相比，Trichoderma atrovirde F6孢子悬液处理芥菜型油菜(Brassica juncea)种子后，提高幼苗茎富集Ni达24-30％，对Cd的富集也有一定程度提高，根对Cd和Ni的富集提高8％和7％(Lixiang Cao，Min Jiang，Zhirui Zeng，Aixue Du，Hongming Tan，Yuhuan Liu，Trichoderma atroviride F6 improves phytoextraction efficiency of mustard(Brassicajuncea(L.)Coss.var.foliosa Bailey)in Cd，Ni contaminated soils Chemosphere 2008，71：1769-1773)，但该技术仅适用于芥菜型油菜，而且没有表明该菌株具有防治油菜土传病害和后茬作物土传病害的功能。因此发展基于拮抗木霉菌辅助甘蓝型油菜吸附土壤超标重金属的技术非常必要，应用前景广阔。本技术创新点在于利用对土传病害有拮抗作用的木霉菌与我国普遍种植的甘蓝型油菜组配吸附重金属的共生体，进而提高油菜吸附重金属的效率，同时又能有效控制油菜菌核病和后茬作物土传病害的发生《王晶 董金皋 陈捷 深绿木霉REMI突变菌株H6对黄瓜枯萎病的生物防治，2008河北农业大学硕士学位论文》(中国学位论文全文数据库，万方数据检索系统)，实现对农田土壤重金属污染生物修复与控制土传病害的双重目的。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种木霉菌-油菜联合吸附农田土壤重金属镉和锌的构建方法，实现对农田土壤重金属污染的生物修复、兼治土传病害的双重目的。本发明方法修复效果好、费用低、易于管理与操作、不产生二次污染，因此具有很高的田间普遍使用价值。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种吸附重属拮抗木霉菌株，包括：哈茨木霉(Trichoderma harzianum H6)和康氏木霉(Trichoderma koningii P6)，其特征在于，保藏号分别为：CGMCC No.4869，CGMCCNo.4870；保藏日期为：2011年5月18日；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心。 

本发明涉及一种木霉菌-油菜高效吸附重金属共生体的制备方法，通过将上述吸附重属拮抗木霉菌株制备的菌剂接种至含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤上，进一步用于栽培甘蓝型油菜并得到木霉菌-油菜高效吸附重金属共生体。 

所述的吸附重属拮抗木霉菌株通过将木霉菌孢子在含Zn²⁺或Cd²⁺的PD培养基中培养并筛选出去除靶标重金属效率达到40％以上的木霉菌株，然后再与菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和枯萎病镰孢菌(Fusarium oxysporium)对峙培养，最后筛选抑菌率达60％以上的菌株得到。 

所述的木霉菌孢子是指：将木霉菌在PDA培养基上26-27℃培养一周，用无菌水洗下PDA平板上的分生孢子，制备10⁷孢子/mL。 

所述的含Zn²⁺或Cd²⁺的PD培养基是指：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL且Zn²⁺或Cd²⁺的浓度为100mg/L。 

所述的培养并筛选是指：将0.5mL木霉菌孢子的悬液接种于50mL含Zn²⁺或Cd²⁺的PD培养基中，在28℃130rpm振荡培养3d，然后取5mL培养液10000rpm离心10min，取0.5mL上清液，加入显色剂，无离子水定溶至10mL；最后采用分光光度计法，在549nm处测定溶液中Zn²⁺或Cd²⁺变化的OD值，筛选得到去除靶标重金属效率达到40％以上的吸附菌株。 

所述的去除靶标重金属效率是指： 

所述的含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤通过以下方式得到：通过将含浓度为1M的ZnSO₄·7H₂O或CdSO₄·8H₂O溶液与经8mm筛的细土反复混匀，制备含重金属盐100mg·kg^-1，用无离子水最终将土壤湿度调至20％wt，在室温下保持1周；然后与油菜菌核病菌麦粒培养物以病菌培养物接种量为1％W/W的比例混合，用无菌水将土壤湿度调至相对湿度60％。 

所述的接种是指将吸附重金属的拮抗木霉菌剂按2-3％(W/W)与含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤混合。 

本发明涉及一种吸附重金属的拮抗木霉菌剂的制备方法，通过将木霉菌发酵液1000mL与硅藻土600g、精麸300g、稻草粉100g混合，在25-27℃下发酵5-7d。 

所述的木霉菌发酵液是将木霉菌PDA培养物用无菌水洗下的孢子悬液(10⁷孢子/mL)，加入到下列培养基(马铃薯200g，萄糖20g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄ 0.0025g，ZnSO₄0.002g，KH₂PO₄3.83g，NaNO₃1.42g，(NH₄)₂SO₄1.1g，CaCl₂1.0g，水1000mL)，25-27℃下发酵5-7d后制备的。 

本发明通过上述吸附重属拮抗木霉菌株可以实现吸附农田土壤重金属镉和锌。 

本发明用于可筛选高效吸附重金属的甘蓝型油菜品种、多功能木霉菌株及拮抗木霉菌与甘蓝型油菜联合吸附重金属的最佳组合。 

本发明克服了芥菜型油菜种植面积小，吸附重金属效率低的缺点，提供了将拮抗木霉菌与甘蓝型油菜形成共生体(symbiont)，促进油菜生长、提高吸附重金属效率的新方法。该方法修复效果好、可兼治土传病害、易于操作、不产生二次污染。 

本发明还可用于修复土壤中其它农化物质的污染，并能防治修复植物种植过程中的土传病害和其它后茬作物的土传病害。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

步骤一，将不同品种的油菜种子置入铺有湿润滤纸的培养皿中，每皿50粒，于28℃下黑暗条件下催芽2-3d。供试土壤(过8目筛)分别与ZnSO4·7H2O和CdSO4·8H2O溶液混合均匀，配制成四种处理：ZnS04·7H2O为500、1000mg·kg^-1，CdSO4·8H2O为50、100mg·kg^-1。重金属处理的土壤在室温下稳定1周。然后将木霉菌剂(木霉发酵液1000mL，硅藻土：500-600g，精麸：250-300g，稻草粉：80-100g，共发酵5-7d)。木霉菌粉剂与处理的土壤按1∶20(w/w)混匀，播种，在人工气候室培养。每盆装土400g，每个处理3次重复。待油菜出苗后20d，每盆留苗6株，生长过程中用自来水浇灌，油菜生长50d后，取样进行分析。 

步骤二，取地上部(茎和叶片)组织，用去离子水清洗后在105℃杀青0.5h，然后在80℃下烘干至恒重。烘干样品用HNO₃-HC1O₄消化，ICP-AES(美国Varian 710ES)测定法测定Zn²⁺、Cd²⁺含量。计算各处理的地上部干重，相对生物量和土壤净化率。相对生物量是指植株在500mg·kg^-1、1000mg·kg^-1含锌土壤，50mg·kg^-1、100mg·kg^-1含镉土壤地上部干物重占未用重金属处理土壤油菜地上部干重的百分比。数据用SAS软件进行统计检验，5％水平下检验各处理平均值之间的差异显著性。 

实施例一结果 

利用地上部相对生物量和净化率两个指标筛选对Zn²⁺或Cd²⁺富集能力明显的油菜品种。数据显示在两种Zn²⁺处理浓度条件下，油菜地上部吸收Zn²⁺能力最强的品种为沪油20。沪油20在Zn²⁺含量为500mg·kg^-1和1000mg·kg^-1下的土壤净化率分别为1.32％和0.85％。在两种Cd²⁺处理浓度条件下，油菜地上部吸收Cd能力最强的品种为沪油20。沪油20在Cd²⁺含量为50mg·kg^-1和100mg·kg^-1下的土壤净化率分别为1.02％和0.62％。通过对比不同油菜品种对Zn²⁺和Cd²⁺污染土壤的净化率可得，沪油20对Zn²⁺、Cd²⁺污染土壤净化率最好(表1、表2)。 

表1不同土壤锌含量下油菜的相对生物量和重金属净化率 

表2不同土壤镉含量下油菜的相对生物量和重金属净化率 

实施例二 

步骤一，木霉菌接种在PDA平板上，生长2d后，用直径0.5cm打孔器在菌落边缘，打菌片接在15mL PDA，含Cd²⁺1600mg/L平板，每个处理三个重复。5d后十字交叉法测量菌落直径。 

步骤二，木霉菌硅胶粒接种在PDA平板上，待产孢后，无菌水洗孢子，血球计数板计数，使孢子最终浓度达10⁷个/mL。 

取无菌水洗孢子，最终浓度达10⁷个/mL，取0.5mL孢子悬液接种于50mL PD的100mL三角瓶中。Cd²⁺最终浓度为100mg/L，28℃130rpm振荡培养3d。取1mL培养液10000rpm离心10min，取30μl上清液测定Cd²⁺浓度 

Cd浓度测定参照Paradkar et al(1994)，Khan et al(2005)方法。取0.5mL的10g/mLCd²⁺，加入到15cm的试管中，再加入2mL 3M NaOH，混匀，加入4mL显色剂。振荡混匀。Milli-Q水补至10mL。反应10min后，在紫外可见分光光度计上以400-700nm波段进行波长扫描，测量最大吸收峰波长。 

实施例二结果 

在PDA平板，以1600mg/L Cd²⁺筛选了木霉菌株150株。以100mg/L Cd²⁺PD培养在PDA上生长良好的菌株，测定Cd²⁺吸附能力。结果表明：P6、H6对Cd²⁺具有较高的耐受性和去除率(表3)。 

表3拮抗木霉菌Cd²⁺去除率 

实施例三 

步骤一，将不同品种的油菜种子置入铺有湿润滤纸的培养皿中，每皿50粒，于28℃下黑暗条件下催芽2-3d。供试土壤(过8目筛)与CdSO₄·8H₂O溶液混合均匀，配制成两种处理为50、100mg·kg^-1。重金属处理土壤播种前在室温下稳定1周。每盆装土400g，每个处理3次重复。将玉米砂培养基上培养7d的木霉菌与处理土壤按1∶20(w/w)混匀，播种油菜种子，在人工气候室培养，待油菜出苗后，每盆留苗6株，生长过程中用自来水浇灌，油菜出苗后20d取样进行生长性状和吸收Cd²⁺量的分析。 

步骤二，取地上部(茎和叶片)组织，用去离子水清洗后在105℃杀青0.5h。然后在80℃下烘干至恒重。烘干样品用HNO₃-HClO₄消化，ICP-AES(美国Varian 710ES)测定法测定Cd²⁺含量。计算各处理的地上部干重，相对生物量和土壤净化率。相对生物量是指在0mg·kg^-1、50mg·kg^-1、100mg·kg^-1含镉土壤条件下，用木霉处理的植株干重分别占未用木霉处理土壤油菜干重的百分比。数据用DPS软件进行LSD统计检验，5％水平下检验各处理平均值之间的差异显著性。 

实施例三结果 

在未用Cd²⁺处理的土壤中T23、H6、P6均表现出促进油菜生长的作用，其中T23、P6促进生长最为明显，沪油20干重由1.34g分别增加到1.59g和1.49g，分别增加了18.66％和11.19％。当土壤中Cd²⁺含量为100mg·kg^-1时，P6和H6均表现出对油菜生长的促进作用。由于T23和P6、H6对油菜的生物量有明显的促进作用，油菜对Cd²⁺的吸收和净化率也明显增加。当土壤Cd²⁺含量为50mg·kg^-1时，油菜生物量为100，Cd²⁺的净化率为0.458，而利用H6时油菜生物量增加至115.36，Cd²⁺的净化率同步增加到0.656。P6在Cd²⁺含量100mg·kg^-1时也有类似的规律(表4)。 

表4不同木霉及其突变体处理下沪油20相对生物量、吸镉量和净化率 

实施例四 

步骤一，试验地1为亩，10月中、下旬播种。设两个处理(施菌剂、不施菌剂)，每处理三次重复。按每亩拮抗木霉菌剂15kg均匀施入播种穴内、与土壤混合，将沪油20种子散播在沟内。每亩用种量400-500g，每穴5-10粒，每亩1.5-2万株。 

步聚二，幼苗生长至6-8叶期，取幼苗根际周围2公分范围内的土壤样品，装入塑料袋、密封，带回实验室，测定重金属(Cu、Zn、Cd)含量的变化。同时每小区调查50株幼苗，统计菌核病发病株率，计算防效。 

实施例四结果 

原子吸收测定结果表明：与对照土壤相比，经菌剂处理的土壤Cu含量平均下降12.4％，锌含量平均下降10.0％，Cd平均下降11.0％。对油菜菌核病的防效达44-68％。 

表5高效吸附重金属的拮抗木霉菌对油菜菌核病防治效果 

Claims (11)

1.一种吸附重属拮抗木霉菌株，包括：哈茨木霉(Trichoderma harzianum H6)和康氏木霉(Trichoderma koningii P6)，其特征在于，保藏号分别为：CGMCC No.4869，CGMCC No.4870；保藏日期为：2011年5月18日；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.一种木霉菌-油菜高效吸附重金属共生体的制备方法，其特征在于，通过将权利要求1所述的吸附重属拮抗木霉菌株制备的菌剂接种至含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤上，进一步用于栽培甘蓝型油菜并得到木霉菌-油菜高效吸附重金属共生体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述的吸附重属拮抗木霉菌株通过将木霉菌孢子在含Zn²⁺或Cd²⁺的PD培养基中培养并筛选出去除靶标重金属效率达到40％以上的木霉菌株，然后再与菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和枯萎病镰孢菌(Fusarium oxysporium)对峙培养，最后筛选抑菌率达60％以上的菌株得到。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述的木霉菌孢子是指：将木霉菌在PDA培养基上26-27℃培养一周，用无菌水洗下PDA平板上的分生孢子，制备10⁷孢子/mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述的含Zn²⁺或Cd²⁺的PD培养基是指：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL且Zn²⁺或Cd²⁺的浓度为100mg/L。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述的培养并筛选是指：将0.5mL木霉菌孢子的悬液接种于50mL含Zn²⁺或Cd²⁺的PD培养基中，在28℃130rpm振荡培养3d，然后取5mL培养液10000rpm离心10min，取0.5mL上清液，加入显色剂，无离子水定溶至10mL；最后采用分光光度计法，在549nm处测定溶液中Zn²⁺或Cd²⁺变化的OD值，筛选得到去除靶标重金属效率达到40％以上的吸附菌株。

7.根据权利要求3或6所述的制备方法，其特征是，所述的去除靶标重金属效率是指：

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤通过以下方式得到：通过将含浓度为1M的ZnS O₄·7H₂O或CdSO₄·8H₂O溶液与经8mm筛的细土反复混匀，制备含重金属盐100mg·kg^-1，用无离子水最终将土壤湿度调至20％wt，在室温下保持1周；然后与油菜菌核病菌麦粒培养物以病菌培养物接种量为1％W/W的比例混合，用无菌水将土壤湿度调至相对湿度60％。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述的接种是指将吸附重金属的拮抗木霉菌剂按2-3％(W/W)与含有Cd或Zn和油菜菌核病菌麦粒培养物的土壤混合。

10.一种吸附重金属的拮抗木霉菌剂的制备方法，其特征在于，将木霉菌发酵液1000mL与硅藻土600g、精麸300g、稻草粉100g混合，在25-27℃下发酵5-7d。

11.一种吸附农田土壤重金属镉和锌的方法，其特征在于，通过上述任一权利要求所述的吸附重属拮抗木霉菌株实现。