CN115948254B - 一种绿木霉192-45及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绿木霉192‑45及其应用，绿木霉192‑45如[1]尹月兰,牛启尘,甘露.绿木霉对币斑病菌的生长抑制作用及对镉的耐受性(英文)[J].草地学报,2022,30(10):2802‑2810.中公开的菌株所示。本发明提供的菌株有着显著的促进植物生长发育、作为植物重金属胁迫耐受剂等效果，是一种综合治理复杂多变的环境问题的优良选择。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及到一种绿木霉192-45及其应用。
背景技术
随着时代的发展，社会的进步，人民生活不断富足的同时生态环境却受到严重挑战。化学农药的长期大量使用引起农药的残留；化学肥料的大量使用使得水体富营养化，土壤退化；地下矿藏的开采产生了大量的重金属污染土壤和裸露坡面，这些环境问题正不断暴露并显著影响着人们的正常生活和身体健康。为解决日益突出的复杂多样的环境问题，各国纷纷出台综合性防治政策来提高对复杂多变的环境问题进行整体性规划治理。其中利用生物手段进行治理是最为方便和高效的。利用生物进行环境治理，即利用了生物物种间的相互关系，通过有益生物或其他生物来，具有无污染、无公害、长效性能同时针对多种环境问题等优点，具有广阔的发展前景，是实现生态农业生产，生态环境修复与保护的重要保障。
木霉是环境中普遍存在且往往占主导地位的重要环境真菌，其对于环境健康的维持起着至关重要的最用。除广为人知的能防治病虫害外，木霉还具有提高营养利用效率、促进植物生长、增强植物抗逆性和修复农化、重金属污染环境等功能。因此，利用木霉菌等微生物资源实现对多种复杂环境问题的综合治理是当今世界环境保护实践的必然趋势。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种绿木霉192-45及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种绿木霉192-45，其如[1]尹月兰,牛启尘,甘露.绿木霉对币斑病菌的生长抑制作用及对镉的耐受性(英文)[J].草地学报,2022,30(10):2802-2810.中公开的菌株所示。
本发明的另一个目的是提供一种绿木霉192-45的应用。
为解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：一种绿木霉192-45的应用，其包括：绿木霉192-45和/或其代谢产物、发酵液、菌悬液、菌剂和孢子悬液作为植物病害防治剂。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：绿木霉192-45和/或其代谢产物、发酵液、菌悬液、菌剂和孢子悬液用于对匍匐翦股颖币斑病和草坪草根腐病的抑制。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：绿木霉192-45和/或其代谢产物、发酵液、菌悬液、菌剂和孢子悬液对草坪植物匍匐翦股颖和狗牙根的生长发育具有促进作用。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：绿木霉192-45和/或其代谢产物、发酵液、菌悬液、菌剂和孢子悬液对于重金属镉胁迫具有抑制作用。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：包子悬浮液为成1.0×108cfu/mL的孢子悬浮液。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：悬浮液的使用标准为每盆50mL。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：植物病害包括币斑病、根腐病。
作为本发明所述的一种优选方案，其中：绿木霉生长对于镉的耐受浓度为200mg/L。
本发明有益效果：
本发明的绿木霉192-45具有广谱的拮抗植物病原真菌的作用，可用于草坪病害防治，克服化学农药过多应用带来的一系列问题；同时由于该菌株安全无害，且在一定浓度范围内对匍匐翦股颖、狗牙根等植物的生长发育具有促进作用，因此有望作为菌肥对植物生长发育起到良好的作用；同时作为植物重金属胁迫的耐受剂可有效缓解重金属对植物带来的不良影响，在矿山修复，边坡地被修复工程中有着广阔的应用前景。因此，该绿木霉菌株是综合治理复杂多变的环境问题的优良选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中实施例中使用的绿木霉初期和产孢的平板实物图；
图中，左图为平板培养3d绿木霉192-45的菌落形态，右图为平板培养7d绿木霉192-45的菌落形态；
图2为本发明中使用的绿木霉192-45系统进化树；
图3为本发明实施例中绿木霉192-45与币斑病菌平皿对峙观察实物图；
图中，左图为草坪币斑病菌以及草坪币斑病菌受绿木霉192-45平板抑制图，右图为草坪币斑病菌受绿木霉192-45抑制显微结构图；
图4为本发明实施例绿木霉192-45对匍匐翦股颖币斑病的防治效果图；
图5为本发明实施例中绿木霉192-45对匍匐翦股颖的促生效果图；
图中，左图为蒸馏水ck处理与绿木霉192-45处理后的匍匐翦股颖植株，右图为蒸馏水ck处理与绿木霉192-45处理后的匍匐翦股颖叶片叶绿素含量示意图；
图6为本发明绿木霉192-45对狗牙根的促生效果图；
图中，左图为促生效果实物图，右图为促生实际长度示意图，ck为蒸馏水处理后的狗牙根植株，Tv为绿木霉192-45处理后的狗牙根植株
图7为本发明绿木霉192-45在不同镉浓度中的生长情况示意图；
图8为本发明绿木霉192-45提高狗牙根镉耐受性的效果示意图；
图中，左图为提高狗牙根镉耐受性效果实物图，右图为提高狗牙根镉耐受性效果示意图，Tv+Cd为绿木霉192-45加200mg/L镉胁迫处理的狗牙根植株；Cd为只使用200mg/L镉胁迫处理的狗牙根植株；图中不同字母代表处理组间具有差异显著性；
图9为绿木霉192-45临时菌剂成品图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
从北京市昌平区北京林业大学草坪研究基地的多年生草地早熟禾草坪上采集的10cm深的根系层土样5份，土样混合均匀、编号并装入保鲜袋中，带回实验室进行土壤木霉真菌分离。以病原菌名称为靶标菌，利用平板对峙培养对纯培养菌株进行抑菌活性检测，筛选出具有明显抑菌活性的绿木霉真菌192-45。
进行形态学鉴定：
菌株192-45在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上培养时，菌丝生长很快，起初是白色致密的营养菌丝(附图1)，以后出现呈棉絮状的气生菌丝，并在短时间内形成密实的产孢丛束区。菌落表面有深黄绿色至深蓝绿色的产孢区(附图1)，反面无色。菌丝透明，有隔，壁光滑，分枝繁茂。分生孢子大多球形，少数为短倒卵形，表面具明显的疣状突起。根据菌株的培养特性和形态特征，确定其分类地位为木霉属真菌。
进行分子生物学鉴定：
从绿木霉192-45菌体中提取其基因组DNA，以ITS1和ITS4为引物，PCR扩增菌株的ITS基因序列，扩增产物大小为561bp。对扩增产物进行测序，与NCBI核苷酸数据库中已有的木霉菌ITS基因序列进行比对，192-45与NCBI上绿木霉的亲缘关系最近，同源性达100％。利用MEGA软件进行聚类分析，构建聚类分析图，发现菌株192-45亦与以上亲缘关系最近的绿木霉位于系统发育树的同一分支，聚为一类(图2)。
综上，根据菌株192-45的形态学特征、ITS序列分析结果、系统进化结果，将其鉴定为子囊菌门(Ascomycota)，粪壳纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceae)，木霉属(Trichoderma)，绿木霉(Trichoderma virens)。
本发明提供的如绿木霉192-45菌株如[1]尹月兰,牛启尘,甘露.绿木霉对币斑病菌的生长抑制作用及对镉的耐受性(英文)[J].草地学报,2022,30(10):2802-2810.中公开的菌株所示。分生孢子大多球形，少数为短倒卵形，表面具明显的疣状突起。PCR扩增菌株192-45的ITS基因序列，扩增大小为561bp，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO∶1所示。相关序列已上传NCBI，登录号为MW455002。将ITS基因序列在NCBI上比对后，发现菌株192-45的rDNA-ITS序列为木霉菌范畴。利用MEGA软件对测序结果进行聚类分析，构建聚类分析图，发现菌株192-45亦与绿木霉同属系统发育树的同一分支，聚为一类。根据菌株192-45的菌物学特征、rDNA-ITS序列分析结果，将其鉴定为属子囊菌门(Ascomycota)、粪壳纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科(Hypocreaceae)、木霉属(Trichoderma)的绿木霉真菌(Trichoderma virens)。
实施例2
绿木霉192-45对币斑病菌Clarireedia homoeocarpa的抑制作用
通过平皿对峙实验，对9mm大小绿木霉192-45和病原菌菌塞的相互拮抗能力进行检测，绿木霉192-45菌株对来自于不同草地植物的两种币斑病菌有明显的抑制作用，其中对匍匐翦股颖币斑病菌的抑制率为69.38％，对狗牙根币斑病菌的抑制率为51.46％，抑制率图像见图3a。在对峙培养中，绿木霉192-45菌落与币斑病菌的菌落相向生长一定时间后，挑取币斑病菌菌落内部的菌丝进行镜检，币斑病菌发生菌丝变形或消解的现象，实际的情况见图3b所示。
通过玻璃纸培养法和平板对扣共培养法，绿木霉192-45产生的非挥发性和挥发性次生代谢产物对匍匐翦股颖币斑病菌有抑制作用。非挥发性物质的抑制率为89.47，挥发性物质的抑制率为22.41％，实际的抑制作用如表1所示。
表1绿木霉192-45非挥发性和挥发性代谢产物对币斑病菌的抑制作用
绿木霉192-45对茄腐镰刀菌Fusarium solani的抑制作用
通过平皿对峙实验，绿木霉192-45菌株对茄腐镰刀菌有明显的抑制作用，抑制率为68.87％；通过玻璃纸培养法和平板对扣共培养法，绿木霉192-45产生的非挥发性和挥发性次生代谢产物对茄腐镰刀菌的抑制率分别为71.96％、2.65％。
表2绿木霉192-45对茄腐镰刀菌的抑制作用
实施例3
将绿木霉192-45菌株培养至产孢阶段，用无菌水冲洗收集孢子后制备成1.0×106cfu/mL的孢子悬浮液，采用灌根方式施用于匍匐翦股颖上，使用盆栽为高16.5cm直径16.5cm的圆柱形花盆，以草坪播种方式栽植满盆，并培养至成坪。每盆苗加50mL制备好的绿木霉192-45孢子悬浮液。在绿木霉定殖24天后，收集币斑病菌Clarireedia homoeocarpa菌体并使其破碎，形成菌丝悬浮液，采用叶面喷施和灌溉等方式施用于匍匐翦股颖植株上，每盆50mL，对照组为不添加绿木霉的病原菌接种组。19天后调查各处理的发病率和病情指数(针刺法)。在防治匍匐翦股颖币斑病的盆栽试验中，绿木霉192-45的防病效果高达89.79％，具体情况如图4所示。
表3绿木霉192-45对匍匐翦股颖币斑病的防治效果
实施例4
绿木霉192-45对匍匐翦股颖的促生作用
匍匐翦股颖植株在施加绿木霉192-45孢子悬浮液生长30天后，可以观察到绿木霉192-45处理后的植株明显比对照清水组更旺盛，如图5a所示，且叶绿素含量显著提高，见图5b所示。
绿木霉192-45对狗牙根的促生作用
此外，在狗牙根发芽前，对其培养基质中施加绿木霉192-45孢子悬浮液，待其定殖后，播种狗牙根种子。虽然发芽率并未有显著差异，但绿木霉192-45处理后的狗牙根幼苗高度显著高于对照组，且分蘖数也多于对照组，如图6所示。
由图6a中可以明显的看出，绿木霉192-45能够对于狗牙根有着良好的初审效果，图6b则说明绿木霉192-45对匍匐翦股颖和狗牙根都具有一定的促生作用，可以使草坪草生长更健壮。
实施例5
绿木霉192-45对重金属镉胁迫的耐受性强
将9mm大小绿木霉192-45圆形菌塞接种到含有不同镉浓度的PDA培养基上，观察其生长情况，并计算菌落生长直径。梯度实验结果表明随着镉浓度的增加，绿木霉192-45菌株表现出较强的镉耐受能力，其耐受阈值是200mg/L，如图7所示。
绿木霉192-45提高狗牙根对镉胁迫的耐受性
将绿木霉192-45菌株的孢子悬浮液施用在植物培养基质中，待其定殖24天后，对土壤添加200mg/L镉溶液，每盆每处理均为50mL，对照组为不添加绿木霉的镉溶液处理组。播种狗牙根种子后统计其发芽率和幼苗高度。在镉胁迫条件下，绿木霉192-45处理后的植株的发芽率、分蘖数、幼苗高度均显著高于对照组，如图8所示，这说明绿木霉192-45能提高狗牙根对镉胁迫的耐受力。
实施例6
绿木霉192-45生长速率快
将活化3d后的绿木霉192-45的9mm菌塞置于PDA培养基上进行培养，在25℃条件下，192-45菌株3d即可长满整个培养皿(图1左一)，这说明绿木霉192-45生长快速。
绿木霉192-45产孢能力强
将活化3d后的绿木霉192-45的9mm菌塞置于PDA培养基上进行培养，得到的图像如图1右一所示，说明在25℃条件下，192-45菌株培养7d即可大量产孢，孢子覆盖整个培养皿，这说明绿木霉192-45产孢能力强，有利于相关菌剂生产。
将活化3d后的绿木霉192-45的9mm菌塞置于PDB培养液中进行培养三天后，以1：1的比例将PDB培养液与土豆淀粉进行混合，固态发酵两天后，烘干制成临时菌剂，取1g菌剂稀释后用血细胞计数板对菌剂中的木霉孢子进行计数。以此发酵条件得到的菌剂中含有木霉孢子2×1010cfu/g(图9)，这同样说明了绿木霉192-45产孢能力强。
绿木霉192-45能稳定发挥抗逆促生功能
如上文中介绍，绿木霉192-45能在匍匐翦股颖(冷季型草坪草)和狗牙根(暖季型草坪草)两种不同的植株上，在24d内完成定殖，发挥抵抗逆境促进生长的作用。同样的绿木霉192-45能在重金属胁迫或非胁迫条件下发挥抵抗逆境促进生长的作用。这些不同条件下功能的稳定发挥证明绿木霉192-45具有较强的功能稳定性。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (1)
1.一种绿木霉192-45在制备植物病害防治剂中的用途，其特征在于，所述植物病害防治剂可以抑制茄腐镰刀菌（Fusarium solani），所述植物病害防治剂为绿木霉192-45、含有绿木霉192-45的发酵液、含有绿木霉192-45的菌悬液、含有绿木霉192-45的菌剂或含有绿木霉192-45的孢子悬浮液；
所述植物病害为根腐病；
所述孢子悬浮液的浓度为1.0×108 cfu/mL；
所述孢子悬浮液的使用标准为每盆50 mL；
所述绿木霉192-45对重金属镉的耐受浓度为200 mg/L。
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| 绿木霉对币斑病菌的生长抑制作用及对镉的耐受性;尹月兰 等;《草地学报》;第30卷(第10期);第2802-2810页 * |
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