CN110447467B

CN110447467B - 一种芳香杯伞纯培养菌丝体菌种及其栽培方法

Info

Publication number: CN110447467B
Application number: CN201910664035.8A
Authority: CN
Inventors: 王立安; 史玲玉; 赵立强; 徐琨; 张金秀
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110447467A

Abstract

本发明公开了一种芳香杯伞纯培养菌丝体菌种，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.16979。以获得的芳香杯伞纯培养菌丝体为菌种，建立了芳香杯伞人工栽培方法，具体如下：采用牛粪或发酵料煮汁培养基平板繁育母种，将培养好的母种接种到高粱培养基的菌种瓶，培养后获得栽培种，将栽培种均匀散播在装有经处理的发酵培养料的塑料袋料面上，菌丝长满袋后覆一层厚度2~3 cm、含水量在30%~40%的草炭土，按常规出菇条件控制即可在覆土表面长出芳香杯伞子实体。本发明为食用菌生产提供了芳香杯伞人工栽培菌种，同时，建立了人工栽培获得子实体的方法，为实现芳香杯伞的商业化栽培提供了菌种及栽培技术保障。

Description

一种芳香杯伞纯培养菌丝体菌种及其栽培方法

技术领域

本发明涉及一种食用菌新品种芳香杯伞纯培养菌丝体菌种及人工栽培方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

我国是世界上食用菌产量最大、栽培种类最多的国家。目前，人工栽培的食药用菌品种达40余个，原始菌株多来自野生食药用菌的驯化。例如芳香杯伞(Clitocybefragrans)属真菌门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、杯伞属的一个种，该菌常在夏末秋季林地上群生或丛生，具明显的芳香气味，研究表明，其子实体水提物对小白鼠肉瘤S-180的生长有阻抑作用，对肉瘤S-180的抑制率为100％，对艾氏腹水癌的抑制率为90％，同时还有抗流感病毒、防治感冒的作用，是我国远销欧美的著名食用菌。芳香杯伞属于白蘑科，白蘑科中的杯伞属、口蘑属、香蘑属等很多野生蕈菌均为优良食用菌，但其人工驯化栽培一直是业界公认难题。现有技术中，已有花脸香蘑驯化成功的报道，但对于芳香杯伞国内外未见任何驯化栽培技术的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芳香杯伞纯培养菌丝体菌种及其栽培方法。

实现本发明目的采取的技术方案是这样的：

1.芳香杯伞纯培养菌丝体菌种的分离

将采集到的野生芳香杯伞子实体消毒后纵向撕开，在菌盖与菌柄的连接处用锋利刀片取规格为2mm×2mm×2mm立方大小组织块，接种到PDA试管斜面培养基上，在20～25℃恒温培养箱中避光培养15～20d，长满斜面的菌丝即为芳香杯伞纯培养菌丝体。

2.芳香杯伞纯培养菌丝体菌种的鉴定

采用真菌DNA提取试剂盒提取芳香杯伞子实体与获得纯培养菌丝体的DNA，以DNA为模板，采用ITS通用引物进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物测序后与NCBI的数据库进行BLAST比对分析，最终确定子实体与获得纯培养菌丝体的ITS序列与数据库中的芳香杯伞(Clitocybefragrans)100％相同。申请人已将获得的纯培养菌丝体保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号为CGMCC No.16979，分类命名：芳香杯伞，拉丁名：Clitocybefragrans，保藏日期为2018年12月6日。

3.芳香杯伞菌丝体菌种的栽培方法

为实现芳香杯伞的人工栽培，以获得的纯培养菌丝体为菌种，分别对其母种培养基、原种(栽培种)培养基、栽培料及发菌、出菇条件进行研究，建立了芳香杯伞的人工栽培方法，其步骤和特点如下：

(1)母种繁育所用培养基为牛粪或发酵料煮汁培养基，配方组成为：干牛粪或发酵料100g/L、去皮马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨2.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、无水硫酸镁1.5g/L、琼脂粉20g/L、水1L、pH5～6。

(2)原种或栽培种所用培养基为高粱培养基，配方组成为：高粱粒96％～98％、葡萄糖1％～2％、石膏1％～2％，含水量60％～65％，pH自然。

(3)栽培所用发酵料为处理后的双孢菇发酵料，其处理方法为：向干双孢菇发酵料中添加葡萄糖1％～2％，石膏1％～2％，含水量在60％～70％，采用鼓风干燥箱对发酵料进行二次发酵处理，温度为55～60℃，时间为3d。

本发明取得以下有益效果：本发明为食用菌生产提供了芳香杯伞人工栽培菌种，同时，建立了人工栽培获得子实体的方法，为实现芳香杯伞的商业化栽培提供了菌种及栽培技术保障。

附图说明

图1：芳香杯伞菌丝体在11种母种培养基平板上的长势图。

图2：芳香杯伞菌丝体在5种谷粒培养基上的长势图。

图3：芳香杯伞菌袋覆土出菇图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。

实施例1芳香杯伞纯培养物的分子鉴定

实验材料为芳香杯伞子实体与麦粒煮汁液体培养基获得的纯培养菌丝体，分别冷冻干燥后，取0.1g干燥样品进行研磨。将研磨好的样品按照真菌DNA提取试剂盒的操作步骤进行DNA提取。将提取好的DNA样品进行浓度检测。

采用ITS通用引物ITS1/ITS4对供试菌株的rDNA ITS序列进行扩增，引物序列如下：

ITS1：5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’

ITS4：5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’

建立PCR扩增体系：

将上面的体系里面的样品充分混匀后，离心去气泡，然后进行PCR扩增，反应程序如下：

将扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，查看扩增目的条带，切胶后送测序公司进行测序。将测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对分析，比对结果为扩增ITS序列与芳香杯伞100％同源(Clitocybefragrans)Identities＝1160/1160(100％)，同源号为JF907811.1，据此将分离获得的纯培养物鉴定为芳香杯伞(Clitocybefragrans)菌丝体。

实施例2芳香杯伞母种培养基筛选

从试管中挑取规格为2mm×2mm平方大小的菌丝块，接种于PDA培养基，经过30d培养后，使用直径规格为0.7cm的圆孔打孔器进行打孔，挑取菌种圆片分别接种于11种不同培养基配方的平板上，每种培养基5次重复，于25℃培养箱中进行恒温避光培养。根据菌丝长势、边缘整齐度、洁白程度、菌丝浓密度等筛选芳香杯伞适宜母种培养基。

本实施例所述的11种母种培养基配方分别如下：

A：PDA+木屑煮汁培养基：木屑100g(取煮汁)，马铃薯200g(去皮切片煮汁)，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

B：大豆饼粉培养基：大豆饼粉20g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

C：马铃薯蔗糖培养基：马铃薯200g(去皮切片煮汁)，蔗糖20g，酵母粉6g，磷酸二氢钾3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

D：CPDA培养基：马铃薯200g(去皮切片煮汁)，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

E：玉米粉培养基：玉米粉20g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

F：牛粪煮汁培养基：牛粪100g(取煮汁),马铃薯200g，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

G：麦粒煮汁培养基：麦粒200g(取煮汁)，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

H：发酵料煮汁培养基：发酵料100g(取煮汁)，马铃薯200g(去皮切片煮汁)，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

I：PDA+麸皮煮汁培养基：麸皮100g(取煮汁)，马铃薯200g(去皮切片煮汁)，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，蛋白胨3g，无水硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1L。

J：PDA培养基：马铃薯200g(去皮切片煮汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L。

K：正交配方：蔗糖17.3g、酵母浸粉1.8g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂20g、水1L。

上面所述的11种培养基的灭菌条件为：高压灭菌锅121℃、灭菌时间20min。

所述的平板培养基的规格为直径9cm的一次性塑料平皿。

表1芳香杯伞菌丝体在11种母种培养基平板上的生长情况

据表1结果，最终确定芳香杯伞适宜母种培养基为牛粪或发酵料煮汁培养基。

芳香杯伞在11种平板培养基上的长势图见附图1。

实施例3芳香杯伞原种(栽培种)培养基筛选

从平板上挑取3块直径为1.2cm菌种块接种于装有5种不同的谷粒培养基的原种瓶中，25℃恒温避光培养，根据菌丝粗壮程度、吃料速度和满瓶时间确定芳香杯伞菌丝体的适宜原种(栽培种)培养基。

本实施例所述的5种原种(栽培种)培养基配方为：

A：高粱培养基：高粱98％，石膏2％，含水量60％

B：玉米粒培养基：玉米芯98％，石膏2％，含水量60％

C：荞麦培养基：荞麦98％，石膏2％，含水量60％

D：麦粒培养基：麦粒98％，石膏2％，含水量60％

E：小米粒培养基：小米粒98％，石膏2％，含水量60％

上述所述的5种培养基的灭菌条件为：高压灭菌锅121℃、灭菌时间1～2h。

上述筛选时所选用的是规格为3cm×20cm大小的单头开口的玻璃试管。

上述所述筛选后进行继代扩繁使用的菌种瓶为800mL的塑料瓶。

25～35d后观察发现，芳香杯伞菌种在5种谷粒培养基上均可以正常生长，但是在高粱培养基上长势最好。结果如表2。

表2芳香杯伞菌丝体在5种谷粒培养基上的长势图

因此，确定芳香杯伞适宜原种(栽培种)最培养基为高粱培养基。

芳香杯伞在5种谷粒培养基上长势如附图2。

实施例4芳香杯伞栽培料及发菌、出菇试验

栽培料选择用于栽培双孢菇的发酵料并进行处理，具体为，向发酵料中添加葡萄糖1～2％，石膏1～2％，调节含水量在60～70％之间。采用鼓风干燥箱对发酵料进行二次发酵处理，温度为55～60℃，时间为3d。

将处理好的发酵料装入规格为14cm×28cm×0.05cm的塑料袋中，装入量为300～400g/袋。在菌袋上方接种长满瓶的高粱粒种子，接种量为发酵料总重量的10％～15％。接种结束，在温度为20～25℃、空气相对湿度在50％～60％之间的发菌室中进行恒温避光培养，20～25d后获得长满菌丝的栽培料袋。

打开培养料袋，在菌丝表面均匀覆上预湿好的草炭土，覆土厚度为2～3cm。草炭土需要用1％的石灰水调节含水量在30～40％、pH值为6～7之间。调节出菇室的温度在20～25℃，空气相对湿度在80～90％，并保持每天2次的通风。当原基形成后，加大通风，每天为4次，10d后在覆土层上长出具菌柄、菌盖分化，菌盖呈浅杯状的子实体。

芳香杯伞人工栽培菌袋覆土出菇图如附图3。

Claims

1.一种芳香杯伞纯培养菌丝体菌种的栽培方法，其特征在于包括以下步骤：（1）母种繁育所用培养基为发酵料煮汁培养基，配方组成为：发酵料100g/L、去皮马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨2.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、无水硫酸镁1.5g/L、琼脂粉20g/L、水1L、pH5～6；

（2）原种或栽培种所用培养基为高粱培养基，配方组成为：高粱粒96%～98%、葡萄糖1%～2%、石膏1%～2%，含水量60%～65%，pH自然；

（3）栽培所用发酵料为处理后的双孢菇发酵料，其处理方法为：向干双孢菇发酵料中添加葡萄糖1%～2%，石膏1%～2%，含水量在60%～70%，采用鼓风干燥箱对发酵料进行二次发酵处理，温度为55～60℃，时间为3d；

将处理好的发酵料装入规格为14cm×28cm×0.05cm的塑料袋中，装入量为300～400g/袋；在菌袋上方接种长满瓶的高粱粒种子，接种量为发酵料总重量的10％～15％；接种结束，在温度为20～25℃、空气相对湿度在50％～60％之间的发菌室中进行恒温避光培养，20～25d后获得长满菌丝的栽培料袋；

打开培养料袋，在菌丝表面均匀覆上预湿好的草炭土，覆土厚度为2～3cm；草炭土需要用1％的石灰水调节含水量在30～40％、pH值为6～7之间；调节出菇室的温度在20～25℃，空气相对湿度在80～90％，并保持每天2次的通风；当原基形成后，加大通风，每天为4次，10d后在覆土层上长出具菌柄、菌盖分化，菌盖呈浅杯状的子实体；

所述芳香杯伞纯培养菌丝体菌种，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.16979。