CN109402288A

CN109402288A - 一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法

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Publication number: CN109402288A
Application number: CN201811440451.1A
Authority: CN
Inventors: 许大凤; 檀根甲; 周本国; 叶磊; 朱启法; 汪文杰; 裴洲洋; 陈志强
Original assignee: INSTITUTE OF TOBACCO ANHUI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF TOBACCO ANHUI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明公开了一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法，属于生物安全技术领域；一种用于检测根串珠霉菌的引物，所述的引物为如下所示，上游引物：SEQ ID No：1，下游引物：SEQ ID No：2；用于检测根串珠霉菌的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，随后进行实时荧光定量PCR扩增反应；(3)分析实时荧光定量PCR扩增产物。将实时荧光定量技术应用到根串珠霉菌的分子检测方面，其采用的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，为根串珠霉菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中根串珠霉菌的检测效率。

Description

一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法

技术领域

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法。

背景技术

由根串珠霉菌引起的烟草根黑腐病是烟草生产上的重要真菌病害之一，其通过菌丝生长和孢子萌发产生的芽管侵入寄主植物导致发病，从幼苗到成株期均可发病，主要危害根系。烟苗发病后，幼茎、子叶和根尖发黑腐烂，重病株的根系则全部腐烂，呈黑色。烟株不死，地上部分呈现生长缓慢，发黄，矮化。常与黑胫病混合发生，造成烟草损失。它遍布世界主要产烟区，在美国、加拿大、日本等国曾使烟草生产遭受严重损失，我国主要烟区也均有发生。尤其近年来，此病在一些烟区蔓延，在我国云南、贵州、湖北等省发生严重，严重地块发病率可达30％以上。山东、河南、安徽、吉林、福建等省也有发生，近年来有加重危害的趋势。

由于根黑腐病为土传病害，通常与其它烟草根茎部的病害混合发生，给病害的正确诊断造成困难。根黑腐病菌危害烟草在肉眼能够观察到病症之前称为危害早期阶段，在根黑腐病病害发生的早期阶段，不能显现出根部发黑，病斑环绕茎部、侧根、根尖变黑等烟草根黑腐病病症。通常根黑腐病菌危害烟草5-6天才能观察到病症，因此，在烟草根黑腐病害发生的早期难以针对性地进行有效防治，造成根黑腐病菌危害严重，引起较大的经济损失。因此，建立烟草根黑腐病菌特异性的快速分子检测体系，及早对发病植株或土壤中带菌病原菌快速准确地进行检测，对于及时采取科学合理的防治措施控制病害的发生、流行，减少病害造成的经济损失具有重要的指导意义。

传统用于对植物病原菌的检测鉴定方法是首先利用选择性培养基进行病原菌的分离培养，获得纯培养菌株以后，根据菌落特征、孢子形态大小等形态学特征、致病性测定、生理生化特性等进行鉴定。这些方法耗时费力，程序繁琐，且病原菌的分离鉴定经验性很强。已有研究表明，烟草根黑腐病菌不同菌株间的形态差异明显，有些菌株可产生大量的扇形白化菌株，有些白化菌株的单孢菌落可回复到野生型，鉴定时易受人为环境等诸多因素的干扰。此外，由于不能直接从植物带病组织中检测出病原菌，难以满足病害防治所需的快速、准确、灵敏的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用。基于基因组DNA的PCR技术的快速发展有效地弥补了传统分类鉴定方法的不足,其具有的特异性、灵敏性和快速性等特点成为植物病原菌分类和鉴定应用最广泛的技术之一。由于PCR技术不需要对病原菌进行分离纯化即可对植物病组织进行快速检测和诊断，因此可用于烟草根黑腐病显症前的早期诊断，为病害的准确鉴定和及时防治提供科学依据。

目前针对植物病原菌的PCR检测技术绝大部分是基于核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)序列开发的特异性引物。国内外研究人员也对烟草根黑腐病菌的rDNA-ITS序列开发了用于PCR技术的特异性扩增引物。但是越来越多的研究发现，在一些近缘种的病原菌中，rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将它们区分开，因此需要开发一些新的基因进行检测。

康振辉等(康振辉,黄俊丽.土壤中烟草根黑腐病菌的实时定量PCR检测技术研究[J].植物病理学报,2010,40(2):210-213.)人在文章中所用的引物Tb-1/Tb-2用PCR扩增反应可扩增出334bp的产物，但其特异性较差且扩增效率低。

发明内容

1、要解决的问题

针对根串珠霉菌尚无有效运用实时荧光定量PCR技术进行检测的问题，本发明提供一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法，它可以提高根串珠霉菌检测的特异性和灵敏度。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用于检测根串珠霉菌的引物，

所述的引物为如下所示，

上游引物：SEQ ID No：1；

下游引物：SEQ ID No：2。

优选地，由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物对所获得的电泳条带如图2所示。

一种用于检测根串珠霉菌的检测方法，

包括以下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的引物进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)分析实时荧光定量PCR扩增产物。

优选地，步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括如权利要求1所述的引物的上游引物和如权利要求1所述的引物的下游引物。

优选地，步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应为，其反应体系以20μL计为：

优选地，步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

优选地，根串珠霉菌DNA的检测下限在1.74ng/uL。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明中用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法，将实时荧光定量技术应用到根串珠霉菌的分子检测方面，其采用的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，特别是大大降低了样品的检测下限，实现了对低拷贝样本完成准确鉴定的关键创新，为根串珠霉菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中根串珠霉菌的检测效率。

附图说明

图1为实施例2中根串珠霉菌引物检测方法的建立的效果图；

图2为实施例2中根串珠霉菌引物检测方法中PCR扩增反应后进行琼脂糖凝胶电泳图；

图3为实施例3中根串珠霉菌引物的特异性检测的效果图；

图4为实施例5中根串珠霉菌引物进行实时荧光定量PCR的溶解曲线图；

图5为实施例5中根串珠霉菌引物进行实时荧光定量PCR的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例中使用的SYBR Premix Ex Taq(2x)以及ROX Reference DyeⅡ购自TaKa Ra公司，商品编号Code No.RR82LR；样品中DNA的提取方法如下：采用康为世纪生物科技有限公司的Soil Genomic DNA Kit试剂盒提取样品的总DNA。

实施例1

根串珠霉菌引物的设计

以烟草根黑腐病病原菌根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola，参考的序列的GenBank登录号：MH857104.1)rDNA-ITS序列为靶基因，依据引物设计原则，设计可用于实时荧光定量检测的引物(SEQ ID No：1和SEQ ID No：2)；

用于实时荧光定量检测的引物：

上游引物Tb-F(SEQ ID No.1)：5’-TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCT-3’；

下游引物Tb-R(SEQ ID No.2)：5’-CAGGGAAGCTGTATATACAACAGCCGATG-3’。

现有技术中(康振辉等人)所用的引物如下所示：

上游引物Tb-1(SEQ ID No.3)：5’-TATTCATTGCTGAGTGGC-3’；

下游引物Tb-2(SEQ ID No.4)：5’-GGTTTTCCGGCATGTTAT-3’。

实施例2

根串珠霉菌引物检测方法的建立

用于检测根串珠霉菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用实施例1所述的引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，其反应体系以20μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s；

(3)分析实时荧光定量PCR扩增产物。

本实施例中，分别以阴性对照模板与阳性对照模板的基础按照上述检测方法进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中阳性对照模板的试验中的待检测DNA模板替换为根串珠霉菌的DNA(DNA的浓度为1ng/uL)，其中阴性对照模板的试验中的待检测DNA模板替换为ddH₂O；

分析实时荧光定量PCR扩增产物：阴性对照模板的试验由于采用ddH₂O作为待检测DNA，故在CT曲线图和融解曲线图中均无数值；阳性对照模板的试验的引物分别选用Tb-1/2引物和Tb-F/R引物进行试验，CT曲线图和融解曲线图分别如图1(A)和图1(B)所示，图1(A)和图1(B)中曲线1和曲线2分别代表Tb-1/2引物的试验和Tb-F/R引物的试验，可以看出曲线2的扩增效率明显高于曲线1，同时曲线1和曲线2在87.06℃时出现最大峰，虽然曲线1在87.06℃也出现明显的峰值，但曲线1表现为多峰，而曲线2则表现较为平滑，这说明曲线2所代表的引物特异性更强，使得实时荧光定量PCR的结果更加可靠；

最后分别取实时荧光定量PCR扩增反应后的原液取5uL进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，分别在150bp(Tb-F/Tb-R，图2中序号“1”)和300bp(Tb-1/Tb-2引物，图2中序号“2”)距离有单一的条带，这说明两种引物的扩增效果都很理想。结合图1和图2，可以看出，本申请设计的Tb-F/Tb-R引物在常规的SYBR Green方法进行实时荧光定量PCR扩增反应时，其扩增效率较高，特异性较强，结果可靠性较高。

实施例3

根串珠霉菌引物的特异性检测

本实施例的用于检测根串珠霉菌的检测方法同实施例2，不同在于：

所述的样品分别为根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)、烟草黑胫病(Phytophthora par asitica var.nicotianae)、烟草根腐病(Fusarium oxysporum)、小麦赤霉(Fusarium graminearum)、油菜菌核(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)、ddH₂O；

引物为实施例1中的引物Tb-F/Tb-R时：

图3中的标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”分别指的是根串珠霉菌、烟草黑胫病、烟草根腐病、小麦赤霉、油菜菌核、水稻纹枯病、ddH₂O的检测结果，

上述图3的检测结果图表明，用于检测根串珠霉菌的引物仅对根串珠霉菌有特异性扩增(仅出现一个明亮的单一条带)，这表明本申请引物Tb-F/Tb-R特异性较高。

实施例4

根串珠霉菌实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度检测

所述的样品为根串珠霉菌悬液，其中样品的浓度以每毫升悬液中根串珠霉菌孢子计，制备孢子浓度分别为1x10⁶个/mL、1x10⁵个/mL、1x10⁴个/mL、1x10³个/mL、1x10²个/mL和1x10¹个/mL的孢子悬液；

上述不同样品浓度的根串珠霉菌悬液各取100uL分别提取DNA作为待检测DNA模板；

引物为实施例1中的引物Tb-F/Tb-R时：

如表1所示，用Tb-F/Tb-R引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，其检测下限在10个孢子/反应体系，根串珠霉菌DNA的检测下限在1.74ng/uL。且在此模板浓度条件下，传统PCR反应无法扩增出可见的目标条带。

引物为实施例1中的引物Tb-1/Tb-2时：

如表2所示，用Tb-1/Tb-2引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，其检测下限在1000个孢子/反应体系，根串珠霉菌DNA的检测下限在69.7ng/uL。

表1

表2

实施例5

所述的样品为接种根串珠霉菌的土壤，其中携菌量以每克土壤中根串珠霉菌孢子计，制备携菌量分别为1x10⁶个/g土壤、1x10⁵个/g土壤、1x10⁴个/g土壤、1x10³个/g土壤、1x10²个/g土壤和1x10¹个/g土壤的接种根串珠霉菌的土壤；

上述不同携菌量的土壤中各取0.1g分别提取DNA作为待检测DNA模板；

引物为实施例1中的引物Tb-F/Tb-R时：

如表3和图4所示，用Tb-F/Tb-R引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，上述不同携菌量的土壤都有CT值，最后的溶解曲线都是单一的峰值，且溶解温度为84.87℃。此外，由表2中反应CT值和携菌量lg值，可以计算出每个反应体系中孢子数目的对数(X)和对应的ct值(Y)之间呈线性关系，即实时荧光定量PCR的标准曲线：y＝-1.5206x+24.919，R²＝0.9983，如图5所示。

表3

将表3的数据用SPSS 20.0软件进行方差分析，各组平均数、标准偏差，通过计算各组变异系数得到：各组的标准偏差在在0.07-0.38之间，变异系数在0.30％-2.42％之间，并采用LSD方法检验得到F＝157.58，P＝0.00048，小于极显著水平0.01，结果表明各组间差异极显著，重复性可靠。

引物为实施例1中的引物Tb-1/Tb-2时：

如表4所示，用Tb-1/Tb-2引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，上述不同携菌量的土壤中仅两个高浓度携菌量(携菌量lg值为5和6)的试验有CT值，最后的溶解曲线表现为多峰。此外，由表4中反应CT值和携菌量lg值，无法计算出每个反应体系中孢子数目的对数(X)和对应的ct值(Y)之间是否呈线性关系。

表4

将表4的数据用SPSS 20.0软件进行方差分析，各组平均数、标准偏差，通过计算各组变异系数得到：各组的标准偏差在在1.34-1.54之间，变异系数在3.96％-4.44％之间，并采用LSD方法检验得到P＝0.09，大于显著水平0.05，结果表明各组间差异不显著，重复性不可靠。

实施例6

某试验田地的验证试验

如表5，在模拟的无菌烟草试验田中施放根串珠霉菌并控制试验田内每克土壤有3615个孢子，然后将上述试验田分成编号1和2的田块，每个田块通过五点取样并计算每个田块内根串珠霉菌孢子的平均值，田块1通过实施例2(采用引物Tb-F/R)的检测后计算得到平均每克土壤有3483个孢子；田块2通过实施例2(采用引物Tb-1/2)的检测后计算得到平均每克土壤有2890个孢子。

表5

综上所述，由实施例1-6可见，本发明中用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法，将实时荧光定量技术应用到根串珠霉菌的分子检测方面，其采用的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，为根串珠霉菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中根串珠霉菌的检测效率。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

序列表

<110> 安徽省农业科学院烟草研究所

<120> 一种用于检测根串珠霉菌的引物及检测方法

<130> 20181010

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgcct 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

cagggaagct gtatatacaa cagccgatg 29

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

tattcattgc tgagtggc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ggttttccgg catgttat 18

Claims

1.一种用于检测根串珠霉菌的引物，其特征在于：

所述的引物为如下所示，

上游引物：SEQ ID No：1；

下游引物：SEQ ID No：2。

2.根据权利要求1所述的用于检测根串珠霉菌的引物，其特征在于：由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物对所获得的电泳条带如图2所示。

3.一种用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的引物进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)分析实时荧光定量PCR扩增产物。

4.根据权利要求3所述的用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括如权利要求1所述的引物的上游引物和如权利要求1所述的引物的下游引物。

5.根据权利要求4所述的用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应为，其反应体系以20μL计为：

6.根据权利要求3或4或5所述的用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

7.根据权利要求6所述的用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于：根串珠霉菌DNA的检测下限在1.74ng/uL。