CN104726556A - 烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法 - Google Patents

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郑文明
申一林
宋鹏宇
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明涉及一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法。所述检测引物包括：TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG，TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT；所述检测方法包括在一定条件下进行的提取总DNA、PCR扩增和凝胶电泳等步骤。本发明提供了特异性和高灵敏性的检测引物，建立了特异性和高灵敏度的PCR检测体系，通过检测烟株病残体和土壤的基因组序列，完成了烟草根黑腐病菌的快速准确超低浓度鉴定。

Description

烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法
技术领域
本发明属于植物病虫害检疫领域，具体涉及一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法。
背景技术
烟草根黑腐病是世界性的病害，一旦发病就会造成巨大的经济损失，在我国云南、贵州、湖北等主要产烟区发生较重，严重地块发病率可达30%以上。山东、河南、安徽、吉林、福建等产烟区也有发生，近年有加重危害的趋势。但是，烟草根黑腐病菌作为烟草常见的一种土传真菌，目前对其检测还未形成特异性和高灵敏性体系。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法，设计了特异性和高灵敏性的检测引物，建立了烟草根黑腐病菌的PCR检测体系。
本发明通过以下技术方案实现：
设计一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物，包括以下引物：
TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG
TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
设计一种烟草根黑腐病菌的分子检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待检测烟株、土壤或其混合材料中的总DNA；
（2）以所述总DNA为模板用上述引物对进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1μL的总DNA，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl2溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH2O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30 s、59℃退火50 s和72℃延伸30 s，最后在72℃延伸5 min；
（3）取所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如在131bp处出现特异条带，说明待检测材料带有烟草根黑腐病菌，反之则不携带。
根据上述的分子检测方法，所述总DNA浓度不小于100fg/μL。
本发明的积极有益效果：
本发明在综合考量DNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出了特异性和高灵敏性（达100fg/μL）的检测引物，建立了特异性和高灵敏度的PCR检测体系，通过检测烟株病残体和土壤的基因组序列，完成了烟草根黑腐病菌的快速准确超低浓度鉴定，并进一步实现了对不同耕作栽培条件下病害风险的精确预警性监测，显著提高了烟草根黑腐病害的防治水平，满足烟叶生产上的迫切需求。
附图说明
图1本发明引物的特异性鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
图中 M DL2000 DNA Marker，1烟草根黑腐病菌，2烟草黑胫病菌，3镰刀菌，4烟草赤星病菌，5烟草灰霉菌，6烟叶，7烟草角斑病菌，8烟草蛙眼病菌。
图2本发明引物的灵敏性鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
图中M DL2000 DNA Marker，CK ddH2O空白对照，9-16分别为基因组DNA浓度（104ng/μL）的1倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物，引物对如下：
TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG
TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
实施例2
一种烟叶中烟草根黑腐病菌的分子检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待检测烟株烟叶部分的基因组DNA：
1）用无水乙醇先把研钵、研杵、镊子灼烧灭菌，冷却至室温，向研钵中加入液氮对研钵和研杵进行预冷，将装有烟叶的离心管放进液氮瓶中进行预冷，当研钵表面结出白霜即可用来研磨；
2）将离心管中的烟叶倒入研钵，向研钵中加入适量液氮快速、用力研磨，研磨过程中要不断添加液氮，研磨三次，研磨成均匀粉末状态后分装至1.5 mL离心管；
3）加入800μL SLS提取液轻微晃动5min，加800μL 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）摇动5min，室温12000rpm离心10min；
4）将上清移入新的无菌的1.5mL离心管中，加等体积异丙醇轻微摇晃2min，20℃静置2min；
5）再离心10分钟，弃上清，用1mL75%乙醇洗涤一次，12000rpm离心10min，弃上清；
6）室温放置5～10min晾干，加入ddH2O 50μL充分溶解；
7）用Nanodrop 1000核酸测定仪测定DNA浓度，为100ng/μL；
（2）以所述基因组DNA为模板用所述引物对进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1 μL的总DNA，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl2溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH2O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30 s、59℃退火50 s和72℃延伸30 s，最后在72℃延伸5 min；
（3）取所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在131bp处出现特异条带，说明待检测材料带有烟草根黑腐病菌。
本发明检测方法的特异性鉴定试验：
（1）分别以烟草根黑腐病菌的基因组DNA 100ng/μL，以及同浓度的烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、烟草灰霉病菌、烟草蛙眼病菌、烟叶、烟草灰斑病菌和镰刀菌的基因组DNA为模板用所述引物对TB1419-F和TB1419-R进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1μL的总DNA，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl2溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH2O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30 s、59℃退火50 s和72℃延伸30 s，最后在72℃延伸5 min；
（2）分别取所得8组PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，只有烟草根黑腐病菌在131bp处出现特异条带，见图1，表明本发明检测方法的特异性较强。
本发明方法的灵敏性鉴定试验：
（1）分别以烟草根黑腐病菌的基因组DNA 100ng/μL，及将其稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍的基因组DNA溶液为模板用所述引物对TB1419-F和TB1419-R进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl2溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH2O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30 s、59℃退火50 s和72℃延伸30 s，最后在72℃延伸5 min；
（2）分别取所得8组PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图2，100ng/μL~稀释10-6倍溶液在131bp处均出现明显的特异条带，表明：本发明方法可检测出100fg/μL的待检测DNA浓度，灵敏度高。
本发明涉及在菌株、土壤或其混合材料中提取总DNA的方法均为常规技术，在此不再赘述。
本实施例所用烟草黑胫病菌、根黑腐病菌菌株由河南科技大学提供，为2012～2013年从河南的洛阳、南阳、郑州等河南主要的产烟区采集；烟草赤星病菌株、烟草蛙眼病菌株、烟草灰霉病菌株由河南农业大学植物保护学院微生物资源保藏室馈赠，镰刀菌菌株由河南省农科院馈赠，烟叶为实验室种植所得。土样采自洛阳宜阳烟田。
本发明并不局限于上述具体实施方式，本领域技术人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或者类似的变化都应涵盖在本发明权利要求的范围内。

Claims (3)

1.一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物，其特征在于，包括以下引物对：
TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG
TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
2.一种烟草根黑腐病菌的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待检测烟株、土壤或其混合材料中的总DNA；
（2）以所述总DNA为模板用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1μL的总DNA，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl2溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH2O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30s、59℃退火50s和72℃延伸30s，最后在72℃延伸5min；
（3）取所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如在131bp处出现特异条带，说明待检测材料带有烟草根黑腐病菌，反之则不携带。
3.根据权利要求2所述的分子检测方法，其特征在于：所述总DNA浓度不小于100fg/μL。
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