CN105462971A - 水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物 - Google Patents

水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因<i>Pi2</i>的特异性分子标记及其专用引物，所述水稻抗稻瘟病基因<i>Pi2</i>的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQ？ID？NO：1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQ？ID？NO：2核苷酸序列的引物。采用本发明的技术方案，使用方法简单，降低了育种成本，而且能快速地检测抗稻瘟病基因<i>Pi2</i>的特异性功能标记，以区分是否为含<i>Pi2</i>抗稻瘟病基因的水稻品种；缩短育种周期，在水稻的分子标记辅助育种中发挥重要作用。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起的广泛发生在世界各稻区的重要病害之一，严重威胁着世界的粮食安全。目前主要通过化学防治和种植抗病品种来控制稻瘟病。化学防治在一定程度上能减轻病害、减少产量损失，但是对环境造成污染，因而通过选育抗病新品种来预防稻瘟病是最佳选择，但由于其病菌小种遗传的复杂性和致病性的多样性，抗病新品种在推广3-5年后会丧失抗性。目前，抗稻瘟病分子标记辅助育种主要利用与抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，大大提高了育种效率，但往往也存在分子标记与抗病基因不连锁导致辅助选择失败的情况。而利用抗病基因序列建立与稻瘟病抗病基因完全共分离的基因标签，则能让辅助选择理论上达到100％的准确性。
抗稻瘟病基因Pi2是较为广谱的抗性基因，但目前尚未有基因内特异性标记开发的应用报道。目前，跟踪稻瘟病基因Pi2的分子标记一般用紧密连锁的标记AP22，显性分子标记M-Pid2或共显性分子标记M-Pi2等，距离Pi2均有一定距离，选择效率无法达到100％；而且有些方法还需要进行酶切，方法复杂，成本较高。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物，使用方法简单有效，降低了育种成本，能快速地检测抗稻瘟病基因Pi2的特异性功能标记，由于该标记位于Pi2基因簇内，选择效率理论上达到100％的准确性。
对此，本发明的技术方案为：
一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物，所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQIDNO：1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQIDNO：2核苷酸序列的引物；具体如下所示。
Pi2DomR：TCTCTCTTAgCTgATCCAAgTCA
Pi2DomF：gCAggAATCTCAgATggTgg。
本发明还提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，包括以下步骤：
步骤S1；提取水稻的基因组DNA；
步骤S2：以步骤S1的水稻的基因组DNA为模板，采用如上所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物对基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳以区分是否为含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻，含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻DNA能扩增出322b的条带，而不含Pi2抗病基因的水稻DNA模板扩增不出目的条带。
作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的反应体系为20ul的体系，包括：10×Buffer2.0ul，dNTP0.4ul，浓度为4mol/L的Pi2DomR引物和Pi2DomF引物各1.0ul，Taq酶0.2ul，模板DNA2.0ul，ddH2O12.8ul。
作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72℃最后一步延伸10min。
本发明还提供了如上所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物在水稻育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
第一，采用本发明的技术方案，能准确判断水稻育种材料中是否含有Pi2基因。以往的标记判断都有假阳性存在。
第二，采用本发明的技术方案，PCR扩增后，1.2％凝胶电泳即可检测，使用方法简单，降低了育种成本。
第三，采用本发明的技术方案，缩短育种周期，选择效率理论上达到100％的准确性，实际应用中，检测一个含有Pi2的F2分离群体248个单株，抗性与基因型完全一致，选择效率100％，可以在水稻的分子标记辅助育种中发挥重要作用。
附图说明
图1是本发明不同水稻材料的抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的凝胶电泳图。
图中，M代表DNAMarkerDL2000，从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
图2是本发明实施例2抗性调查样品部分水稻DNA样品的凝胶电泳图。
图3是本发明实施例3用M-Pi2扩增96个水稻DNA样品的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
以下实施例中所用的96个水稻品种如下表1所示，所选水稻品种来源于广西壮族自治区农业科学院水稻研究所和广西壮族自治区农业科学院植物保护所所存样品。
一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物，所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQIDNO：1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQIDNO：2核苷酸序列的引物。
水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的具体方法和过程如下：
步骤S1；分别提取96个水稻品种的基因组DNA；
步骤S2：分别以步骤S1的水稻的基因组DNA为模板，采用所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物对基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照，96个水稻品种的电泳图如图1所示。
所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQIDNO：1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQIDNO：2核苷酸序列的引物；具体如下所示。
Pi2DomR：TCTCTCTTAgCTgATCCAAgTCA；
Pi2DomF：gCAggAATCTCAgATggTgg；
所述PCR扩增的反应体系为20ul的体系，包括：10×Buffer2.0ul，dNTP0.4ul，Pi2DomR引物和Pi2DomF引物浓度4mol.L-1各1.0ul，Taq酶0.2ul，模板DNA2.0ul，ddH2O12.8ul。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72℃最后一步延伸10min。
表196个水稻品种表
编号 品种名称 基因型 编号 品种名称 基因型 编号 品种名称 基因型
1 IRBLA-A - 33 IRBL5-M - 65 IRBLTA-CT2 -
2 IRBLA-C - 34 IRBL9-W - 66 金围矮 -
3 IRBLI-F5 - 35 IRBL12-M - 67 L427 -
4 IRBLKs-F5 - 36 IRBL19-A - 68 R106 +
5 IRBLK-Ka - 37 IRBL20-IR24 - 69 丰源B -
6 IRBLKp-K60 - 38 IRBL7-M - 70 泰丰B -
7 IRBLKh-k3 - 39 特特普 - 71 桂99 -
8 IRBLz-FU - 40 珍龙13 - 72 密阳48 -
9 IRBLzt-T - 41 四丰43 - 73 R488 -
10 F128-1 - 42 东农363 - 74 R473 -
11 IRBLTA-CP1 - 43 关东51 - 75 辐恢838 -
12 IRBLB-b - 44 合江18 - 76 广恢998 -
13 IRBLT-K59 - 45 丽江新团黑谷 - 77 IRBB7 -
14 IRBLSH-S - 46 中浙B - 78 蜀恢527 -
15 IRBLSH-B - 47 Ⅱ-32B - 79 测253 -
16 F80-1 - 48 岗46B - 80 华占 +
17 F98-7 - 49 特B - 81 R273 -
18 F124-1 - 50 IR1552 - 82 黄占 +
19 BL122 + 51 112B - 83 博B -
20 F129-1 - 52 良丰B - 84 丰田B -
21 F145-2 - 53 西菲B - 85 Y58S -
22 新2号 - 54 宇19B - 86 孟S -
23 爱知旭 - 55 博ⅡB - 87 9802 -
24 藤板5号 - 56 博Ⅲb - 88 广占63S -
25 草笛 - 57 地谷B - 89 95B -
26 梅雨明 - 58 福伊B - 90 金23B -
27 福锦 - 59 谷梅4号 - 91 158B -
28 IRBLkm-TS - 60 协青早B - 92 62B -
29 IRBLTA-RE - 61 南粳46 - 93 R402 -
30 IRBL1-CL - 62 B5 - 94 R974 -
31 IRBLz5-CA + 63 BP60 - 95 内香B -
32 IRBL3-CP4 - 64 香粳糯 - 96 中恢9308 -
如图1所示，标号为19、31、68、80、82在322bp处有明显的亮条，为含抗稻瘟病基因Pi2的品种，而其他为不含抗稻瘟病Pi2基因的品种。
并对此96个水稻品种进行田间稻瘟病抗性鉴定，结果为：标号19、31、68、80、82的为含抗稻瘟病基因Pi2的品种。
经过对比得出，采用所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的方法鉴定的结果与此田间稻瘟病抗性鉴定一致。
实施例2
准确性测定实验。
(1)水稻材料
水稻品系IRBLz5-CA与丽江新团黑谷(LTH)的F2单株388个单株于2014年早稻种植于岑溪梨木镇稻瘟病病圃。
(2)水稻基因组DNA提取
插秧后14天分别取种植于384个单株的水稻叶片基因组DNA的提取按(Murray，1980)的CTAB法进行。
(3)PCR扩增
PCR反应体系为20ul的体系，含2.0ul10×Buffer，0.4uldNTP，Pi2Dom两种引物各1.0ul4mol.L-1，0.2ulTaq酶，2.0ul模板DNA，13.8ulddH2O。PCR反应程序94℃5min，然后35个循环94℃30s，62℃30s，72℃45s，最后72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳(90V,20min)，gelred核酸染料染色，紫外灯下观察拍照。
(4)抗性调查
插秧后35天，对F2群体的叶瘟发病情况进行调查，有稻瘟病典型病斑的记为S，无典型病斑的记为R。
(5)结果与分析
调查结果，水稻品系IRBLz5-CA表现为抗(R)，LTH表现为感(S)。388个单株中，有296个单株表现为抗(R)，92个单株表现为S，R：S分离比为3：1(卡方0.35)。用分子标记Pi2Dom检测这388个单株，296个抗性单株均有322bp的产物，而92个单株无扩增产物，如图2所示为其中24个水稻DNA样品的凝胶电泳图，图中有条带的单株对稻瘟病叶瘟表现为抗(R)，无带的单株对稻瘟病叶瘟表现为感病(S)。从而说明Pi2Dom能100％准确跟踪抗稻瘟病基因Pi2。
实施例3
Pi2Dom与其他检测Pi2基因的引物相比所具有的优势对比实验。
根据抗病基因的序列，建立与抗病基因紧密连锁的分子标记或显性分子标记。华丽霞,汪文娟等在“抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特异性分子标记的开发.中国水稻科学.2015,29(3):305-310”中，利用抗稻瘟病基因Pi2与日本晴基因组上的等位感病基因序列比对，通过CAPS/dCAPS的方法建立了基于PCR技术检测的基因特异性分子标记Pi2SNP,高利军等在“24个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布.第一届中国杂交水稻大会论文集.2010年9月：294-298”中，利用抗稻瘟病基因Pi2基因序列与日本晴等位基因的序列差异建立了抗稻瘟病基因的共显性分子标记M-Pi2。Pi2SNP和M-Pi2这两个分子标记，特异性强，辅助选择的准确率高，但是也存在一定的局限性。标记Pi2SNP扩增获得的PCR产物于6％～8％的聚丙烯酰胺变性电泳凝胶中电泳检测(90V,120min)，与实施例1的Pi2Dom相比操作复杂，耗时长，费用高。
由于Pi2与Piz-t属于等位基因，用共显性分子标记检测含有Pi2与Piz-t基因的水稻植株无法具体确定该单株含Pi2和Piz-t中的哪一个基因或者两个基因都含有。用M-Pi2扩增实施例1表格中的96个水稻DNA样品PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测(120V,15min)，结果如图3所示。对图3经抗病鉴定可见，图中编号为9、75为含有抗病基因Piz-t的植株，而19、31、68、80、82为含有抗病基因Pi2的植株。而采用本发明的Pi2Dom引物则能够特异检测出含有基因Pi2的单株。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物，其特征在于：由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQIDNO：1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQIDNO：2核苷酸序列的引物。
2.一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，其特征在于，采用以下步骤：
步骤S1；提取水稻的基因组DNA；
步骤S2：以步骤S1的水稻的基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物对基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳以区分是否为含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻，含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻DNA能扩增出322bp的条带。
3.根据权利要求2所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为20ul的体系，包括：10×Buffer2.0ul，dNTP0.4ul，浓度为4mol/L的Pi2DomR引物和Pi2DomF引物各1.0ul，Taq酶0.2ul，模板DNA2.0ul，ddH2O12.8ul。
4.根据权利要求3所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环30次，72℃最后一步延伸10min。
5.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物在水稻育种中的应用。
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