CN102277444A

CN102277444A - 一种利用rapd快速区分葡萄品种的方法

Info

Publication number: CN102277444A
Application number: CN201110278546XA
Authority: CN
Inventors: 房经贵; 刘崇怀; 王晨; 上官凌飞; 宋长年; 吴伟民
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-09-19
Filing date: 2011-09-19
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明公开了一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，属于分子生物学分子标记领域。该方法通过设计出的11个RAPD随机引物可完全区分28个葡萄品种，引物经稳定性和多态性筛选，并确定最佳退火温度；通过对11个随机引物进行PCR扩增，根据特异性谱带构建相应被区分品种的图谱关系。该方法操作方便，快速准确，7次PCR就能够将28个葡萄品种在分子水平上区分开，所得的品种鉴定图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

Description

一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种利用RAPD快速地区分葡萄品种的方法。

背景技术

葡萄不仅栽培历史悠久，而且分布广泛。近些年来，随着我国葡萄产业的快速发展，大量的优良品种应用于葡萄生产中。因此，建立葡萄品种快速可靠的鉴定技术体系对于苗木早期鉴定、品种权利保护、生产中品种的区分等具有重要的实际意义。目前，传统单一的形态学品种鉴定方法已经难以有效区分或鉴别众多的品种；而且，许多葡萄育种亲本越来越集中在少数优良品种或品系上，使得所选育的新品种在更多的性状上更加相似，而难以区分。如何有效的鉴定科研和生产中品种，就成为一个常常遇到，而又非常重要的问题。迄今尚没有利用DNA标记进行品种鉴定的快速与高效的措施，也无法形成进行品种鉴定时的依据与参考。因此，品种鉴定就缺乏目的性，非直观，同时随机性太强，工作效率低。为此，开发快速进行品种鉴定的新措施具有重要意义。

分子标记是随着分子克隆和重组DNA技术的发展而产生的一类遗传标记。近年来，分子标记技术已被广泛用于蔬菜作物的种质鉴定和指纹分析。由于DNA分析技术不受环境、发育阶段、取样部位的影响，检出的多态位点是无限的，结果具有高度的可靠性，且鉴别力强，重复性高。在常用的RAPD、RFLP、SSR、AFLP等分子标记技术中，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)发展历史长，是应用最早的DNA标记技术之一，它以快捷、简便、不易受外界环境影响以及不需要预知基因组序列的特点与优势，已被广泛应用于品种的分类研究、种质资源的遗传基础研究、基因连锁标记、遗传图谱的构建等方面。

现有RAPD在蔬菜作物的种质鉴定中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱，并结合统计学软件进行聚类分析，但聚类分析的结果往往无法用于品种鉴别。中国专利“基于基因组RAPD分析的豇豆品种分子鉴定方法”(专利号ZL200510018593.5)公开了基于RAPD区分并判断豇豆不同品种的方法，经过筛选得到23个引物，采用0-1指纹技术并构建出聚类树。该专利采用引物较多，在品质鉴定时操作量非常大，通过聚类树不好判断区分品种的引物，而且不够直观。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，用于高效区分葡萄品种，构建直观实用的鉴别图谱。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法包括如下步骤：

(1)针对葡萄的基因序列设计RAPD随机引物，筛选得到稳定性和多态性高的随机引物，并确定退火温度；

(2)利用步骤(1)得到的随机引物对未知葡萄品种进行PCR扩增，根据特异性谱带构建相应被区分品种的图谱关系。

所述步骤(1)中的随机引物由11个碱基组成，随机引物筛选通过连续两次梯度PCR选择条带一致的温度作为退火温度。RAPD中的引物设计非常关键，一般RAPD的引物为9～10个碱基，理论上，引物越短，模板序列两端与引物互补的位点数量越多，扩增的PCR多态性丰富；但是，引物较短，也会引起模板互补配对稳定性低的问题。本发明引物针对植物品种鉴定的特点，采用11个碱基。在引物筛选过程中，选择扩增性强、稳定性高、多态性好的随机引物，满足用于分析基因组多态性的引物要求。

所述步骤(2)中构建图谱关系，根据引物扩增出的谱带，单独具有多态性谱带的品种被区别出来，其余品种根据谱带表现进行分组，再通过其他引物区别、分组，直到所有品种被鉴别。本发明与现有技术不同的是未采用“0-1”矩阵构建指纹图谱并进行聚类分析，通过对比谱带进行筛选，建立直观的鉴别图谱。图谱中的各葡萄品种通过引物扩增后的谱带表现进行区别或分组，建立树形图，标明相应引物和谱带。

本发明采用7个随机引物即可区别28个葡萄品种，这28个品种包括：‘高妻’、‘京亚’、‘黑元帅’、‘红富士’、‘巨玫瑰’、‘高墨’、‘龙宝’、‘夕阳红’、‘先锋’、‘黑瑰香’、‘红伊豆’、‘密红’、‘红瑞宝’、‘京超’、‘无核’、‘伊豆锦’、‘无核早红’、‘美人指’、‘信浓乐’、‘翠峰’、‘蜜汁’、‘矢富罗莎’、‘藤稔’、‘红地球’、‘巨峰’、‘绿宝石无核’、‘黑奥林’、‘黄意大利’，所述随机引物及对应退火温度如下：

S1+C 5’-GTTTCGCTCCC-3’45.1℃；

S10+A 5’-CTGCTGGGACA-3’43.6℃；

S10+T 5’-CTGCTGGGACT-3’39.3℃；

S10+G 5’-CTGCTGGGACG-3’42.1℃；

S42+G 5’-GGACCCAACCG-3’45.1℃；

S48+T 5’-GTGTGCCCCAT-3’446℃；

S1+A 5’-GTTTCGCTCCA-3’45.1℃。

所述步骤(2)中的PCR扩增为30μl的反应体系，包括10×PCRBuffer 3μl，2.5mmol/LdNTPs 2.4μl，25mmol/LMgCl²1.8μl，1.25UTaq酶，随机引物10pmol/μl1.2μl，模板DNA 40～50ng，加入ddH₂O补齐至30μl。

所述步骤(2)中PCR扩增反应95℃预变性3min，94℃变性30s，复性1min，72℃延伸2min，42个循环，72℃延伸10min。于4℃保存，在ependorf扩增以上进行扩增，扩增产物在质量比1.3％琼脂糖凝胶中电泳30～60min，溴化乙锭染色，紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。其中，模板DNA提取自未知葡萄品种，稀释至30～50ng/μl。

有益效果：本发明的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法操作方便，快速准确，7次PCR就能够将28个葡萄品种在分子水平上区分开，并在一定程度上体现了利用11个碱基引物进行RAPD分子标记在植物品种鉴定的实用性的，所得的品种鉴定图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

附图说明

图1是本发明11个随机引物鉴别区分28个葡萄品种的图谱关系示意图；

图2是利用引物S42+G区别鉴定‘高妻’、‘蜜汁’、‘无核早红’的RAPD扩增产物电泳图；

图3是利用引物S58+T区别鉴定‘高妻’、‘巨玫瑰’、‘翠峰’的RAPD扩增产物电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

一、葡萄品种材料

选取公知公用葡萄品种28个，品种名称详见表1。

表128个葡萄品种及对应编号

二、DNA的提取、PCR反应分析、引物筛选与品种鉴定

以上述28个品种的葡萄幼叶为材料，采用改进的CTAB法提取DNA。其中，通过加入酚和抗氧化剂(β-巯基乙醇)来有效去除蛋白质和酚类物质，制备的DNA无凝胶状物质、蛋白质和酚类物质，适于PCR扩增。将提取的葡萄幼叶基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，利用Eppendorf公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA溶液浓度与纯度，并将浓度稀释至30ng/μl，保存，用于PCR扩增。

PCR扩增反应采用30μl的PCR反应体系，其中模板DNA40～50ng，随机引物10pmol/μl 1.2μl，10×PCR Buffer 3μl，MgCl²1.8μl，2.5mmol/L dNTPs 2.4μl，1.25U Taq酶。在EppendorfPCR仪上进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，复性1min，72℃延伸2min，42个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。PCR扩增产物在质量比1.3％琼脂糖凝胶中电泳30～60min，0.5mg·L^-1溴化乙锭染色紫外投射仪上观察拍照。

针对葡萄的基因序列设计出40个RAPD随机引物，筛选出11个碱基组成的具有稳定性和多态性的随机引物，同时注重退火温度的选择，通过连续两次梯度PCR选择条带一致的温度作为退火温度。筛选出来的引物扩增的DNA指纹清晰，稳定性和多态性好，这11个随机引物如下所示：

S1+C 5’-GTTTCGCTCCC-3’45.1℃；

S10+A 5’-CTGCTGGGACA-3’43.6℃；

S10+T 5’-CTGCTGGGACT-3’39.3℃；

S10+G 5’-CTGCTGGGACG-3’42.1℃；

S42+G 5’-GGACCCAACCG-3’45.1℃；

S48+T 5’-GTGTGCCCCAT-3’44.6℃；

S1+A 5’-GTTTCGCTCCA-3’45.1℃。

三、DNA指纹分析和品种鉴定

利用上述得到的随机引物对未知葡萄品种进行PCR扩增，根据特异性谱带构建相应被区分品种的图谱关系，通过人工绘制植物品种鉴别图(manual cultivaridentification diagram，MCID)，将经某一引物扩增、电泳后具有相同谱带的归纳为一组，具有唯一特异性谱带的被鉴别区分出来，并标记相应引物和谱带，充分、直观地反映出11个随机引物鉴别区分28个葡萄品种的图谱关系，如图1所示。

1.首先用引物S42+G扩增出的2500bp、1500bp、750bp、660bp、580bp五条特异性谱带将48个品种分成八组(A-H)，其中有特异性谱带的用(+)表示，无特异性谱带的用(-)表示，“·”表示产生唯一特异性谱带，说明该品种被筛选出来，如表2所示：

表2引物S42+G区分48个品种分成8组

其中A组2500bp(-)，包括编号为2、5、26、27、28的五个品种；

B组890bp(+)、1500bp(-)，仅包括9号品种‘无核早红’；

C组890bp(-)、1500bp(+)，仅包括11号品种‘蜜汁’；

D组2500bp(+)、1500bp(+)、750bp(+)、660bp(+)、580bp(+)，包括编号为1、3、6、13、14、15、16、17、19、20、21、22、25的13个品种；

E组660bp(-)、580bp(-)，仅包括24号品种‘翠峰’；

F组660bp(-)，仅包括23号品种‘美人指’；

G组660bp(-)、750bp(-)，包括编号为8、12的两个品种；

H组580bp(-)，包括编号为4、7、10、18的四个品种；

利用S42+G引物即可将编号为9、11、23、24的四个品种从28个葡萄品种中单独区分出来。

2.进一步利用S1+A引物对A组和H组进行扩增，其中A组根据3000bp(+)、1500bp(+)、750bp(+)、660bp(+)特异性谱带将2号品种‘黑元帅’区分开来，根据1500bp(-)、660bp(-)、3000bp(-)、750bp(-)四条特异性谱带分别将5号品种‘先锋’、26号品种‘红地球’、27号品种‘绿宝石无核’、28号品种‘黄意大利’区分鉴定出来；H组根据1500bp(-)、1000bp(-)，1500bp(-)、1000bp(+)，1500bp(+)、1000bp(-)，1500bp(+)、1000bp(+)将4、7、10、18四个品种区分出来，如表3所示：

表3引物S1+A区分A、H两组进行筛选区分

可以看出利用S1+A引物可以将A组的5个品种和H组的4个品种从28个葡萄品种单独区分开来。利用S1+A引物以及上述特征性谱带可以鉴别以上两个小组中的的葡萄品种。

3.利用引物S10+T对G组进行扩增，根据750bp(+)，750bp(-)将8号品种‘无核8612’和12号品种‘藤稔’的两个品种区分鉴定出来，如表4所示：

表4引物S10+T对G组进行筛选区分

4.利用引物S10+A对D组进行扩增，根据3000bp，660bp，1000bp三条特异性谱带将D组13个品种分为四个子组，如表5所示：

可以看出，根据3000bp(-)将品种6、13、16、20区分到子组I，根据3000bp(+)、660bp(+)、1000bp(+)三条特异性谱带将品种1、3、14、17、19、21、25区分到子组IV，另外，15号品种‘京亚’、22号品种‘伊豆锦’分别根据660bp(-)，1000bp(-)两条特异性谱带被单独区分开来。

表5引物S10+A将D组区分为四个亚组

5.利用引物S10+G扩增上述子组I的四个品种，根据扩增结果，品种6、13、20根据1000bp(-)被分在一个小组，16号品种‘红富士’根据1000bp(+)被单独区分开来，进一步利用引物S1+C扩增6、13、20三个品种，根据1500bp(-)，750bp(-)，1500bp(+)、750bp(+)将三个品种鉴别开，如表6所示。

表6利用引物S10+G和S1+C区分鉴别子组I的4个品种

6.利用引物S48+T扩增第四亚组的七个品种，根据1500bp、750bp两条特异性谱带将其分为三个小组，根据1500bp(+)、750bp(+)将1、17、19、21四个品种分在一个小组，根据1500bp(-)、750bp(-)将14、25两个品种分在一个小组，品种3‘巨玫瑰’则根据1500bp(-)、750bp(+)被单独区分开来，如表7所示；

表7利用引物S48+T区分鉴别子组IV的7个品种

进一步利用引物S1+C对1、17、19、21四个品种进行扩增，根据750bp(+)、1500bp(+)、500bp(+)，750bp(-)，1500bp(-)，500bp(-)将四个品种单独区分开来，利用引物S10+G对14、25两个品种进行扩增，根据750bp(+)，750bp(-)将两个品种区分开来，如表8、表9所示。

表8利用引物S1+C区分鉴别

表9利用引物S10+G区分鉴别

采用以上方法，通过11个随机引物，可完全鉴定、区分出28个葡萄品种，绘制的植物品种鉴别图比现有通过聚类分析绘制的聚类树更具有直观性。解决了DNA指纹只能适用于对少数几个品种的区分以及常用的计算机分析法所获得聚类结果无法用于品种鉴别的实际情况。利用方法中的11个引物可以实现葡萄苗木的早期鉴定，对生产各栽培品种及苗圃的苗木纯度分析以及品种资源筛选具有重要帮助。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法

<130> NJAU110901

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S1+C

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<213> Artificial Sequence

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<223> S10+T

<400> 3

ctgctgggac t 11

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S10+G

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ctgctgggac g 11

<210> 5

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<212> DNA

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<400> 7

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Claims

1.一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的随机引物由11个碱基组成，随机引物筛选通过连续两次梯度PCR选择条带一致的温度作为退火温度。

3.根据权利要求1所述的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，其特征在于：所述步骤(2)中构建图谱关系，根据引物扩增出的谱带，单独具有多态性谱带的品种被区别出来，其余品种根据谱带表现进行分组，再通过其他引物区别、分组，直到所有品种被鉴别。

4.根据权利要求1或2所述的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，其特征在于：所述随机引物及对应退火温度为：

S1+C 5’-GTTTCGCTCCC-3’ 45.1℃；

S10+A 5’-CTGCTGGGACA-3’ 43.6℃；

S10+T 5’-CTGCTGGGACT-3’ 39.3℃；

S10+G 5’-CTGCTGGGACG-3’ 42.1℃；

S42+G 5’-GGACCCAACCG-3’ 45.1℃；

S48+T 5’-GTGTGCCCCAT-3’ 44.6℃；

S1+A 5’-GTTTCGCTCCA-3’ 45.1℃。

5.根据权利要求1所述的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增为30μl的反应体系，包括10×PCR Buffer 3μl，2.5mmol/L dNTPs2.4μl，25mmol/LMgCl² 1.8μl，1.25UTaq酶，随机引物10pmol/μl 1.2μl，模板DNA40～50ng。

6.根据权利要求1所述的一种利用RAPD快速区分葡萄品种的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增反应95℃预变性3min，94℃变性30s，复性1min，72℃延伸2min，42个循环，72℃延伸10min。