CN104073561A - 一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的ssr引物组合及其应用 - Google Patents

一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的ssr引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了不结球白菜SSR核心引物及其应用。本发明提供了鉴定待测不结球白菜品种的SSR引物组，由单独使用的如下21个引物对组成，本发明的实验证明，本发明的实验证明，本发明开发的不结球白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测不结球白菜品种鉴定，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷。

Description

一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的SSR引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的SSR引物组合及其应用。 
背景技术
不结球白菜起源于我国，是我国普遍栽培的蔬菜之一。近年来，不结球白菜的育种受到极大重视，生产上普遍栽培的杂交种就不下100多个。一方面，频繁使用少数骨干自交系使得新品种的遗传基础日益狭窄，加大了优异种质资源鉴定和突破性种质创新的难度；另一方面，品种的增多以及品种的相似性越来越高，这给品种管理、保护生产者和育种家的权益带来了困难。目前种质资源鉴定、品种的真实性鉴定和品种权保护的依据仍是形态指标，具有受环境影响较大、鉴定工作量大、周期长、受季节限制等劣势。利用DNA分子标记技术建立核酸指纹库是鉴定种质资源和保护新品种的有力工具。不结球白菜的核酸指纹库构建是进行遗传多样性分析、种质创新、品种质量监控和品种保护的基础。随着DNA分子标记技术的广泛应用，以微卫星序列为基础的SSR(Simple sequence repeat)分子标记技术显示了独特的优越性：SSR标记覆盖整个基因组、呈共显性遗传、多态性丰富、重复性好、操作简单及成本低廉等特点。目前公开发表的白菜SSR引物已有2000多对，这为利用SSR标记技术构建不结球白菜核酸指纹库提供了良好的前提条件。 
至今为止，有关不结球白菜SSR核酸指纹库构建的报道还不多见，尚无用于核酸指纹库构建的专用试剂盒。 
发明内容
本发明的一个目的是提供鉴定待测不结球白菜品种SSR引物组。 
本发明提供的引物组，由单独使用的如下21个引物对组成： 
BRCSSRA01-1，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA01-2，其由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA02-1，其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA02-2，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA03-1，其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示 的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA03-2，其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA04-1，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA05-1，其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA05-2，其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA06-1，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA06-2，其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA06-3，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA07-1，其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA07-2，其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA08-1，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA08-2，其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA09-1，其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA09-2，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA09-3，其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA10-1，其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA10-2，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单链DNA分子组成。 
上述的引物组中，每个所述引物对中各条引物的摩尔比为1:1。 
本发明第二个目的是提供鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂组。 
本发明提供的PCR试剂组，由单独使用的21个PCR试剂组成； 
每个PCR试剂由权利要求1或2所述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水组成； 
所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为0.5μmol/L。 
本发明的第三个目的是提供鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂盒。 
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂组。 
上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在鉴定待测不结球白菜品种的应用也是本发明保护的范围。 
上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在不结球白菜品种真伪性鉴别的应用。 
本发明第四个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测不结球白菜品种的方法。 
本发明提供的方法，包括如下步骤： 
1)构建DNA指纹图谱库； 
所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤： 
(1)利用上述的引物组中的21种引物分别46个标准品种进行SSR扩增，得到不同引物对的SSR扩增产物； 
(2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到46个标准品种不同引物对的电泳图谱； 
(3)将46个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT2.0软件构建46个标准品种DNA指纹图谱，将46个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库； 
2)重复上述1)的方法中的1)-3)，仅将46个标准品种替换为待测样本，其余步骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱； 
4)使用Mega5.0软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种； 
所述46个标准品种为表2所示的品种。 
上述方法中，所述SSR扩增的模板为待测不结球白菜的基因组DNA。 
PCR扩增程序采用Touchdown程序：94℃预变性5min；94℃变性35s，62℃复性45s(每个循环降低1℃)，72℃延伸45s，共7个循环；94℃变性35s，55℃复性45s，72℃延伸45s，共27个循环；72℃延伸6min；12℃保存。 
本发明的实验证明，本发明开发的不结球白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测不结球白菜品种鉴定，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷，其中SSR引物组合遍及白菜整个基因组且具有唯一扩增位点，代表性较强；该试剂盒的检测结果稳定可靠、操作简单快速，可以实现检测的规模化和标准化，特别是试剂盒包含的每对SSR核心引物扩增等位基因的梯度分子量标准，它可以形成商品化产品，用于不结球白菜核酸指纹库的构建、种质资源和育种材料遗传多样性分析和不结球白菜品种的真实性鉴定等。另外，SSR引物的梯度分子量标准替代了参照品种，可直接作为电泳的分子量marker。 
附图说明
图1为21对SSR核心引物扩增等位基因的梯度分子量标准 
图2为引物BrcSSRA09-2扩增部分自交系的检测结果 
图3为46份不结球白菜自交系的基因分型图 
图4为21对SSR核心引物对46份不结球白菜自交系的聚类图 
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
实施例1、不结球白菜21对SSR核心引物、分子量标准及含有其试剂盒的制备 
一、SSR核心引物的制备 
从大白菜2000多对SSR引物中经过大量的筛选试验挑选出来表1所示的21对SSR核心引物。 
表1为21对SSR核心引物序列 
二、分子量标准的确定 
46份不结球白菜高代自交系，名称如下表2所示。 
表2为46份不结球白菜自交系 
1、提取基因组DNA 
将46份不结球白菜待测品种，采用CTAB法提取待测样品的DNA：每份材料各取5株叶片进行混合，经冷冻干燥后磨成粉末称0.1g，装入2mL离心管中。每管加入800μL65℃预热的CTAB缓冲液，迅速振荡混匀，放入65℃水浴锅水浴30min，期间至少颠倒混匀一次。再向离心管中加入800μL氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇为24：1)，振荡混匀，静止5min后，12000r/min离心10min。吸600μL上清液转入另一只2mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，放于-20℃冰箱冷却20min，然后10000r/min离心5min，弃上清。用800μL75％乙醇漂洗2次，每次10000r/min离心5min，弃上清液收集沉淀，最后室温下吹干沉淀，加入200μLddH2O溶解DNA，得到各份不结球白菜的基因组DNA。 
2、PCR扩增 
用实施例1获得的21对SSR核心引物分别对46份不结球白菜待测品种进行PCR扩增，得到每份不结球白菜的21种SSR扩增产物。 
上述PCR扩增的反应体系采用20μL，其由10μl2×PCR Mix(TransGen AS111-03)、SSR引物上下游引物各1ul，每条引物在反应体系的终浓度均为0.5μmol/L、2ulDNA模板(20ng/ul)和水组成；可以作为PCR试剂。 
PCR扩增程序采用Touchdown程序：94℃预变性5min；94℃变性35s，62℃复性45s(每个循环降低1℃)，72℃延伸45s，共7个循环；94℃变性35s，55℃复性45s，72℃延伸45s，共27个循环；72℃延伸6min；12℃保存。 
得到的SSR扩增产物，将该PCR产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染，通过Caliper Lab Chip自动核酸分析仪的1kb芯片(图2)，将46份样本的21对SSR核心引物扩增产物做成梯度分子量标准如图1所示。 
3、聚类 
取出银染后的凝胶晾干后扫描成图片保存，根据每对引物扩增等位基因的梯度分子量标准读取待测样品的片段大小，缺失条带记为“？”，利用GGT2.0软件构建了46 个品种的基因分型图(图3)，即46个品种的DNA指纹图谱，由46个品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库。 
使用Mega5.0软件的UPGMA法对上述46个品种的DNA指纹图谱进行聚类作图，结果如图4所示：21对SSR核心引物组合将46份不结球白菜自交系完全区分；当遗传距离为0.35时，46份不结球白菜可划分成四类：第Ⅰ类是乌塌菜，以W字母开头；第Ⅱ类是奶白菜，以N字母开头；第Ⅲ类是黑叶白菜，以H字母开头；第Ⅳ类是青梗菜，以Q字母开头。且上述划分与白菜实际播种的是一致的。 
上述结果可以看出，21对SSR核心引物组合可以用来品种鉴定或品种真实性鉴定或种植资源鉴定，具体方法如下： 
用21对引物分别对待测样本进行PCR扩增，得到待测样本的21种PCR产物，将上述PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到图谱利用GGT2.0软件构建待测样本基因分型图，即待测样本DNA指纹图谱； 
使用Mega5.0软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和上述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种。 
可以制备一种鉴定或辅助鉴定待测不结球白菜品种的试剂盒，包括21对引物或者21种PCR试剂。 
实施例2、21对SSR核心引物在鉴定待测不结球白菜品种中的应用 
1、提取基因组DNA 
提取待测不结球白菜(已知为淮南塌地乌2号，隶属于乌塌菜类)叶片的基因组DNA。 
2、PCR扩增 
按照实施例1的二的2中的方法，用实施例1获得的21对SSR核心引物分别对待测不结球白菜进行PCR扩增，得到21种SSR扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到待测不结球白菜21种SSR扩增产物图谱。 
3、聚类 
将图谱利用GGT2.0软件构建待测样本基因分型图，即待测样本DNA指纹图谱库； 
使用Mega5.0软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和上述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种。 
结果待测样本DNA指纹图谱与DNA指纹图谱库中Brach252(淮南塌地乌2号)的 DNA指纹图谱一致，说明其为乌塌菜类中的淮南塌地乌2号。 

Claims (8)

1.鉴定待测不结球白菜品种SSR引物组，由单独使用的如下21个引物对组成： 
BRCSSRA01-1，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA01-2，其由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA02-1，其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA02-2，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA03-1，其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA03-2，其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA04-1，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA05-1，其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA05-2，其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA06-1，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA06-2，其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA06-3，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA07-1，其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA07-2，其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA08-1，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA08-2，其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA09-1，其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA09-2，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA09-3，其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA10-1，其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成； 
BRCSSRA10-2，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单链DNA分子组成。 
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：每个所述引物对中各条引物的摩尔比为1:1。 
3.鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂组，由单独使用的21个PCR试剂组成； 
每个PCR试剂由权利要求1或2所述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水组成； 
所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为0.5μmol/L。 
4.鉴定待测不结球白菜品种的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组。 
5.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所述的PCR试剂盒在鉴定待测不结球白菜品种的应用。 
6.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所述的PCR试剂盒在不结球白菜品种真伪性鉴别的应用。 
7.鉴定或辅助鉴定待测不结球白菜品种的方法，包括如下步骤： 
1)构建DNA指纹图谱库； 
所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤： 
(1)利用权利要求1或2所述的引物组中的21种引物分别46个标准品种进行SSR扩增，得到不同引物对的SSR扩增产物； 
(2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到46个标准品种不同引物对的电泳图谱； 
(3)将46个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT2.0软件构建46个标准品种DNA指纹图谱，将46个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库； 
2)重复上述1)的方法中的1)-3)，仅将46个标准品种替换为待测样本，其余步骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱； 
4)使用Mega5.0软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种； 
所述46个标准品种为表2所示的品种。 
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于： 
所述SSR扩增的模板为待测不结球白菜的基因组DNA。 
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