CN115044694B - 不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法 - Google Patents

不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了不结球白菜新夏青6号指纹图谱的建立方法，属于白菜技术领域，本发明提供了30对SSR引物组成的标记组合，利用PCR扩增技术和毛细管电泳检测技术对‘新夏青6号’品种进行检测，可在短时间内完成‘新夏青6号’品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有省时、高效、快速、准确、操作方便等优点。该不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法，可对‘新夏青6号’品种真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与遗传关系，保护了农作物品种，防止假冒伪劣产品进入市场。

Description

不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及白菜技术领域，具体为不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法。
背景技术
2018年，世界主要蔬菜生产排名前五的是中国、印度、美国、土耳其和尼日利亚，我国蔬菜总产量年均约8亿吨，约占世界的50％以上，不结球白菜，又称青菜、小白菜、油菜，原产中国，是上海及南方地区人们喜食的大众化主要绿叶蔬菜，由于其营养价值高，适应性广，生长周期短、适合周年生产，近年来，青菜不仅在北方大量引种、栽培，甚至东南亚、日、美、及欧洲一些国家也广泛引种，已经逐渐成为世界性蔬菜。
2018年起我国已经第一大农产品，蔬菜种业市值超过150亿元，占种业市值12.5％，十字花科蔬菜约占全国蔬菜面积的30％，其中不结球白菜已经跃居国内除辣椒、大白菜以外的第三大种植蔬菜，不结球白菜中的青菜，是上海绿叶蔬菜的当家品种之一，上海地区年种植面积约40万亩次，占上海地区产量的70％以上，占全年叶菜蔬菜总面积的40％以上，在长江中、下游地区青菜的生产面积也占蔬菜复种面积的30～40％，不结球白菜(青菜)品种，在全国的栽培面积已由2005年的53.33万hm2上升到2020年的133.33万hm2左右，提高了2.5倍，在蔬菜周年生产供应中发挥了及其重要作用。
随着地球热效应的影响，夏季高温持续时间不断延长，局部地区极端高温达40℃以上；冬天及早春气候变化无常，时有出现极端低温的现象，因此，在青菜的周年生产中，耐高温的抗逆性状显得格外重要。
青菜生产是传统的劳动密集型产业，近些年随着农村劳动力的转移及农民人口的老龄化等原因，用工难、用工贵的问题已成为叶菜产业发展最大的制约因素，尤其移栽及收获环节用工量大，用工成本占总成本的50％以上，对机械化作业的需求极其迫切，适合机械化采收的青菜(苗菜)品种是提升绿叶蔬菜种植规模及效益的前提和关键，对蔬菜产业转型升级、提质增效具有重要意义。
‘新夏青6号’属于杂交品种，中箕类型，20天的平均胚轴长度为4.2cm，适宜机械化采收，生长势强，叶鲜绿色，长椭圆形，叶面光滑，叶柄宽、绿色，耐热，抗病，耐湿，夏季生长迅速，商品性状优良，产量高。
现有的传统形态学和细胞学鉴定方法测试工作量大，很难做到准确而真实的鉴定“‘新夏青6号’”品种差别，为此我们提出不结球白菜“‘新夏青6号’”指纹图谱的建立方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明的实施例提供了不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法，解决了现有的传统形态学和细胞学鉴定方法测试工作量大，很难做到准确而真实地鉴别“新夏青6号”品种类型的问题，实现了与其他不结球白菜品种的区分。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明的实施例通过以下技术方案予以实现：不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法，包括引物编号-引物名称，引物编号-引物名称分别为SA000189-cnu_m139a、SA000190-nia_m086a、SA000191-nia_m098a、SA000192-nia_m138a、SA000193-cnu_m046a、SA000194-nia_m121a、SA000195-cnu_m073a、SA000196-cnu_m288a、SA000197-cnu_m316a、SA000198-cnu_m327a、SA000199-nia_m101a、SA000200-cnu_m252a、SA000201-Na10-D09、SA000202-cnu_m289a、SA000203-cnu_m442a、SA000204-cnu_m050a、SA000205-cnu_m149a、SA000206-nia_m037a、SA000207-nia_m049a、SA000208-cnu_m182a、SA000209-cnu_m295a、SA000210-cnu_m090a、SA000211-cnu_m537a、SA000212-cnu_m016a、SA000213-cnu_m530a、SA000214-cnu_m534a、SA000215-nia_m022a、SA000216-nia_m038a、SA000217-ENA2、SA000218-nia_m035a；
所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ IDNO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQNO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60所示的引物对。
一种引物组合，由以下30对特异性引物对组成，其为SEQ ID NO.1-2、SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ IDNO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ ID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ IDNO.59-60。
优选的，所述分子标记和引物组合的试剂盒。
优选的，所述分子标记和引物组合在鉴定白菜‘新夏青6号’品种中的应用。
优选的，所述分子标记和引物组合在鉴定‘新夏青6号’和‘新夏青6号’亲本中的应用。
优选的，所述引物组合对‘新夏青6号’及其亲本的DNA进行PCR扩增和利用毛细管电泳检测PCR产物。
优选的，所述‘新夏青6号’指纹图谱在鉴别‘新夏青6号’品系中的应用。
优选的，所述指纹图谱二维编码包括材料名称、材料特征性质和指纹图谱代码等信息。
优选的，所述‘新夏青6号’指纹图谱为‘新夏青6号’及其亲本和‘苏州青’的指纹图谱，图谱信息如下：
和
和
和
和
上述A指代‘新夏青6号’亲本之一19-1P-603，B指代‘苏州青’，A2指代‘新夏青6号’亲本之二19-1P-604，C指代‘新夏青6号’。
一种‘新夏青6号’品种的鉴定方法，包括如下步骤：
S1、提取待检‘新夏青6号’品种的DNA，以引物组合中的30对SSR引物对分别对检‘新夏青6号’品种的DNA进行PCR扩增；
S2、对扩增产物进行一代测序；
S3、测序的同时进行检测，根据扩增产物的相对位置，通过对不同位点的数据整合，形成‘新夏青6号’及其亲本和‘苏州青’品种的SSR指纹图谱。
(三)有益效果
本发明的实施例提出了通过采集各不同白菜叶片样本的信息，将样本引物按照固定的顺序进行编号，生成PCR产物，本发明提供的不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法，利用了SSR引物扩增产物带型间大小差异明显，形成特有的DNA指纹，能够很好的区分不同的品种。本发明的检测方法可有效的对新夏青品种进行鉴定，具有高效、准确、低成本、操作简单等优势，本发明的检测方法可以有效的对新夏青种子真伪进行监控，保护了物种，防止假冒伪劣品种进入市场。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的实施例一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的实施例保护的范围。
如图1-4所示，本发明的实施例提供了不结球白菜‘新夏青6号’指纹图谱的建立方法，包括引物编号-引物名称，引物编号-引物名称分别为SA000189-cnu_m139a、SA000190-nia_m086a、SA000191-nia_m098a、SA000192-nia_m138a、SA000193-cnu_m046a、SA000194-nia_m121a、SA000195-cnu_m073a、SA000196-cnu_m288a、SA000197-cnu_m316a、SA000198-cnu_m327a、SA000199-nia_m101a、SA000200-cnu_m252a、SA000201-Na10-D09、SA000202-cnu_m289a、SA000203-cnu_m442a、SA000204-cnu_m050a、SA000205-cnu_m149a、SA000206-nia_m037a、SA000207-nia_m049a、SA000208-cnu_m182a、SA000209-cnu_m295a、SA000210-cnu_m090a、SA000211-cnu_m537a、SA000212-cnu_m016a、SA000213-cnu_m530a、SA000214-cnu_m534a、SA000215-nia_m022a、SA000216-nia_m038a、SA000217-ENA2、SA000218-nia_m035a；
分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ ID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60所示的引物对，获取‘新夏青6号’及其亲本的分子标记。
一种引物组合，由以下30对特异性引物对组成，其为SEQ ID NO.1-2、SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ IDNO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ ID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ IDNO.59-60，详细指出引物组合信息。
实施例1
分子标记和引物组合的试剂盒，通过试剂盒检测PCR扩增产物，如下所示：
扩增产物读带为无时，显性标记时记录为0；扩增条件为有时，显性标记记录为1；条带较弱或无法判断基因型时记录为是否正确，无效条带记录为--；共显性标记中纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，扩增产物读带为纯合亲本1，其中X为该位点等位变异的大小；纯合位点的等位变异大小数据记录为Y/Y，扩增产物读带为纯合亲本2，Y为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，扩增产物为双亲带型，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；条带较弱或无法判断基因型时记录为是否正确，无效等位变异的大小记录为--；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；通过对不同位点的数据整合，形成新夏青及其亲本和普通绿叶新夏青品种的SSR指纹图谱。
分子标记和引物组合在鉴定白菜‘新夏青6号’品种中的应用，其中，PCR扩增方法为：
反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火40s，72℃延伸45s，每个循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温；
反应体系：25μL反应体系体积，含每种dNTP0.25mmol/L，正向引物和反向引物各0.4μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl21.5mmol/L，样品DNA10-40ng。
分子标记和引物组合在鉴定‘新夏青6号’和‘新夏青6号’亲本中的应用。
引物组合对‘新夏青6号’及其亲本的DNA进行PCR扩增和利用毛细管电泳检测PCR产物，采用荧光毛细管电泳检测，为引物加入荧光标记，详细情况如下：
/>
‘新夏青6号’指纹图谱在鉴别‘新夏青6号’品系中的应用。
指纹图谱二维编码包括材料名称、材料特征性质和指纹图谱代码等信息。
‘新夏青6号’指纹图谱为‘新夏青6号’及其亲本和‘苏州青’的指纹图谱，图谱信息如下：
和
和
和
/>
和
上述A指代‘新夏青6号’亲本之一19-1P-603，B指代‘苏州青’，A2指代‘新夏青6号’亲本之二19-1P-604，C指代‘新夏青6号’。
实施例1中，获取‘新夏青6号’及其亲本的指纹图谱序列，并将不同品种的白菜互相对照，分析其不同之处，利用了SSR引物扩增产物带型间大小差异明显，形成特有的DNA指纹，能够很好的区分不同的品种。本发明的检测方法可有效的对‘新夏青6号’品种进行鉴定，具有高效、准确、低成本、操作简单等优势。
实施例2
一种‘新夏青6号’品种的鉴定方法，包括如下步骤：
S1、提取待检‘新夏青6号’品种的DNA，以引物组合中的30对SSR引物对分别对待检‘新夏青6号’品种的DNA进行PCR扩增；
S2、对扩增产物进行一代测序；
S3、测序的同时进行检测，根据扩增产物的相对位置，通过对不同位点的数据整合，形成‘新夏青6号’及其亲本和‘苏州青’品种的SSR指纹图谱，扩增产物读带为无时，显性标记时记录为0；扩增条件为有时，显性标记记录为1；条带较弱或无法判断基因型时记录为是否正确，无效条带记录为--；共显性标记中纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，扩增产物读带为纯合亲本1，其中X为该位点等位变异的大小；纯合位点的等位变异大小数据记录为Y/Y，扩增产物读带为纯合亲本2，Y为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，扩增产物为双亲带型，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；条带较弱或无法判断基因型时记录为是否正确，无效等位变异的大小记录为--；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段。
本实施例2中，本发明的检测方法可以有效的对‘新夏青6号’及其亲本种子真伪进行监控，保护了物种，防止假冒伪劣品种进入市场。

Claims (1)

1.一种不结球白菜‘新夏青6号’品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取待检‘新夏青6号’品种的DNA，以引物组合中的30对SSR引物对分别对待检‘新夏青6号’品种的DNA进行PCR扩增；S2、对扩增产物进行一代测序；S3、测序的同时进行检测，根据扩增产物的相对位置，通过对不同位点的数据整合，形成‘新夏青6号’及其亲本和‘苏州青’品种的SSR指纹图谱，扩增产物读带为无时，显性标记时记录为0；扩增条件为有时，显性标记记录为1；条带较弱或无法判断基因型时记录为是否正确，无效条带记录为--；共显性标记中纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，扩增产物读带为纯合亲本1，其中X为该位点等位变异的大小；纯合位点的等位变异大小数据记录为Y/Y，扩增产物读带为纯合亲本2，Y为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，扩增产物为双亲带型，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；条带较弱或无法判断基因型时记录为是否正确，无效等位变异的大小记录为--；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；其中，还包括引物编号-引物名称，引物编号-引物名称分别为SA000189-cnu_m139a、SA000190-nia_m086a、SA000191-nia_m098a、 SA000192-nia_m138a、SA000193-cnu_m046a、SA000194-nia_m121a、 SA000195-cnu_m073a、SA000196-cnu_m288a、SA000197-cnu_m316a、SA000198-cnu_m327a、SA000199-nia_m101a、SA000200-cnu_m252a、SA000201-Na10-D09、SA000202-cnu_m289a、SA000203-cnu_m442a、SA000204-cnu_m050a、SA000205-cnu_m149a、SA000206-nia_m037a、SA000207-nia_m049a、SA000208-cnu_m182a、SA000209-cnu_m295a、SA000210-cnu_m090a、SA000211-cnu_m537a、SA000212-cnu_m016a、SA000213-cnu_m530a、SA000214-cnu_m534a、SA000215-nia_m022a、SA000216-nia_m038a、SA000217-ENA2、SA000218-nia_m035a；
引物组合由以下30对特异性引物对组成，其为SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ IDNO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60；
所述‘新夏青6号’及其亲本和‘苏州青’的指纹图谱如下：
和
和
和
和
上述A1指代‘新夏青6号’亲本之一19-1P-603，B指代‘苏州青’，A2指代‘新夏青6号’亲本之二19-1P-604，C指代‘新夏青6号’。
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