CN103502447A - 甘蔗属植物的黑穗病抵抗性相关标志物及其利用 - Google Patents

甘蔗属植物的黑穗病抵抗性相关标志物及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明提供在甘蔗属植物的量的性状中与黑穗病抵抗性相关的标志物。甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其包含选自甘蔗的染色体中的由序列号1所示的碱基序列和序列号14所示的碱基序列所夹的区域及其他区域中的连续的核酸区域。

Description

甘蔗属植物的黑穗病抵抗性相关标志物及其利用
技术领域
本发明涉及能够筛选对黑穗病显示抵抗性的甘蔗属植物系统的黑穗病抵抗性相关标志物及其利用方法。
背景技术
甘蔗除了作为砂糖的原料、酒类原料等为了食用而栽培之外，还在包含作为生物燃料原料的利用的各种产业领域被利用。在这样的状况下，有开发具有所需的特性(例如，糖含量、生长力的增强、新芽形成能力、耐病性和虫害抵抗性、耐寒性、叶长的增大、叶面积的增大、茎长的增大等)的甘蔗属植物的新品种的需要。
一般地，作为植物品种·系统的识别，有以下3种方法：比较特性数据的“特性比较”、在同一条件下栽培而比较的“比较栽培”、分析DNA的“DNA分析”。利用特性比较和比较栽培的系统识别存在由于栽培条件的不同而精度降低、需要巨大的生产成本的长时间的农场调查等大量问题。特别是，甘蔗与稻、玉米等其他禾本科作物相比，植物体极大，利用农场调查的系统识别的实施困难。
另外，为了识别针对特定病害的抵抗性品种，将甘蔗长时间栽培后，进行接种病原微生物的试验，然后，通过观察病斑等来收集抵抗性数据。但是，为了进行该试验，必须确实地防止病原微生物对外部环境的传播，需要大规模专用温室和/或专用农场、与外部的隔离设施等设备。进而，为了制作甘蔗的新品种，首先，通过杂交而制作数万种的杂交种，从中进行由种子发芽而生长的筛选，进而阶段性地筛选出优良的系统，最终获得具有所需的特性的2～3种新品种。这样，为了制作甘蔗的新品种，需要栽培·评价非常多的系统，准备如上所述的温室、农场需要大量的工夫。
因此，要求开发使用存在于基因组中的标志物来识别显示病害抵抗性的甘蔗系统的方法。特别是，在制作甘蔗中的新品种时，如果能够对于各种特性使用优异的标志物，则可以回避如上所述的甘蔗所特有的诸问题，成为非常有效的工具。然而，甘蔗属植物由于高倍体性而染色体数较多(约100～130)，因而标志物技术开发缓慢。对于甘蔗，虽然在USDA有关于使用SSR标志物的基因型确定的报告(非专利文献1)，但由于标志物数和来自各标志物的多态性数少而精度低、适用范围限于美国、澳大利亚品种，因此不能在日本国内和台湾、印度等的主要品种和有用的遗传资源的系统识别中利用。
另外，非专利文献2启示了通过增加标志物数、比较、验证各个标志物的特性关系来制作甘蔗中的基因图谱的可能性。然而，非专利文献2中没有公开足够数量的标志物，也没有发现与目的特性连锁的标志物。
另一方面，作为与病害抵抗性相关的标志物，如专利文献1所示，已知甜菜中的黑根病抵抗性相关标志物。另外，如专利文献2所示，在玉米中开发了利用与目的性状连锁的标志物来筛选品种的技术。
另一方面，甘蔗的黑穗病，病原微生物的感染力强，一旦发病则感染在整个农场扩大。患了黑穗病的甘蔗不但不能作为制糖用原料利用，而且还会枯死。因此，黑穗病的发生会引起次年以后的大幅减收。黑穗病的受害在巴西、美国、澳大利亚、中国、印度尼西亚等28个以上的国家有报告。黑穗病的防除方法有种植时的杀菌处理，但效果仅限于初期生长时。因此，要求育成赋予了黑穗病的抵抗性的甘蔗品种。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Maydica48(2003)319-329“Molecular genotyping ofsugarcane clones with microsatellite DNA markers”
非专利文献2：Nathalie Piperidis et al.,Molecular Breeding,2008,Vol21,233-247
专利文献
专利文献1：WO2007/125958
专利文献2：日本特开2010-516236号公报
发明内容
发明要解决的课题
因而，本发明的目的是提供在甘蔗的量的性状中与黑穗病抵抗性相关的标志物。
用于解决课题的方法
本发明者们为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果，准备甘蔗属植物中的多个标志物，通过杂交后代系统中的量的性状与标志物的连锁分析，发现了与黑穗病抵抗性这样的量的性状连锁的标志物，从而完成了本发明。
本发明包含以下(1)～(6)。
(1)甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其包含选自甘蔗的染色体中的由序列号1所示的碱基序列和序列号14所示的碱基序列所夹的区域、由序列号15所示的碱基序列和序列号22所示的碱基序列所夹的区域、由序列号23所示的碱基序列和序列号32所示的碱基序列所夹的区域、由序列号33所示的碱基序列和序列号51所示的碱基序列所夹的区域、由序列号52所示的碱基序列和序列号62所示的碱基序列所夹的区域、由序列号63所示的碱基序列和序列号72所示的碱基序列所夹的区域、或由序列号73所示的碱基序列和序列号85所示的碱基序列所夹的区域中的连续的核酸区域。
(2)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其特征在于，所述核酸区域包含选自由序列号1～85组成的群组中的任一碱基序列或该碱基序列的一部分。
(3)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其特征在于，所述核酸区域位于甘蔗的染色体中的由序列号5所示的碱基序列和序列号9所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号18所示的碱基序列和序列号22所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号25所示的碱基序列和序列号32所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号33所示的碱基序列和序列号42所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号57所示的碱基序列和序列号59所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号64所示的碱基序列和序列号66所示的碱基序列所夹入的区域、或由序列号72所示的碱基序列和序列号80所示的碱基序列所夹入的区域中。
(4)黑穗病抵抗性提高了的甘蔗系统的制造方法，其包括以下工序，
提取工序：提取至少一方亲本是甘蔗属植物的后代植物的染色体和/或该亲本的染色体，和
测定工序：测定上述(1)～(3)的任一项所述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物在上述所得的染色体中的存在或不存在。
(5)根据(4)所述的甘蔗系统的制造方法，其特征在于，在所述测定工序中，使用具备与所述甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物对应的探针的DNA芯片。
(6)根据(4)所述的甘蔗系统的制造方法，其特征在于，所述后代植物是种子或幼苗，由该种子或幼苗提取染色体。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-101050号和日本专利申请2012-94995号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
根据本发明，可以提供在甘蔗中的量的性状中与黑穗病抵抗性连锁的新的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物。通过利用本发明的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，可以检定甘蔗的杂交系统中的黑穗病抵抗性。由此，可以非常低成本地识别具有黑穗病抵抗性提高了的特性的甘蔗系统。
附图说明
图1是显示在获得甘蔗染色体的标志物时使用的DNA微阵列的制造流程的示意图。
图2是显示使用DNA微阵列的信号检出的工序的示意图。
图3是显示对于实施例中使用的甘蔗品种·系统群于2010年6月23日调查的黑穗病抵抗性数据的特性图。
图4是显示对于实施例中使用的甘蔗品种·系统群于2010年7月21日调查的黑穗病抵抗性数据的特性图。
图5是显示对于实施例中使用的甘蔗品种·系统群于2010年8月18日调查的黑穗病抵抗性数据的特性图。
图6是显示对于实施例中使用的甘蔗品种·系统群于2010年9月2日调查的黑穗病抵抗性数据的特性图。
图7是显示关于黑穗病抵抗性的QTL分析的结果(NiF8中的第5连锁群)的特性图。
图8是显示关于黑穗病抵抗性的QTL分析的结果(NiF8中的第17连锁群)的特性图。
图9是显示关于黑穗病抵抗性的QTL分析的结果(NiF8中的第40连锁群)的特性图。
图10是显示关于黑穗病抵抗性的QTL分析的结果(Ni9中的第1连锁群)的特性图。
图11是显示关于黑穗病抵抗性的QTL分析的结果(Ni9中的第13连锁群)的特性图。
图12是显示关于黑穗病抵抗性的QTL分析的结果(Ni9中的第14连锁群)的特性图。
图13是显示各系统中的N802870的信号值的特性图。
图14是显示各系统中的N827136的信号值的特性图。
图15是显示各系统中的N812680的信号值的特性图。
图16是显示各系统中的N916081的信号值的特性图。
图17是显示各系统中的N919839的信号值的特性图。
图18是显示各系统中的N918761的信号值的特性图。
图19是显示各系统中的N901160的信号值的特性图。
具体实施方式
以下，对于本发明的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物及其利用方法、特别是使用甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的甘蔗系统的制造方法进行说明。
＜甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物＞
本发明的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物是存在于甘蔗的染色体上的特定区域，与甘蔗的黑穗病抵抗性这样的性状的应答基因(群)连锁，具有能够辨别甘蔗黑穗病抵抗性这样的性状的功能。即，在使用已知的甘蔗系统得到的后代系统中，可以通过确认甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的存在或不存在，来判断是具有黑穗病抵抗性提高这样的性状的系统。此外，在本发明中，黑穗病是指由于黑粉菌属(Ustilago)的微生物感染而形成病斑的疾病。作为黑粉菌属的微生物，可列举甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea)作为一例。
另外，甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物是包含与黑穗病抵抗性提高的性状连锁的标志物、和与黑穗病抵抗性降低的性状连锁的标志物两者的含义。例如，在特定的甘蔗品种中，如果存在前者的标志物，则可判定为黑穗病抵抗性提高了的品种。进而，在特定的甘蔗品种中，存在前者的标志物、且不存在后者的标志物的情况下，可以更高精度地判断为黑穗病抵抗性提高了的品种。此外，在特定的甘蔗品种中，也可以仅凭后者的标志物不存在而判断为黑穗病抵抗性提高了的品种。
这里，甘蔗是指属于禾本科甘蔗属的植物。另外，甘蔗是包含所谓高贵种(学名：甘蔗(Saccharum officinarum))和野生种(学名：甜根子草(Saccharum spontaneum))、细秆甘蔗种(Saccharum barberi)、竹蔗种(Saccharum sinense)、作为高贵种的祖先种的大茎野生种(Saccharumrobustum)的任一者的含义。作为已知的甘蔗品种·系统不特别限定，是包含日本国内可使用的所有品种·系统、日本以外的国家使用的品种·系统等的含义。例如，作为甘蔗的日本国内育成品种不特别限定，可列举Ni1、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTn10、Ni11、Ni12、Ni14、Ni15、Ni16、Ni17、NiTn19、NiTn20、Ni22和Ni23等。另外，作为甘蔗日本国内主要品种不特别限定，可列举NiF8、Ni9、NiTn10和Ni15等。进而，作为甘蔗日本国内引入主要品种不特别限定，可列举F177、Nco310和F172等。
另外，后代系统既可以是通过母本和父本两方都是甘蔗品种·系统的同种杂交而得的系统，也可以是任一方是甘蔗品种·系统、另一方是亲缘的斑茅(Erianthus arundinaceus)那样的杂交系统。另外，后代系统可以通过所谓回交来获得。
甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物是使用由甘蔗的染色体独自获得的包含3004个和4569个标志物的基因连锁图谱、以及甘蔗黑穗病抵抗性数据通过QTL(数量性状位点，Quantitative Trait Loci)分析而新鉴定的。此外，甘蔗黑穗病抵抗性被认为与多个基因相关，是采取连续分布的量的性状。即，甘蔗黑穗病抵抗性基于采取连续分布的对黑穗病的罹患率来评价。QTL分析使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten,and Z.-B.Zeng(2010).Windows QTL Cartographer2.5.DepartmentofStatistics,North Carolina State University,Raleigh,NC)，应用Compositeinterval mapping(复合区间作图法，CIM)法。
具体地，通过上述的QTL分析，发现了7个优势对数分值(LOD score)为规定的阈值(例如2.5)以上的包含在上述基因连锁图谱中的区域。即，特定了包含该区域的约18.7cM(分摩尔根)区域、包含该区域的约39.2cM区域、包含该区域的约19.2cM区域、包含该区域的约32.0cM区域、包含该区域的约39.5cM区域、包含该区域的约53.4cM区域、和包含该区域的约38.0cM区域的7个区域。这里，“摩尔根(M)”是相对地显示染色体上的基因间的距离的单位，是将交叉值作为百分数而得的值。在甘蔗的染色体上，1cM相当于约2000kb。此外，显示该峰位置或其附近存在用于提高黑穗病抵抗性的性状的应答基因(群)。
上述18.7cM的区域是依次包含上述标志物中表1所示的14种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性降低的性状连锁的区域。
表1
Figure BDA0000403018440000081
上述39.2cM的区域是依次包含上述标志物中表2所示的8种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性提高的性状连锁的区域。
表2
Figure BDA0000403018440000091
上述19.2cM的区域是依次包含上述标志物中表3所示的10种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性降低的性状连锁的区域。
表3
Figure BDA0000403018440000092
上述32.0cM的区域是依次包含上述标志物中表4所示的19种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性提高的性状连锁的区域。
表4
Figure BDA0000403018440000101
上述39.5cM的区域是依次包含上述标志物中表5所示的11种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性降低的性状连锁的区域。
表5
Figure BDA0000403018440000111
上述53.4cM的区域是依次包含上述标志物中表6所示的10种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性降低的性状连锁的区域。
表6
上述38.0cM的区域是依次包含上述标志物中表7所示的13种标志物的区域，是与黑穗病抵抗性提高的性状连锁的区域。
表7
Figure BDA0000403018440000131
此外，在表1～7中，连锁群是指对于QTL分析中所特定的多个连锁群分别赋予的编号。表1～7中，标志物名是赋予本发明中独自获得的标志物的名称。表1～7中，信号阈值是用于判断标志物的有无的阈值。
另外，18.7cM的区域所包含的峰，存在于由序列号5所示的碱基序列组成的标志物(N804607)和由序列号9所示的碱基序列组成的标志物(N815502)所夹入的区域。39.2cM的区域所包含的峰，存在于由序列号18所示的碱基序列组成的标志物(N803928)和由序列号22所示的碱基序列组成的标志物(N826906)所夹入的区域。19.2cM的区域所包含的峰，存在于由序列号25所示的碱基序列组成的标志物(N829378)和由序列号32所示的碱基序列组成的标志物(N821999)所夹入的区域。32.0cM的区域所包含的峰，存在于由序列号33所示的碱基序列组成的标志物(N915070)和由序列号42所示的碱基序列组成的标志物(N918161)所夹入的区域。39.5cM的区域所包含的峰，存在于由序列号57所示的碱基序列组成的标志物(N911103)和由序列号59所示的碱基序列组成的标志物(N918344)所夹入的区域。53.4cM的区域所包含的峰，存在于由序列号64所示的碱基序列组成的标志物(N918761)和由序列号66所示的碱基序列组成的标志物(N900663)所夹入的区域。38.0cM的区域所包含的峰，存在于由序列号73所示的碱基序列组成的标志物(N901524)和由序列号80所示的碱基序列组成的标志物(N915180)所夹入的区域。
可以使用选自包含表1～7所示的标志物的7个区域的连续的核酸区域作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物。这里，核酸区域是指包含与存在于甘蔗的染色体中的其他区域的同一性为95％以下、优选为90％以下、更优选为80％以下、最优选为70％以下那样的碱基序列的区域。如果成为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的核酸区域与其他区域的同一性在上述范围，则可以按照常规方法特异性地检出该核酸区域。这里，同一性的值例如可以使用BLAST使用默认参数计算出。
另外，成为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的核酸区域的碱基长至少可以为8个碱基长以上，优选为15个碱基长以上，更优选为20个以上，最优选为30个碱基长。如果成为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的核酸区域的碱基长为上述范围，则可以按照常规方法特异性地检出该核酸区域。
特别是，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在18.7cM的区域所含的14种标志物中，优选选自由序列号5所示的碱基序列和序列号9所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号5所示的碱基序列和序列号9所示的碱基序列所夹入的区域。另外，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在39.2cM的区域所含的8种标志物中，优选选自由序列号18所示的碱基序列和序列号22所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号18所示的碱基序列和序列号22所示的碱基序列所夹入的区域。进而，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在19.2cM的区域所含的10种标志物中，优选选自由序列号25所示的碱基序列和序列号32所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号25所示的碱基序列和序列号30所示的碱基序列所夹入的区域。进而另外，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在32.0cM的区域所含的19种标志物中，优选选自由序列号33所示的碱基序列和序列号42所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号33所示的碱基序列和序列号42所示的碱基序列所夹入的区域。进而另外，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在39.5cM的区域所含的11种标志物中，优选选自由序列号57所示的碱基序列和序列号59所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号57所示的碱基序列和序列号59所示的碱基序列所夹入的区域。进而另外，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在53.4cM的区域所含的10种标志物中，优选选自由序列号64所示的碱基序列和序列号66所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号64所示的碱基序列和序列号66所示的碱基序列所夹入的区域。进而另外，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，在38.0cM的区域所含的13种标志物中，优选选自由序列号73所示的碱基序列和序列号80所示的碱基序列所夹入的区域。因为上述峰存在于由序列号73所示的碱基序列和序列号80所示的碱基序列所夹入的区域。
另外，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，还可以是包含选自上述表1～7所示的85种标志物中的1种标志物的核酸区域。例如，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，优选使用包含与18.7cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号6所示的碱基序列组成的标志物(N802870)的核酸区域、包含与39.2cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号22所示的碱基序列组成的标志物(N826906)的核酸区域、包含与19.2cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号32所示的碱基序列组成的标志物(N821999)的核酸区域、包含与32.0cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号35所示的碱基序列组成的标志物(N916186)的核酸区域、包含与39.5cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号58所示的碱基序列组成的标志物(N918508)的核酸区域、包含与53.4cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号65所示的碱基序列组成的标志物(N913735)的核酸区域、包含与38.0cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号74所示的碱基序列组成的标志物(N901163)的核酸区域。此时，包含标志物的核酸区域的碱基序列，可以使用基于该标志物的碱基序列设计的引物通过反向PCR等邻接序列获得法来特定。
进而，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，可以使用上述85种标志物本身。即，可以使用这85种标志物中的1种以上的标志物作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物。例如，作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，优选使用与18.7cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号6所示的碱基序列组成的标志物(N802870)、与39.2cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号22所示的碱基序列组成的标志物(N826906)、与19.2cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号32所示的碱基序列组成的标志物(N821999)、与32.0cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号35所示的碱基序列组成的标志物(N916186)、与39.5cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号58所示的碱基序列组成的标志物(N918508)、与53.4cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号65所示的碱基序列组成的标志物(N913735)、与38.0cM的区域所包含的峰的位置最近的由序列号74所示的碱基序列组成的标志物(N901163)。
＜甘蔗中的标志物的鉴定＞
在本发明中，如上所述，从由甘蔗的染色体独自获得的3004个和4569个标志物中特定甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物。这里，对于这3004个和4569个标志物进行说明。鉴定该标志物时，可以使用应用了日本特愿2009-283430号所公开的方法的DNA微阵列。
具体地，对由甘蔗的染色体独自获得的3004个和4569个标志物，使用具有通过日本特愿2009-283430号所公开的方法设计的探针的DNA微阵列。探针的设计方法如图1所示，首先，从甘蔗提取基因组DNA(工序1a)。接着，将提取的基因组DNA用1或多个限制性酶消化(工序1b)。此外，在图1所示的例子中，依次使用限制性酶A和限制性酶B2种限制性酶消化基因组DNA。这里，作为限制性酶不特别限定，例如，可以使用PstI、EcoRI、HindIII、BstNI、HpaII、HaeIII等。特别作为限制性酶，可以考虑识别序列的出现频率等来适宜选择，以在完全消化基因组DNA时形成20～10000个碱基长的基因组DNA片段。另外，在使用多个限制性酶的情况下，优选使用全部限制性酶后的基因组DNA片段成为200～6000个碱基长。进而，在使用多个限制性酶的情况下，对供处理的限制性酶的顺序不特别限定，另外，在处理条件(溶液组成和/或温度等)相同的情况下，可以将多个限制性酶在同一反应体系中使用。即，在图1所示的例子中，依次使用限制性酶A和限制性酶B消化基因组DNA，但既可以将限制性酶A和限制性酶B在相同反应体系中同时使用来消化基因组DNA，也可以依次使用限制性酶B和限制性酶A来消化基因组DNA。进而，使用的限制性酶的数可以为3以上。
接下来，对限制性酶处理后的基因组DNA片段结合衔接物(adaptor)(工序1c)。这里，衔接物只要能够结合在通过上述的限制性酶处理而得的基因组DNA片段的两端就不特别限定。作为衔接物，可以使用例如，具有与通过限制性酶处理而在基因组DNA的两末端形成的突出末端(粘端)互补的单链，并具有在详细如后述的扩增处理时使用的引物能够杂交的引物结合序列的片段。另外，作为衔接物，还可以使用具有与上述突出末端(粘端)互补的单链、并具有用于在克隆时插入载体的限制性酶识别部位的片段。
另外，在使用多个限制性酶消化基因组DNA的情况下，可以准备与各限制性酶对应的多个衔接物来使用。即，可以使用具有与在用多个限制性酶消化基因组DNA时所生成的多个种类的突出末端分别互补的单链的多个衔接物。此时，与多个限制性酶对应的多个衔接物，可以以共同的引物能够杂交的方式具有共同的引物结合序列，也可以以分别不同的引物能够杂交的方式具有不同的引物结合序列。
进而，在使用多个限制性酶消化基因组DNA的情况下，作为衔接物，可以准备与选自所使用的多个限制性酶中的1种限制性酶、或所使用的限制性酶中的一分限制性酶对应的衔接物而使用。
接下来，对在两末端添加了衔接物的基因组DNA片段进行扩增(工序1d)。在使用具有引物结合序列的衔接物的情况下，可以通过使用能够与该引物结合序列杂交的引物来扩增上述基因组DNA片段。或者，可以利用衔接物序列将添加了衔接物的基因组DNA片段克隆到载体中，使用能够与该载体中的规定的区域杂交的引物来扩增基因组DNA片段。此外，作为使用了引物的基因组DNA片段的扩增反应，可以使用PCR作为一例。
另外，在使用多个限制性酶消化基因组DNA的同时，将与各限制性酶对应的多个衔接物连接于基因组DNA片段的情况下，通过使用了多个限制性酶的处理而得的基因组DNA片段全部与衔接物连接。这种情况下，通过使用衔接物所含的引物结合序列进行核酸扩增反应，可以扩增所得的全部基因组DNA片段。
或者，在使用多个限制性酶消化基因组DNA的同时，将与选自所使用的多个限制性酶中的1种限制性酶、或所使用的限制性酶中的一部分限制性酶对应的衔接物连接于基因组DNA片段的情况下，可以仅扩增所得的基因组DNA片段中两末端具有所选的限制性酶的识别序列的基因组DNA片段。
接下来，确定所扩增的基因组DNA片段的碱基序列(工序1e)，特定具有短于该基因组DNA片段的碱基长、覆盖基因组DNA片段内的至少一部分的1或多个区域，将所特定的1或多个区域设计为甘蔗中的探针(工序1f)。对确定基因组DNA片段的碱基序列的方法不特别限定，可以使用应用桑格法(Sanger法)等的利用DNA测序仪的现有公知的方法。这里，作为设计的区域，如上所述，例如为20～100个碱基长，优选为30～90个碱基长，更优选为50～75个碱基长。
如以上那样，使用从甘蔗提取的基因组DNA设计多个探针，基于所设计的探针的碱基序列，在载体上合成具有目的碱基序列的寡核苷酸，从而可以制作DNA微阵列。通过使用这样制作的DNA微阵列，可以鉴定包含上述的序列号1～85所示的85种甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物在内的3004个和4569个标志物。
更具体地，本发明者们对于已知的甘蔗品种NiF8、Ni9和它们的杂交后代系统(191系统)，使用上述的DNA微阵列获得了信号数据。然后，由所得的信号数据获得基因型数据，以该基因型数据为基础，使用遗传图谱制成软件AntMap(Iwata H,Ninomiya S(2006)AntMap:constructinggenetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm.Breed Sci56:371-378)，通过遗传距离计算式Kosambi计算出染色体中的标志物的位置信息。进而，以所获得的标志物的位置信息为基础，通过Mapmaker/EXPver.3.0(A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report,Third Edition,January,1993)制成遗传图谱数据片。其结果鉴定了包含上述的序列号1～85所示的85种甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物在内的3004个和4569个标志物。
＜甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的利用＞
通过利用甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，可以对于后代系统等黑穗病抵抗性的表型未知的甘蔗系统判断是否是显示黑穗病抵抗性提高这样的表型的系统。这里，所谓利用甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，是包含利用具有与该标志物对应的探针的DNA微阵列的方式的含义。与甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物对应的探针，是指能够与如上所述定义的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物在严格条件下特异性地杂交的寡核苷酸。这样的寡核苷酸，例如，可以设计成如上所述定义的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的碱基序列或其互补链的至少连续的10个碱基、15个碱基、20个碱基、25个碱基、30个碱基、35个碱基、40个碱基、45个碱基、50个碱基或这以上的碱基长的部分区域或全区域。此外，作为具有该探针的DNA微阵列，可以是以玻璃、硅氧烷等的平面基板为载体的微阵列，以微珠为载体的珠阵列，或者在中空纤维的内壁固定探针的3维微阵列等任何类型的微阵列。
通过使用如上制作的DNA微阵列，可以对于以后代系统等为代表的黑穗病抵抗性的表型未知的甘蔗系统判断是否是显示黑穗病抵抗性提高这样的表型的系统。此外，除了上述的使用DNA微阵列的方法以外，也可以使用现有公知的手法检出上述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，从而对于黑穗病抵抗性的表型未知的甘蔗系统判断是否是具有黑穗病抵抗性提高这样的性状的系统。
对使用DNA微阵列的方法进行更详细的说明。如图2所示，首先从供试甘蔗提取基因组DNA。该供试甘蔗是后代系统等黑穗病抵抗性的表型未知的甘蔗系统和/或制作后代系统时使用的亲本的甘蔗系统，是成为判定是否具有黑穗病抵抗性提高的性状的对象的甘蔗系统。此外，也可以以除了甘蔗以外的植物、例如高粱属、蔗茅属等禾本科植物作为供试植物，评价这些供试植物中的黑穗病抵抗性。
接下来，将提取的基因组DNA用制作DNA微阵列时使用的限制性酶消化而制备多个基因组DNA片段。接下来，将所得的基因组DNA片段与制作DNA微阵列时使用的衔接物连接。接下来，将两末端添加了衔接物的基因组DNA片段使用制作DNA微阵列时使用的引物进行扩增。由此，可以扩增与制作DNA微阵列时的工序1d中扩增的基因组DNA片段对应的、来源于供试甘蔗的基因组DNA片段。
在该工序中，也可以选择性地扩增添加了衔接物的基因组DNA片段中规定的基因组DNA片段。例如，在使用与多个限制性酶对应的多个衔接物的情况下，可以选择性地扩增添加了特定的衔接物的基因组DNA片段。另外，在用多个限制性酶消化基因组DNA的情况下，可以通过仅在所得的基因组DNA片段中具有与规定的限制性酶对应的突出末端的基因组DNA片段上添加衔接物，从而选择性地扩增添加了衔接物的基因组DNA片段。这样，可以将规定的基因组DNA片段通过选择性地扩增而浓缩。
接下来，在所扩增的基因组DNA片段上添加标记。作为标记，可以使用现有公知的任何物质。作为标记，可以使用例如荧光分子、色素分子、放射性分子等。此外，本工序可以通过在扩增基因组DNA片段的工序中使用具有标记的核苷酸而省略。这是因为，通过在上述工序中使用具有标记的核苷酸来扩增基因组DNA片段，所扩增的DNA片段被标记化。
接下来，使具有标记的基因组DNA片段在规定的条件下与DNA微阵列接触，从而使固定于DNA微阵列的探针与具有标记的基因组DNA片段杂交。此时，杂交时优选制成高严格条件。通过制成这样的高严格条件，可以更高精度地判定供试甘蔗中是否存在甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物。此外，严格条件可以通过反应温度和盐浓度来调节。即，通过更高温来成为更高严格条件，另外通过更低盐浓度来成为更高严格条件。例如，在使用50～75个碱基长的探针的情况下，作为杂交条件，可以通过40～44℃、0.21SDS、6×SSC的条件来制成更高严格条件。
另外，探针与具有标记的基因组DNA片段的杂交可以基于标记来检出。即，具有上述的标记的基因组DNA片段与探针的杂交反应后，洗净未反应的基因组DNA片段等，然后，观察与探针特异性地杂交的基因组DNA片段的标记。例如，在标记是荧光物质的情况下，检出其荧光波长，如果标记是色素分子，则检出其色素波长。更具体地，可以使用在通常的DNA微阵列分析中使用的荧光检出装置、图像分析仪等装置。
如以上那样，通过使用上述的DNA微阵列，可以判断供试甘蔗是否具有上述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物。这里，如上所述，甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物中存在与黑穗病抵抗性提高的性状连锁的标志物、和与黑穗病抵抗性降低的性状连锁的标志物。由上述的表2、表4、和表7所示的3个区域设计的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物与黑穗病抵抗性提高的性状连锁。另一方面，由上述的表1、表3、表5和表6所示的4个区域设计的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物与黑穗病抵抗性降低的性状连锁。
因此，如果在供试甘蔗中存在由上述的表2、表4、和表7所示的3个区域设计的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物中的任一个，则可以判断为黑穗病抵抗性提高了的品种。进而，如果在供试甘蔗中不存在由上述的表1、表3、表5和表6所示的4个区域设计的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的任一个，则可以判断为黑穗病抵抗性提高了的品种。更优选如果在供试甘蔗中存在由上述的表2、表4、和表7所示的3个区域设计的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物中的任一个，且不存在由上述的表1、表3、表5和表6所示的4个区域设计的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的任一个，则可以高精度地判断为黑穗病抵抗性提高了的品种。
特别地，在上述的方法中，不需要使供试甘蔗生长到能够实施实际的黑穗病抵抗性试验的程度，可以使用例如后代系统的种子和/或使该种子发芽而得的幼苗。因此，通过利用甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，可以大幅削减用于使供试甘蔗生长的农场和/或其他用于生长的成本。另外，通过利用甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，不需要实际感染黑穗病的病原微生物(甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea))，可以削减大规模专用温室和/或专用农场、与外部的隔离设施等设备等所花费的成本。
特别地，在制成甘蔗的新品种时，优选首先通过杂交制作数万种杂交种后，在由种子发芽而生长的筛选之前或取代由种子发芽而生长的筛选而进行利用甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的判断。由此，可以在实际的农场中大幅削减栽培优良的系统的数，从而可以大幅抑制制成甘蔗的新品种所花费的工夫和/或成本。
或者，在制成甘蔗的新品种时，还可以首先判定杂交所使用的亲品种中的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物的存在的有无，筛选出黑穗病抵抗性优异的亲品种。通过优先使用黑穗病抵抗性优异的亲品种制成后代系统，可以期待黑穗病抵抗性优异的后代系统高频率地出现。由此，可以大幅削减栽培优良的系统的数，从而可以大幅抑制制成甘蔗的新品种所花费的工夫和/或成本。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于以下的实施例。
1.DNA微阵列用探针的制成
(1)材料
使用甘蔗品种：NiF8、Ni9、US56-15-8、POJ2878、Q165、R570、Co290和B3439、甘蔗亲缘野生种：Glagah Kloet、Chunee、Natal Uba和Robustum9、以及蔗茅属：IJ76-349和JW630。
(2)限制性酶处理
从这些甘蔗品种、甘蔗亲缘野生种和蔗茅属分别使用DNeasy PlantMini Kit(Qiagen社制)提取基因组DNA。将基因组DNA(750ng)用限制性酶PstI(NEB社、25unit(活力单位))在37℃处理2小时处理后，添加限制性酶BstNI(NEB社、25unit)，在60℃处理2小时。
(3)衔接物连接
在(2)中处理的基因组DNA片段(120ng)中加入PstI序列衔接物(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列号86)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列号87))和T4DNA Ligase(T4DNA连接酶)(NEB社、800unit)，在16℃处理一昼夜。由此，对(2)中处理的基因组DNA片段中两末端具有PstI识别序列的基因组DNA片段选择性地添加衔接物。
(4)PCR扩增
在(3)中得到的具有衔接物的基因组DNA片段(15ng)中加入PstI序列衔接物识别引物(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(序列号88))和Taq聚合酶(TAKARA社PrimeSTAR、1.25unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃15秒、72℃1分钟进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)扩增基因组DNA片段。
(5)基因组序列获得
对于(4)中PCR扩增而得的基因组DNA片段通过桑格法(Sanger法)确定碱基序列。另外，从基因组数据库(Gramene：http://www.gramene.org/)所存储的高粱属全基因组序列信息获得由PstI识别序列所夹入碱基序列信息。
(6)探针设计和DNA微阵列的制成
以(5)的基因组序列信息为基础设计50～75bp的探针。以设计的探针的碱基序列信息为基础，制作具有这些探针的DNA微阵列。
2.使用DNA微阵列的信号数据的获得
(1)材料
使用甘蔗品种·系统：NiF8和Ni9、以及杂交后代191系统。
(2)限制性酶处理
从这些NiF8和Ni9、以及191系统的后代系统分别使用DNeasy PlantMini Kit(Qiagen社制)提取基因组DNA。将基因组DNA(750ng)用限制性酶PstI(NEB社、25unit)在37℃处理2小时后，添加限制性酶BstNI(NEB社、25unit)，在60℃处理2小时。
(3)衔接物连接
在(2)中处理的基因组DNA片段(120ng)中加入PstI序列衔接物(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列号86)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列号87))和T4DNA Ligase(NEB社、800unit)，在16℃处理一昼夜。由此，对(2)中处理的基因组DNA片段中两末端具有PstI识别序列的基因组DNA片段选择性地添加衔接物。
(4)PCR扩增
在(3)中所得的具有衔接物的基因组DNA片段(15ng)中加入PstI序列衔接物识别引物(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(序列号88))和Taq聚合酶(TAKARA社PrimeSTAR、1.25unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃15秒、72℃1分钟进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)扩增基因组DNA片段。
(5)标记化
将上述(4)中所得的PCR扩增片段用柱(Qiagen社)纯化后，加入Cy3-labeled9mers(Cy3-标记的9聚体)(TriLink社、1O.D.)，在98℃处理10分钟后，在冰上静置10分钟。然后，加入Klenow(克列诺片段)(NEB社、100unit)，在37℃处理2小时。然后，通过乙醇沉淀制备标记化样品。
(6)杂交·信号检出
使用(5)的标记化样品，按照NimbleGen Array User’s Guide(NimbleGen阵列用户指南)，使用上述1.所制作的DNA微阵列进行杂交，检出基于标记的信号。
3.甘蔗黑穗病抵抗性的QTL的鉴定和标志物的开发
(1)遗传图谱数据片制成
由上述2.所检出的甘蔗品种NiF8、Ni9和它们的杂交后代系统(191系统)的信号数据获得可以成为3004个和4569个标志物的基因型数据。以该基因型数据为基础，使用遗传图谱制成软件AntMap(Iwata H,NinomiyaS(2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using an ant colonyoptimization algorithm.Breed Sci56:371-378)，通过遗传距离计算式Kosambi计算出染色体中的标志物的位置信息。进而，以获得的标志物的位置信息为基础，通过Mapmaker/EXP ver.3.0(A Whitehead Institute forBiomedical Research Technical Report,Third Edition,January,1993)制成遗传图谱数据片。
(2)黑穗病抵抗性数据的获得
2009年10月26～28日收货NiF8和Ni9、杂交后代191系统的茎，在室温·高湿度条件下进行催芽处理2～3天后，供于黑穗病孢子的有伤接种。有伤接种是在苗芽子两侧付与伤口(计6处、深约4.0mm)，用毛笔涂布孢子悬浮液(107～108个·孢子/ml)。孢子悬浮液的黑穗病孢子从2009年在冲绳县内栽培的Ni9的黑穗病自然发病株的鞭状物采集。有伤接种的苗在室温·高湿度条件下栽培2～3天，于2009年10月30日～11月1日种植到育苗箱(40芽/箱、2箱/系统)。苗的种植后，在高湿度条件下、温室栽培至2010年9月2日。黑穗病患病程度的调查，测算作为患病的前兆的鞭状物从顶部露出的株数作为患病株数。调查患病株数后，将患病株的植物体从与地面接触的部位切掉除去。黑穗病患病株数的调查在2010年6月23日、7月21日、8月18日和9月2日实施共计4次。黑穗病的患病率作为患病株数相对于发芽株数(除去除了黑穗病以外的枯死株)的比例计算出。将2010年6月23日调查的结果示于图3，7月21日调查的结果示于图4，8月18日调查的结果示于图5，9月2日调查的结果示于图6。
(3)量的性状(Quantitative trait loci(数量性状座位):QTL)的分析
以上述(1)中所得的遗传图谱数据片和上述(2)中所得的黑穗病抵抗性数据为基础，使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten,and Z.-B.Zeng(2010).Windows QTL Cartographer2.5.Department ofStatistics,North Carolina State University,Raleigh,NC)，通过复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM法)来进行QTL分析。此时LOD的阈值为2.5。其结果如图7～12所示，在甘蔗品种NiF8的第5连锁群的标志物N827337至N821515(8月18日)、第17连锁群的标志物N826561至N826906(6月23日、7月21日、8月18日)、第40连锁群的标志物N816552至N821999(7月21日、8月18日、9月2日)、甘蔗品种Ni9的第1连锁群的标志物N915070至N920207(7月21日、8月18日、9月2日)、第13连锁群的标志物N914284至N916129(7月21日、8月18日、9月2日)、第14连锁群的标志物N901177至N900802(6月23日)、标志物N901524至N918080(6月23日、7月21日)的7个区间内确认了存在与甘蔗的黑穗病抵抗性相关的QTL。即，在这7个区间内得到了超过LOD的阈值的峰。所得的峰可以如表8所示那样特定，启示了该峰的位置存在具有提高黑穗病抵抗性的功能的应答基因(群)。此外，表8中效果(％)的栏显示黑穗病的罹患率的增减。因此，在效果(％)的数值为负的情况下，意味着该QTL与黑穗病抵抗性提高的性状连锁，在效果(％)的数值为正的情况下，意味着该QTL与黑穗病抵抗性降低的性状连锁。
表8
Figure BDA0000403018440000271
并且，如图7～12所示，显示位于该峰的附近的标志物与具有提高或降低黑穗病抵抗性的功能的应答基因(群)连锁地遗传，因而可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。即，明确了图7～12所示的85种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
此外，作为上述2.中的(6)信号检出的一例，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在NiF8中存在的第5连锁群的标志物N827337至N821515所含的14种标志物的信号值示于表9，其中，对于N802870，将该信号值示于图13。
表9
Figure BDA0000403018440000281
在存在于NiF8的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性降低了的后代系统中这14种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第5连锁群的标志物N827337至N821515所含的14种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
同样地，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在NiF8中存在的第17连锁群的标志物N826561至N826906所含的8种标志物的信号值示于表10，其中对于N827136，将该信号值示于图14。
表10
Figure BDA0000403018440000301
在存在于NiF8的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性优异的后代系统中这8种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第17连锁群的N826561至N826906所含的8种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
同样地，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在NiF8中存在的第40连锁群的标志物N816552至N821999所含的10种标志物的信号值示于表11，其中对于N812680，将该信号值示于图15。
表11
Figure BDA0000403018440000321
在存在于NiF8的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性降低了的后代系统中这10种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第40连锁群的N816552至N821999所含的10种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
同样地，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在Ni9中存在的第1连锁群的标志物N915070至N920207所含的19种标志物的信号值示于表12，其中对于N916081，将该信号值示于图16。
表12
Figure BDA0000403018440000341
在存在于Ni9的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性优异的后代系统中这19种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第1连锁群N915070至N920207所含的19种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
同样地，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在Ni9中存在的第13连锁群的标志物N914284至N916129所含的11种标志物的信号值示于表13，其中对于N919839，将该信号值示于图17。
表13
Figure BDA0000403018440000361
在存在于Ni9的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性降低了的后代系统中这11种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第13连锁群的N914284至N916129所含的11种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
同样地，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在Ni9中存在的第14连锁群的标志物N901178至N900802所含的10种标志物的信号值示于表14，其中对于N918761，将该信号值示于图18。
表14
在存在于Ni9的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性降低了的后代系统中这10种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第14连锁群的N901178至N900802所含的10种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
同样地，将NiF8和Ni9、以及后代系统中的、存在于在Ni9中存在的第14连锁群的标志物N901524至N918080所含的13种标志物的信号值示于表15，其中对于N901160，将该信号值示于图19。
表15
在存在于Ni9的连锁群中，显示在黑穗病抵抗性优异的后代系统中这13种标志物的信号值非常高。由这些结果也可明确，存在于第14连锁群的N901524至N918080所含的13种标志物可以作为甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物使用。
本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。
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Claims (6)

1.甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其包含选自甘蔗的染色体中的由序列号1所示的碱基序列和序列号14所示的碱基序列所夹的区域、由序列号15所示的碱基序列和序列号22所示的碱基序列所夹的区域、由序列号23所示的碱基序列和序列号32所示的碱基序列所夹的区域、由序列号33所示的碱基序列和序列号51所示的碱基序列所夹的区域、由序列号52所示的碱基序列和序列号62所示的碱基序列所夹的区域、由序列号63所示的碱基序列和序列号72所示的碱基序列所夹的区域、或由序列号73所示的碱基序列和序列号85所示的碱基序列所夹的区域中的连续的核酸区域。
2.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其特征在于，所述核酸区域包含选自由序列号1～85组成的群组中的任一碱基序列或该碱基序列的一部分。
3.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物，其特征在于，所述核酸区域位于甘蔗的染色体中的由序列号5所示的碱基序列和序列号9所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号18所示的碱基序列和序列号22所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号25所示的碱基序列和序列号32所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号33所示的碱基序列和序列号42所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号57所示的碱基序列和序列号59所示的碱基序列所夹入的区域、由序列号64所示的碱基序列和序列号66所示的碱基序列所夹入的区域、或由序列号72所示的碱基序列和序列号80所示的碱基序列所夹入的区域中。
4.黑穗病抵抗性提高了的甘蔗属系统的制造方法，其包括以下工序，
提取工序：提取至少一方亲本是甘蔗属植物的后代植物的染色体和/或该亲本的染色体，和
测定工序：测定权利要求1～3的任一项所述的甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物在上述所得的染色体中的存在或不存在。
5.根据权利要求4所述的甘蔗属系统的制造方法，其特征在于，在所述测定工序中，使用具备与所述甘蔗黑穗病抵抗性相关标志物对应的探针的DNA芯片。
6.根据权利要求4所述的甘蔗属系统的制造方法，其特征在于，所述后代植物是种子或幼苗，由该种子或幼苗提取染色体。
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