CN113684308B - 樱花ssr分子标记引物及在20个樱花品种鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了樱花SSR分子标记引物及在20个樱花品种鉴定中的应用，通过从尾叶樱基因组数据中独立开发了樱花品种SSR相关的分子标记引物，对开发的16对SSR引物进行扩增及多态性筛选，最终选择引物ZJF01和ZJF02进行24个品种的鉴定，结果验证通过2对引物组合就能将其中的20个樱花品种进行区分鉴定，可见，本发明能够采用很少的引物组合就能鉴别出20个樱花品种，丰富了樱花品种分子标记鉴定的类型，由于选用的引物对少，可以大大提高鉴定效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及樱花SSR分子标记引物及在20个樱花品种鉴定中的应用。
背景技术
樱花为蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus sensu lato)樱亚属植物(subgenusCerasus)的统称。樱花是世界著名观花乔木，盛开时繁花满树，末花时落英缤纷；作为经济价值较高的果木和高雅的园林花木，具有广阔的开发利用前景。近百年来，通过自然变异筛选和人工杂交培育出600多个樱花园艺品种。但是，由于许多品种间形态相似性较高、品种来源记载不详、同物异名与异物同名现象频发；且多数樱花先花后叶，花叶不同期，易于杂交，形态变异丰富多样，生活史长、花期相对较短，缺乏快速准确的鉴定方法(王贤荣，2014，Shi et al.，2013)。
近百年来，人们通过自然变异筛选和杂交培育的方式获得了600多个樱花园艺品种(袁冬明等，2018)。针对这些园艺品种，分类学家先后根据树形、花、果、叶、冬芽等形态特性提出三级、五级分类标准及花期、花色分类标准(时玉娣，2007，藤木俊雄，2009，张琼等，2012)。由于不同学者对形态性状的判断标准不一样，品种间性状交叉、重叠及在不同环境中具有很强的可塑性，造成形态学鉴定的困难，从而造成品种名混淆，同物异名、异物同名等现象时常发生。
随着分子生物学的兴起，分类学家开始使用不同的DNA分子标记研究樱花种质资源的多样性及亲缘关系。研究人员利用RFLP、AFLP等分子标记区分欧洲甜樱桃(P.avium)与欧洲酸樱桃(P.cerasus)(Badenes and Parfitt，1995；Hisayo et al.，2003；Zamani andBouzari，2012)，利用SSR、ISSR和SCAR标记区分樱桃(P.pseudocerasus)、欧洲甜樱桃、草原樱桃(P.fruticosa)、山樱花(P.serrulata)等(Cantini，2001；Khadivi-Khub et al.，2014；Barac et al.，2014；Kato et al.，2014；Zhang and Gu，2016；赵庆杰等，2016；宗宇等，2016)。但是，由于樱花品种繁多，已有的分子标记分辨率低，不足以鉴定区分全部品种，因此，持续不断开发新的分子标记，对于樱花品种鉴定是非常必要的。SSR标记因其多态性高、稳定性好、多等位基因、共显性、数量丰富、基因组覆盖性好和操作简单等优点(Powellet al，1996)广泛用于遗传多样性、品种指纹图谱绘制、品种鉴定、遗传图谱、目的基因定位等领域。本研究从尾叶樱基因组数据中开发樱花品种SSR相关分子标记，并研究其在樱花品种鉴定中的应用，对樱花品种鉴定以及分子标记辅助育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种樱花SSR分子标记引物。
本发明的目的之二在于提供樱花SSR分子标记引物在樱花品种鉴定中的作用。
本发明目的之三在于提供一种鉴定樱花的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
樱花SSR分子标记引物，所述分子标记引物包括如下两对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
(1)ZJF01：正向引物序列为F：GATGTAGAGGGAGGTTCTGTATTTG(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列为R：ACGGATCTAGTGAGGGATGGGTATG(如SEQ ID NO.2所示)；
(2)ZJF02：正向引物序列为F：TAGTCTCAGCAGAACCACCAAATAC(如SEQ ID NO.3所示)，反向引物序列为R：ATGATACTGATTACGAGAGGCTTAG(如SEQ ID NO.4所述)。
上述樱花SSR分子标记引物在樱花品种鉴定中的应用，本发明采用ZJF01和ZJF02两个分子标记引物对24个樱花品种品种进行鉴定，所选用的樱花品种具体见表1，通过实验验证，本发明所选用的引物能够将其中的20个樱花品种(P01、P02、P03、P04、P05、P06、P07、P08、P09、P10、P14、P16、P17、P18、P19、P20、P21、P22、P23、P24)区分开。
表1 24个樱花品种信息
一种鉴定樱花品种的试剂盒，包含所述的樱花SSR分子标记引物——ZJF01和ZJF02。
本发明的有益效果是：
本发明通过从尾叶樱基因组数据中独立开发了樱花品种SSR相关的分子标记引物，对开发的16对SSR引物进行扩增及多态性筛选，最终选择引物ZJF01和ZJF02进行24个品种的鉴定，结果验证通过2对引物组合就能将其中的20个樱花品种进行区分鉴定，可见，本发明能够选用很少的引物组合就能鉴别出20个樱花品种，丰富了樱花品种分子标记鉴定的类型，由于选用的引物对少，可以大大提高鉴定效率。
附图说明
图1是引物ZJF01对6个樱花品种DNA的扩增图谱；
图中，M为DL2000DNA Marker，条带从左到右依次为越之彼岸樱、八重红枝垂樱、松前早咲樱、银河山樱、大渔樱、大寒樱。
图2是基于SSR标记构建的24个樱花品种聚类树状图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
1材料与方法
1.1试验地和试验材料
试验地设于浙江省林业科学研究院樱花育种圃，北纬30°13′12″，东经120°01′11″。地属亚热带季风气候区，四季分明，年温适中，年平均气温15.9～17.0℃，极端最高气温39.8～42.9℃，极端最低气温-7.1～-15.0℃；光照充足，年平均日照时数1710～2100h；空气湿润，年平均相对湿度76％～81％；雨量充沛，年平均雨量在980～2000mm；无霜期199～328d。
于2015年12月，从福建省、贵州省、山东省、湖北省、上海市、云南省和浙江省7个省的樱花育种基地采集樱花品种种植于浙江省林业科学研究院樱花育种圃(见表1)。采集品种的DNA样品，分别将新鲜、无病害的幼嫩叶片置于装有硅胶的自封袋中迅速干燥，然后保存于-20℃冰柜中备用。
1.2 DNA提取方法
利用Bioteke公司生产的快速植物基因组DNA提取试剂盒(型号DP3112)提取208份供试材料的基因组DNA，提取前利用缓冲液对样品进行预处理，以去除大量的多糖、色素等杂质。利用1％的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，用Nanodrop超微量分光光度计测定DNA浓度，并将其稀释到50ng·μL-1，置于-20℃冰箱中保存备用。
1.3 SSR引物开发
基于前期课题组对尾叶樱全基因组测序的结果，利用Primer 5.0软件进行SSR引物开发。对开发的16对SSR引物进行扩增及多态性筛选，最终选择引物ZJF01和ZJF02进行24个品种的鉴定(SSR引物信息见表2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2 SSR引物信息
1.4 PCR扩增
PCR扩增体系为25μL：50ng·μL-1DNA模板2μL，2×TSINGKE Master MIX(blue)12.5μL(由北京擎科生物科技有限公司生产)，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应在Applied Biosystem Veriti Thermal Cycler PCR(香港Gene Company Limited基因有限公司)仪器上进行，反应程序为：95℃5min；95℃45s，55～58℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃7min；最后4℃保存。PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳筛选条带清晰的产物。
1.5毛细管电泳
将条带清晰稳定的PCR产物吸取1μL，通过Qsep100TM全自动核酸蛋白分析仪进行毛细管电泳检测。毛细管电泳所使用的卡匣为S1高分辨率卡夹，分子大小标准参照物为1KSize marker，两者均由广州吉源生物科技有限公司生产。
1.6数据分析
将全自动核酸蛋白分析仪输出的各品种峰值进行比较分析，得到片段大小，数据分析用GeneMarker 2.2.0软件。利用Covert软件将序列长短数据转换为基因型。计算SSR引物等位基因数(number of alleles，Na)，观察杂合度(observed heterozygosity，Ho)，Nei′s遗传多样性(Nei′s gene diversity，H)，Shannon′s信息指数(Shannon′sinformationindex，I)和多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)，统计分析用PopGene 32软件。利用MG软件将片段大小数值转化为0、1数据矩阵，利用Ntsys2.1软件计算各样品间的遗传相似系数(Coefficient)，并采用UPGMA法进行聚类。
2结果
2.1分子标记多态性分析
用NanoDrop超微量分光光度计和1.0％琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行检测，24个樱花品种叶片提取物的A260/A280都介于1.8～2.0，A260/A230均大于2.0，DNA浓度范围在230ng·μL-1-550ng·μL-1，说明提取的DNA样品中蛋白质、色素、酚类物质等含量较低，DNA样品纯度较高，可满足后续检测需求。随机选取越之彼岸樱、八重红枝垂樱、松前早咲樱、银河山樱、大渔樱、大寒樱6个樱花品种，对开发的16对SSR引物进行筛选，得到扩增条带清晰、稳定、重复性好的多态性引物ZJF01和ZJF02(图1)。
利用这2对SSR引物分别对24个樱花品种的基因组DNA进行扩增，共获得21条清晰的条带，长度介于57～331bp之间。其中，引物ZJF01扩增出9条带型清晰的条带，有效等位基因为4.35个，观察杂合度为0.04，期望杂合度为0.79，Shannon′s信息指数为1.77，Nei′s遗传多样性指数为0.77。引物ZJF02扩增出12条带型清晰的条带，有效等位基因为6.47个，观察杂合度为0.38，期望杂合度为0.86，Shannon′s信息指数为2.06，Nei′s遗传多样性指数为0.85(表3)。说明这2对引物多态性较好，能够较好的反映24个樱花品种的多样性信息。
表3 SSR标记在24种樱花品种中的遗传信息
2.2分子标记对樱花品种的区分度
根据樱花各品种基因型的分析，引物ZJF01可以鉴定出蝴蝶樱、中国红、紫荆樱、八重红枝垂樱和钟花樱5个品种，区分率为37.5％；引物ZJF02可以鉴定出红华樱、霞樱、御车返樱、大渔樱、御帝吉野樱、太白樱和山樱花7个品种，区分率为50.0％。而当2个引物组合后，可以鉴定出24种樱花品种中的20种，区分率提升至91.7％，大大提高了鉴定效率。在区分的种质编号仅有P01、P02、P03、P04、P05、P06、P07、P08、P09、P10、P14、P16、P17、P18、P19、P20、P21、P22、P23、P24时，利用ZJF01和ZJF02这两对分子标记引物就能完全将其区分。
表4分子标记对樱花品种的区分
2.3基于55R标记的樱花品种遗传关系分析
24份樱花品种的遗传相似系数范围为0.71-1.00，其中八重红枝垂樱与霞樱、一叶樱、大渔樱、御帝吉野樱、雅樱、钟花樱、山樱花相似度最低，霞樱与一叶樱、大渔樱、御帝吉野樱、思川樱、雅樱、钟花樱、山樱花亲缘关系最远。仙台屋樱与御殿场樱、福禄寿樱与红时雨樱相似度最高，这个两个引物无法将两者区分开。当遗传相似系数为0.78时，24种樱花品种聚为一起；当遗传相似系数为0.96时，24种樱花品种聚为22个组，其中仙台屋樱(文中编号P13)与御殿场樱(文中编号P15)聚为一起，福禄寿樱(文中编号P11)与红时雨(文中编号P12)樱聚为一起，其余20个品种各为一组，可完全区分开(图2)，再次验证了利用ZJF01和ZJF02这两对分子标记引物就能完全将20个品种区分。
2.4樱花品种SSR特征指纹与品种鉴定
2对引物在24个樱花品种中共检测出21种不同的基因型，其中纯合型为14个，杂合型为7个。引物ZJF01检测出9种基因型，ZJF02检测出12种基因型。在ZJF01位点上，蝴蝶樱、中国红、紫荆樱、八重红枝垂樱和钟花樱表现出特有基因型。在ZJF02位点上，红华樱、霞樱、御车返樱、大渔樱、御帝吉野樱、太白樱和山樱花表现出特有基因型。在ZJF01+ZJF02组合位点上，除仙台屋樱与御殿场樱、福禄寿樱与红时雨樱外，其余20种樱花品种均表示出特有组合基因型。
基于开发的2对引物和每个品种对应的基因型，将引物+基因型组合作为24种樱花品种的SSR特征指纹，具体参见表5，为各樱花品种鉴别提供分子依据。
表5 24个樱花品种的SSR特征指纹(引物+基因型)
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江省林业科学研究院
<120> 樱花SSR分子标记引物及在20个樱花品种鉴定中的应用
<130> 2021
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Prunus dielsiana
<400> 1
gatgtagagg gaggttctgt atttg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Prunus dielsiana
<400> 2
acggatctag tgagggatgg gtatg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Prunus dielsiana
<400> 3
tagtctcagc agaaccacca aatac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Prunus dielsiana
<400> 4
atgatactga ttacgagagg cttag 25
Claims (2)
1.樱花SSR分子标记引物组合在樱花品种鉴定中的应用，其特征在于，所述分子标记引物组合为如下两对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
(1)ZJF01：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；(2)ZJF02：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述品种为如下20种：
2.一种试剂盒在樱花品种鉴定中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的樱花SSR分子标记引物组合，所述樱花品种为权利要求1所列的20个品种。
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