CN117887894A - 一种葡萄品种的鉴定方法 - Google Patents

一种葡萄品种的鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117887894A
CN117887894A CN202410288373.7A CN202410288373A CN117887894A CN 117887894 A CN117887894 A CN 117887894A CN 202410288373 A CN202410288373 A CN 202410288373A CN 117887894 A CN117887894 A CN 117887894A
Authority
CN
China
Prior art keywords
variety
grape
sample
varieties
detected
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202410288373.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117887894B (zh
Inventor
房经贵
吴琦琦
郑斌
刘嘉凝
李飞跃
上官凌飞
王晨
王亚宁
于沐成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Goripu Biotechnology Nanjing Co ltd
Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Goripu Biotechnology Nanjing Co ltd
Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Goripu Biotechnology Nanjing Co ltd, Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University, Nanjing Agricultural University filed Critical Goripu Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority to CN202410288373.7A priority Critical patent/CN117887894B/zh
Publication of CN117887894A publication Critical patent/CN117887894A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117887894B publication Critical patent/CN117887894B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/30—Unsupervised data analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种葡萄品种的鉴定方法，该方法的建立首先根据部分选取的SSR标记位点组合将待构建CID的葡萄品种资源通过邻接法聚类，再将大样本分割成多个小类群，进一步利用更多的引物多态性条带有无对每一小类群品种进行区分，构建出每个小类群的CID，进而形成由多个小类群CID组成的适用于其所包含的所有品种的鉴定信息。本发明还公开了如何利用这些小类群CID进行待检测样品的真伪辨别、混淆品种的精准区分以及对待检测未知品种材料的精准鉴定；该发明同样适用于其他果树树种。

Description

一种葡萄品种的鉴定方法
技术领域
本发明属于葡萄品种鉴定领域，具体涉及一种葡萄品种的鉴定方法。
背景技术
种质资源是果树作物育种和生产的物质基础，因此葡萄种质资源的鉴定一直是重要的研究工作。通过形态学性状、同工酶等鉴定手段难以满足对大量葡萄种质资源鉴定的需要，而分子标记能直接检测DNA水平的差异，其稳定性强、可重复性好且不依赖于表型性状，近年来已广泛应用于植物的分子指纹图谱和品种鉴别等研究。其中，SSR标记在整个基因组中广泛分布，具有多态性高、操作技术简便、成本低等优点。葡萄基因组上约有286192~627429个SSR位点，大约每kb含1个以上SSR位点，其对不同葡萄品种亲缘关系分析的结果与SNP相似。因此，有必要开发一种基于SSR的操作简便、判别结果稳定的葡萄品种DNA标记精准鉴定方法。
人工绘制品种鉴定图（Manual Cultivar Identification Diagram，MCID）法，利用DNA标记建立的植物品种鉴定图（Cultivar Identification Diagram，CID）可以对被鉴定的品种进行正确区分，已成功应用于多类植物鉴定工作中，如葡萄、冬瓜、青花菜、烟草、柿子、枇杷、茶树、银杏、萝卜和桃等。然而在实际应用中，当待构建CID图的植物品种资源数量大时，由于所用引物数量的显著增加，易导致CID构建工作量加重、成本升高等。另外，这也使利用CID鉴定待检测样本的工作繁琐程度增加、效率降低。
如何发挥MCID在品种资源鉴定中的优势，达到对大样本的高效快速鉴定，可以将大样本分割成多个小类群，然后再构建各小类群对应CID。而邻接法(Neighbor-joiningMethod，NJ法)（Saitou and Nei, 1987）可以利用DNA标记信息分析出的遗传距离将不同的基因型材料进行聚类。基于此，我们开发了先通过NJ法进行小类群分割，再构建小类群对应的CID的省工省力的葡萄品种精准鉴定技术。该技术不仅可以实现真伪品种的鉴别和混淆品种的区分，还可以实现待检测未知品种材料的精准鉴定。
发明内容
本发明的目的在于开发一种满足品种资源种类多、数量丰富的葡萄品种鉴定实效方法，以充分发挥MCID法鉴定品种准确、操作简便等优势，同时克服其在鉴定大量样本时工作量增大、鉴定效率降低等不足。
我们共选取了42个葡萄品种进行SSR的扩增，扩增信息经统计后用于构建品种资源数据信息的EXCEL表和CID图：首先根据部分选取的SSR标记位点组合将待构建CID的葡萄品种进行聚类，使大样本分割成多个小类群，再进行每个小类群的CID构建，进而形成由多个小类群CID组成的适用于其所包含的所有品种的鉴定信息。
在此基础上，我们进一步发明了如何利用该鉴定信息进行快速精准区分待检测样品的措施。首先确定待检测样品所在的小类群，再利用该小类群对应的CID构建时所用引物进行PCR扩增，获得其DNA指纹，进一步根据所用引物以及DNA指纹中的多态性条带信息，对照CID锁定对应葡萄品种，即可达到对CID所包含品种中的某一或某些待检测样品真伪的辨别、混淆品种的精准区分以及对未知送样材料的真实品种鉴定（即盲样检测）。
本发明是通过如下技术方案得以实现的：
第一方面，本发明首先提供一种葡萄品种鉴定图的构建方法，包括以下步骤：
（1）基于葡萄全基因组序列信息，随机挑选分布在葡萄1-19号染色体上的SSR位点，其挑选的位点数量与葡萄品种样本量呈正相关，根据SSR位点选取上下游各100bp设计候选的SSR引物；
（2）采集待构建CID葡萄品种资源的嫩叶作为植物材料，提取样品基因组DNA；
（3）随机选取8-10个样品的基因组DNA对步骤（1）得到的SSR引物进行PCR扩增，根据指纹质量从中筛选出条带稳定、指纹清晰的SSR引物，筛选到的引物如SEQ ID No:1~30所示；
（4）以样品基因组DNA为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的目标条带丰富、多态的SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
（5）将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
（6）将目标多态性条带统计结果形成1/0矩阵，利用NJ法进行聚类分析，分成数个小类群；
（7）以各小类群中葡萄品种资源的基因组DNA为模板，再利用如SEQ ID No:11~30所示的部分SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物，并重复步骤（5）；
（8）每个小类群的多态性条带统计结果用于构建其相对应的品种鉴定图，作为精准鉴定各小类群所包含品种的参考依据：首先利用第一对引物扩增的多态性条带对每一小类群品种进行区分，并将该引物代码标注到分类的支线上，同时将所利用条带的有、无以及大小分别标注到有带、无带品种群的两条分支线上；利用第二对引物对尚未区分的品种进一步分类，依次进行区分直至所有品种分开。
优选的，所述步骤（1）中，挑选了72对SSR引物，挑选SSR位点时保证每条染色体的SSR位点都被挑选到。
优选的，所述步骤（1）选取了42个葡萄样品，步骤（3）中选取了8个样品。
优选的，所述步骤（2）中，待检测葡萄品种样品基因组DNA提取方法为CTAB法，更优选的，CTAB法具体操作参考金沙生物DE711-50试剂盒。
优选的，所述步骤（3）、（4）、（7）中，PCR扩增体系以10μL计，包括：ddH2O 2μL，2×Taq Master Mix 5μL，20ng/μL模板DNA 1μL，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL。扩增的PCR程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述步骤（5）中，凝胶电泳采用8%聚丙烯酰胺凝胶，所述8%聚丙烯酰胺凝胶配制以50.42mL计，包括：ddH2O 30mL，30%制胶液 15mL，10×TBE 5mL，10%AP 380μL，TEMED 40μL。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳程序包括：电压200V，电流400mA，时间1.3h。
优选的，所述步骤（4）中用于聚类分析的目标条带丰富、多态的SSR引物数量原则上不超过6对，步骤（6）中聚类后分成的各小类群内品种数量原则上不超过30份。
优选的，所述步骤（3）、（7）中，SSR引物序列、扩增目标条带大小、引物功能和序列编号等形成引物信息表2。
优选的，所述步骤（6）中，将目标多态性条带统计结果形成1/0矩阵，将矩阵信息按NTSYSpc2.10e软件要求格式生成数据文件并导入软件，计算各葡萄样品间的相似性，并获得葡萄样品的距离矩阵，随后将距离矩阵导入MEGA7.0.14软件，以NJ法进行遗传相似聚类，绘制聚类图，从而将大样本分割成多个小类群。
本发明还保护前文所述的构建方法构建得到的葡萄品种鉴定图。
第二方面，本发明还保护前文所述的方法在如下任一中的应用：
（A1）葡萄品种鉴定图的构建；
（A2）葡萄品种真伪辨别；
（A3）葡萄混淆材料的区分；
（A4）葡萄未知品种送样材料的检测。
第三方面，本发明保护一种葡萄品种真伪辨别的方法，利用前文所述方法构建得到的品种鉴定图进行辨别，具体包括如下步骤：
步骤1，以待检测样品基因组DNA为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况，将目标多态性条带统计结果并入葡萄品种资源1/0矩阵中，利用NJ法聚类，获得待检测样品所在的小类群；
步骤2，若待检测样品属于其品种名所在的小类群，以其基因组DNA为模板，利用其对应小类群品种鉴定图构建时所使用的引物进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤3，根据其多态性条带的统计信息与矩阵中对应品种的多态性条带信息对比，若相同，则待检测样品为真实品种，否则不属于该品种；
步骤4，若待检测样品不在其品种名所在的小类群，则该待检测样品不属于该品种。
第四方面，本发明保护一种葡萄混淆材料的区分方法，利用前文所述方法构建得到的品种鉴定图进行辨别，具体如下：
（B1）若混淆材料的品种名属于同一小类群：
步骤1，在该小类群的CID上找出待检测品种的差异分支点，确认差异区分时所利用的SSR引物及目标条带大小信息；
步骤2，以待检测样品的基因组DNA为模板，利用该SSR引物进行PCR扩增，获得PCR产物，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤3，根据对比差异位点多态性条带的统计信息即可正确区分两个或多个混淆样本；
（B2）若混淆材料的品种名属于不同小类群，
步骤1，以待检测样品的基因组DNA为模板与用于聚类的如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行PCR扩增，获得PCR产物，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤2，将目标条带统计结果并入葡萄品种资源1/0矩阵中，利用NJ法聚类，确定各待检测样品所属小类群，即可区分两个待检测的混淆样品；多个混淆样品进行区分时，如出现两个以上品种聚类到同一小类群时，重复（B1）中的步骤1-3。
第五方面，本发明保护一种葡萄未知品种送样材料的检测方法，利用前文所述方法构建得到的品种鉴定图进行检测，具体如下：
步骤1，提取待检测样品的基因组DNA，利用如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行扩增，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤2，将目标条带统计结果并入葡萄品种资源1/0矩阵中，利用NJ法聚类，确定待检测样品所属小类群；
步骤3，利用其对应小类群的CID构建时所使用引物进行PCR扩增，并进行凝胶电泳检测，统计目标多态性条带情况；
步骤4，根据多态性条带对比其对应品种鉴定图信息，即可鉴定出待测样品的真实品种。
第六方面，本发明保护一种引物组合，所述引物组合由15对引物组成，所述引物序列如SEQ ID No:1~30所示。
具体的，所述引物组合由SEQ ID No:1~2所示的引物对、SEQ ID No:3~4所示的引物对、SEQ ID No:5~6所示的引物对、SEQ ID No:7~8所示的引物对、SEQ ID No:9~10所示的引物对、SEQ ID No:11~12所示的引物对、SEQ ID No:13~14所示的引物对、SEQ ID No:15~16所示的引物对、SEQ ID No:17~18所示的引物对、SEQ ID No:19~20所示的引物对、SEQ IDNo:21~22所示的引物对、SEQ ID No:23~24所示的引物对、SEQ ID No:25~26所示的引物对、SEQ ID No:27~28所示的引物对、SEQ ID No:29~30所示的引物对组成。
第七方面，本发明保护一种用于葡萄品种资源鉴定的试剂，包含前文所述的引物组合。
第八方面，本发明保护一种用于葡萄品种资源鉴定的试剂盒，所述试剂盒含有前文所述的引物组合或含有前文所述的试剂。
第九方面，本发明还保护前文所述的引物组合，前文所述的试剂，前文所述的试剂盒在如下任一中的应用：
（C1）葡萄品种鉴定图的构建；
（C2）葡萄品种真伪辨别；
（C3）葡萄混淆材料的区分；
（C4）葡萄未知品种送样材料的检测。
本发明相对现有技术有如下技术效果：
本发明提供了一种满足葡萄大量品种资源鉴定的省工省力的新方法，涉及利用MCID法构建CID以及利用CID鉴定待检测样品两部分。该方法鉴定精准、成本低、效率高，既可以进行真伪品种的辨别及混淆品种的区分，还可以对未知送样材料的真实品种进行鉴定（即盲样检测），为葡萄品种资源的保存与利用以及新品种知识产权的保护提供重要的技术支撑。
本发明既发挥了MCID法简洁、方便、快速的鉴定优势，又克服了其在构建大量品种资源CID以及利用其进行品种鉴定时存在所使用引物增多、工作量加重、成本高的不足，而且可以进行盲样的精准检测。
附图说明
图1为葡萄品种鉴定模型的构建及应用示意图；
图2为葡萄品种资源聚类图；
图3为A类群葡萄品种CID图；
图4为B类群葡萄品种CID图；
图5为C类群葡萄品种CID图；
图6为D类群葡萄品种CID图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施案例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施案例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中列出或使用的样品、耗材以及试剂中，均可通过市售获得。本发明所使用的实验方法，例如DNA提取、PCR、凝胶电泳等均为本领域的常规方法和技术。
实施例1 品种鉴定图（CID）的构建
品种鉴定图的构建参见图1，具体包括如下步骤：
（1）基于葡萄基因组序列信息，随机挑选分布在葡萄1-19号染色体上的72个SSR位点，选取上下游各100bp设计候选的SSR引物（见表4）。
（2）采集待构建CID葡萄品种资源（见表1）的嫩叶作为植物材料，采用CTAB法（具体操作参考金沙生物DE711-50试剂盒）进行基因组DNA提取。
（3）随机选取8个样品的基因组DNA对SSR引物进行扩增，从中筛选出条带稳定、指纹清晰的SSR引物。
①PCR扩增体系以10μL计为：ddH2O 2μL，2×Taq Master Mix 5μL，20ng/μL模板DNA 1μL，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。
②将获得的PCR扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳配制体积以50.42mL计，包括：ddH2O 30mL，30%制胶液 15mL，10×TBE 5mL，10%AP 380μL，TEMED 40μL。
电泳程序包括：电压200V，电流400mA，时间1.3h。
③根据目标多态性条带情况，筛选出SEQ ID No:1~30所示的目的条带清晰、稳定的SSR引物15对（见表2）用于葡萄品种资源CID的构建。
④利用其中SEQ ID No:1~10所示的5对目标条带丰富、多态的SSR引物用于聚类分析（见表2）。
（4）将目标多态性条带统计结果形成1/0矩阵（见表3），利用SEQ ID No:1~10所示的5对目标条带丰富、多态的SSR引物（见表2）通过NJ法对葡萄品种资源进行聚类分析，分成小类群。
根据8号引物180,170,165bp标记、31号引物180bp,170bp,160bp标记、2号引物165bp,155bp标记、1号引物190,178,165bp标记和26号引物185bp,170bp标记目标条带的有无构建1/0矩阵，并利用NJ法对葡萄品种资源进行聚类分析，可将其准确地分为4个小类群（A类群、B类群、C类群、D类群）。
（5）构建每个小类群的CID，作为对各小类群所包含品种精准鉴定的参考依据。
a.以各小类群中葡萄品种资源的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID No:11~30所示的部分SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
b.分别将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳；
c.利用每个小类群的多态性条带统计结果分别绘制其相对应的CID，见图3~图6所示。
以A类群为例，构建其CID（A-CID）步骤如下：用6号引物扩增出的135bp多态性带，根据样品有无该条带的情况，将A类群中的14个品种分成有带的10个品种与无带的4个品种。在差异区分的主支线上标注引物序号（引物6，P6），分支线上标注目标条带的大小及其有（+135bp）与无（-135bp）。然后依次利用引物9（P9）、引物11（P11）、引物22（P22）等逐步进行鉴别，直至所有样品被清晰地区分开，见图3所示。
其他三个小类群（B、C、D）对应CID的构建按照上述同样的引物进行，区分不完整的进一步选用更多的SSR引物区分。各小类群所用SSR引物信息见表2，如表2所示，申请人对构建CID所用的引物按顺序在表2中进行标记，还添加了扩增条带的大小等信息。
实施例2 利用已构建的CID进行真伪品种鉴别
当某些品种的真实性需要鉴别时，可利用实施例1中所构建的CID信息进行其真伪的鉴别。
（1）假定待鉴别真伪的品种材料为‘巨玫瑰’，进行如下步骤：
a.以提取的样品基因组DNA为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的5对SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
b.将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
c.将目标多态性条带统计结果并入葡萄品种资源的1/0矩阵，利用NJ法聚类，结果显示该样本聚类到‘巨玫瑰’品种所在的A类群；
d.进一步以提取的样品基因组DNA为模板，利用A-CID构建所用的SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
e.将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
f.根据多态性条带对比A-CID图中‘巨玫瑰’品种的多态性条带差异区分的信息，确认该品种材料是否是真正的‘巨玫瑰’。
（2）假定待鉴别真伪的两个品种材料为‘巨玫瑰’，进行如下步骤：
a.以基因组DNA为模板，利用SEQ ID No:1~10所示的5对SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
b.将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
c.将目标多态性条带统计结果并入葡萄品种资源的1/0矩阵，利用NJ法聚类，结果显示1号样本聚类到A类群，属于‘巨玫瑰’品种所在的小类群；2号样本聚类到B类群，不属于‘巨玫瑰’品种所在的小类群，则2号样本为假冒品种；
d.以1号样本基因组DNA为模板，利用A-CID构建所用的SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
e.将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计1号样本的目标多态性条带情况；
f. 根据多态性条带对比A-CID图中‘巨玫瑰’品种差异区分的信息，确认该品种材料是否是真正的‘巨玫瑰’；
（3）假定待鉴别真伪的三种及以上品种材料为‘巨玫瑰’，可以视具体情况通过（1）和（2）加以鉴别。
实施例3 对未知样品的精准鉴定（盲样检测）
当某一未知品种材料需要鉴定时，可利用实施例1中所构建的CID信息进行其盲样检测：
（1）提取待检测样品的基因组DNA，以其为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的5对SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
（2）将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
（3）将目标多态性条带统计结果并入葡萄品种资源的1/0矩阵，利用NJ法聚类，结果显示该样本位于D类群中；
（4）以D-CID构建所用的SSR引物进行PCR扩增，并经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
（5）根据其多态性条带对比D-CID信息，结果显示该样本为16号对应品种‘白可列特’。
实施例4 混淆样品区分
当两个或多个已知品种出现混淆时，可利用实施例1中所构建的CID信息进行其混淆品种的区分。
（1）假定待区分的混淆品种（‘翡翠玫瑰’和‘蓓蕾玫瑰’）属于不同小类群：
a.提取样本基因组DNA，以其为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的5对SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
b.将获得的扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
c.将目标多态性条带统计结果并入葡萄品种资源的1/0矩阵，利用NJ法聚类，直接根据两个品种材料所处的小类群进行区分，即1号样本聚类到A类群，为‘翡翠玫瑰’；2号样本聚类到B类群，为‘蓓蕾玫瑰’；
（2）假定待区分的混淆品种（‘爱欧娜’和‘黑瑰香’）属于同一小类群：
a.根据两品种材料所处的小类群，在该小类群CID上查找两品种差异分支点所用的引物及多态性带的信息，如‘爱欧娜’和‘黑瑰香’在A类群中的差异分支点信息是22号引物（P22）与+180bp与-180bp（由22号引物扩增的多态性带区分）；
b.以待检测的两个样品基因组DNA为模板，利用22号引物进行PCR扩增，进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳;
c.根据电泳产物条带的有（+180bp）和无（-180bp），即可正确区分出‘爱欧娜’和‘黑瑰香’。
（3）假定待区分混淆的3个及以上已知品种：
根据3个及以上样品是否聚到同一和不同小类群，视具体情况通过（1）和（2）加以区分。
表1 所选用葡萄品种及其所属类群
表2 该方法所使用的引物信息表
注：NJ1、NJ2…为聚类时所用引物的先后顺序；A1、A2…，B1、B2…等分别为构建A、B等小分类群CID（A-CID、B-CID等）所用引物的先后顺序。
表3 葡萄品种资源1/0矩阵
表4 初步筛选的72对引物
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (15)

1.一种葡萄品种鉴定图的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）基于葡萄全基因组序列信息，随机挑选分布在葡萄1-19号染色体上的SSR位点，其挑选的位点数量与葡萄品种样本量呈正相关，根据SSR位点选取上下游各100bp设计候选的SSR引物；
（2）采集待构建品种鉴定图的葡萄品种资源嫩叶作为植物材料，提取样品基因组DNA；
（3）随机选取8-10个样品的基因组DNA对步骤（1）得到的SSR引物进行PCR扩增，根据指纹质量从中筛选出条带稳定、清晰的SSR引物，筛选出的引物如SEQ ID No:1~30所示；
（4）以样品基因组DNA为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
（5）将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
（6）将目标多态性条带统计结果形成1/0矩阵，利用邻接法进行聚类分析，分成小类群；
（7）以各小类群中葡萄品种资源的基因组DNA为模板，再利用如SEQ ID No:11~30所示的部分SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物，并重复步骤（5）；
（8）每个小类群的引物多态性条带统计结果用于构建其相对应的品种鉴定图，作为精准鉴定各小类群所包含品种的参考依据：首先利用步骤（7）中的第一对引物扩增的多态性条带对每一小类群品种进行区分，并将该引物代码标注到分类的支线上，同时将目标条带的有、无以及大小分别标注到有带、无带品种群的两条分支线上；利用步骤（7）中的第二对引物对尚未区分的品种进一步分类，依次进行区分直至所有品种分开。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，待检测葡萄品种样品基因组DNA提取方法为CTAB法。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）、（4）、（7）中，PCR扩增体系以10μL计，具体为：ddH2O 2μL，2×Taq Master Mix 5μL，20ng/μL模板DNA 1μL，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，凝胶电泳采用8%聚丙烯酰胺凝胶，所述8%聚丙烯酰胺凝胶配制以50.42mL计，具体为：ddH2O 30mL，30%制胶液15mL，10×TBE 5mL，10%AP 380μL，TEMED 40μL；8%聚丙烯酰胺凝胶电泳程序具体为：电压200V，电流400mA，时间1.3h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中用于聚类分析的SSR引物数量不超过6对，步骤（6）中聚类分析后分成的各小类群内品种数量不超过30份。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，将目标多态性条带统计结果形成1/0矩阵，将矩阵信息按NTSYSpc2.10e软件要求格式生成数据文件并导入软件，计算各葡萄样品间的相似性，并获得葡萄样品的距离矩阵，随后将距离矩阵导入MEGA7.0.14软件，以邻接法进行遗传相似聚类，绘制聚类图，从而将大样本分割成多个小类群。
8.权利要求1-7任一所述的方法，在如下任一中的应用：
（A1）葡萄品种鉴定图的构建；
（A2）葡萄品种真伪辨别；
（A3）葡萄混淆材料的区分；
（A4）葡萄未知品种送样材料的检测。
9.一种葡萄品种真伪辨别的方法，其特征在于，利用权利要求1所述方法构建得到的品种鉴定图进行辨别，具体包括如下步骤：
步骤1，以待检测样品基因组DNA为模板，利用如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行PCR扩增，获得扩增产物，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况，将目标多态性条带统计结果并入葡萄品种资源1/0矩阵中，利用邻接法聚类，获得待检测样品所在的小类群；
步骤2，若待检测样品属于其品种名所在的小类群，以其基因组DNA为模板，利用其对应小类群品种鉴定图构建时所使用的引物进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤3，根据其多态性条带的统计信息与矩阵中对应品种的1/0信息对比，若相同，则待检测样品为真实品种，否则不属于该品种；
步骤4，若待检测样品不在其品种名所在的小类群，则该待检测样品不属于该品种。
10.一种葡萄混淆材料的区分方法，其特征在于，利用权利要求1所述方法构建得到的品种鉴定图进行辨别，具体如下：
（B1）若混淆材料的品种名属于同一小类群：
步骤1，在该小类群的品种鉴定图上找出待检测品种的差异分支点，确认差异区分时所利用的SSR引物及目标多态性条带信息；
步骤2，以待检测样品的基因组DNA为模板，利用该SSR引物进行PCR扩增，获得PCR产物，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤3，根据差异位点多态性条带的统计信息即可正确区分两个或多个混淆样本；
（B2）若混淆材料的品种名属于不同小类群，
步骤1，以待检测样品的基因组DNA为模板与用于聚类的如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行PCR扩增，获得PCR产物，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤2，将目标条带统计结果并入葡萄品种资源1/0矩阵中，利用邻接法聚类，确定各待检测样品所属小类群，即可区分两个待检测的混淆样品；多个混淆样品进行区分时，如出现两个以上品种聚类到同一小类群时，重复（B1）中的步骤1-3即可。
11.一种葡萄未知品种送样材料的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述方法构建得到的品种鉴定图进行检测，具体如下：
步骤1，提取待检测样品的基因组DNA，利用如SEQ ID No:1~10所示的SSR引物进行扩增，将获得的扩增产物进行凝胶电泳检测并统计目标多态性条带情况；
步骤2，将目标条带统计结果并入葡萄品种资源1/0矩阵中，利用邻接法聚类，确定待检测样品所属小类群；
步骤3，利用其对应小类群的品种鉴定图构建时所使用引物进行PCR扩增，并进行凝胶电泳检测，统计目标多态性条带情况；
步骤4，根据多态性条带对比其对应品种鉴定图信息，即可鉴定出待检测样品的真实品种。
12. 引物组合，所述引物组合由15对引物组成，所述引物序列如SEQ ID No:1~30所示。
13.一种用于葡萄品种资源鉴定的试剂，其特征在于，含有权利要求12所述的引物组合。
14.一种用于葡萄品种资源鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求12所述的引物组合或含有权利要求13所述的试剂。
15.权利要求12所述的引物组合，权利要求13所述的试剂，权利要求14所述的试剂盒在如下任一中的应用：
（C1）葡萄品种鉴定图的构建；
（C2）葡萄品种真伪辨别；
（C3）葡萄混淆材料的区分；
（C4）葡萄未知品种送样材料的检测。
CN202410288373.7A 2024-03-14 2024-03-14 一种葡萄品种的鉴定方法 Active CN117887894B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410288373.7A CN117887894B (zh) 2024-03-14 2024-03-14 一种葡萄品种的鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410288373.7A CN117887894B (zh) 2024-03-14 2024-03-14 一种葡萄品种的鉴定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117887894A true CN117887894A (zh) 2024-04-16
CN117887894B CN117887894B (zh) 2024-07-19

Family

ID=90647225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410288373.7A Active CN117887894B (zh) 2024-03-14 2024-03-14 一种葡萄品种的鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117887894B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277444A (zh) * 2011-09-19 2011-12-14 南京农业大学 一种利用rapd快速区分葡萄品种的方法
KR20130078111A (ko) * 2011-12-30 2013-07-10 대한민국(농촌진흥청장) 포도의 품종 판별용 스카 마커 및 이의 용도
KR101976974B1 (ko) * 2018-01-05 2019-05-09 가톨릭대학교 산학협력단 포도 품종 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도
KR102052428B1 (ko) * 2018-12-21 2019-12-06 가톨릭대학교 산학협력단 머루 자원 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도
US20210040552A1 (en) * 2019-07-12 2021-02-11 Institute of Horticulture Research, Anhui Academy of Agricultural Science Development of simple sequence repeat (ssr) core primer group based on whole genome sequence of pomegranate and application thereof
CN112592998A (zh) * 2020-12-22 2021-04-02 中国农业科学院郑州果树研究所 一种用于葡萄dna指纹图谱库构建的kasp引物组合及应用
CN113444827A (zh) * 2021-06-25 2021-09-28 山东大丰园农业有限公司 葡萄品种特异性分子标记及其筛选方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277444A (zh) * 2011-09-19 2011-12-14 南京农业大学 一种利用rapd快速区分葡萄品种的方法
KR20130078111A (ko) * 2011-12-30 2013-07-10 대한민국(농촌진흥청장) 포도의 품종 판별용 스카 마커 및 이의 용도
KR101976974B1 (ko) * 2018-01-05 2019-05-09 가톨릭대학교 산학협력단 포도 품종 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도
KR102052428B1 (ko) * 2018-12-21 2019-12-06 가톨릭대학교 산학협력단 머루 자원 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도
US20210040552A1 (en) * 2019-07-12 2021-02-11 Institute of Horticulture Research, Anhui Academy of Agricultural Science Development of simple sequence repeat (ssr) core primer group based on whole genome sequence of pomegranate and application thereof
CN112592998A (zh) * 2020-12-22 2021-04-02 中国农业科学院郑州果树研究所 一种用于葡萄dna指纹图谱库构建的kasp引物组合及应用
CN113444827A (zh) * 2021-06-25 2021-09-28 山东大丰园农业有限公司 葡萄品种特异性分子标记及其筛选方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAN PEI 等: "Characterization of Simple Sequence Repeat (SSR) Markers Mined in Whole Grape Genomes", GENES, vol. 14, no. 3, 7 March 2023 (2023-03-07), pages 1 - 14 *
宪立杰 等: "葡萄种质遗传多样性的SSR分析及指纹库构建", 北方园艺, no. 11, 15 June 2013 (2013-06-15), pages 87 - 90 *
王富强 等: "葡萄品种SSR分子鉴定体系的建立及应用", 果树学报, vol. 37, no. 9, 13 November 2020 (2020-11-13), pages 1281 - 1293 *
郭印山 等: "基于SSR分子标记的葡萄品种遗传多样性分析", 北方园艺, no. 07, 15 April 2016 (2016-04-15), pages 89 - 92 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117887894B (zh) 2024-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104532359A (zh) 玉米DNA指纹库构建及品种分子鉴定SNP核心位点组合-maizeSNP384
CN105177150B (zh) 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
CN112029896A (zh) 一种基于环境dna技术检测大型水生植物多样性的方法
CN111808983B (zh) 橡胶树品种标准dna指纹图谱库及其构建方法与专用引物
CN117004756A (zh) 用于桂花品种鉴定的mnp标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用
CN107164530B (zh) 一种用于对不同银杏进行基因分型的snp引物及检测方法
CN111424110A (zh) 一种鉴别皂荚的试剂盒及鉴别和定量方法
CN108517368A (zh) 利用上位性解析毛白杨LncRNA Pto-CRTG及其靶基因Pto-CAD5互作关系的方法及系统
CN106591447B (zh) 一种单细胞全基因组的测序方法
CN101818199A (zh) 一种鉴定春兰品种的方法
CN117887894B (zh) 一种葡萄品种的鉴定方法
WO2023087788A1 (zh) 一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性蛋白含量指标的dna条形码
WO2023087791A1 (zh) 一种识别黄绿卷毛菇原产地的dna条形码、引物组及应用
WO2023087784A1 (zh) 一种筛选黄绿卷毛菇总多酚含量指标的dna条形码
CN113789407B (zh) 一种用于油莎豆基因分型的snp分子标记组合及其应用
CN116656853A (zh) 一种基于ssr分子标记构建百香果指纹图谱的方法及应用
CN109666758A (zh) 基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法
CN104212898B (zh) 一种大批量开发苎麻基因组snp标记的方法及其开发的引物
CN105631245A (zh) 一种用于鉴定美洲黑杨优良无性系的专用引物及其鉴定方法
CN102108393A (zh) 青菜杂交种dna指纹图谱的建立方法及应用
CN105132420B (zh) 一种鉴定玉米品种纯度的成套引物及应用
CN106282398B (zh) 柑橘炭疽病菌和柑橘脚腐病菌双重检测试剂盒及其应用
CN104573409A (zh) 基因定位的多重检验方法
CN117757979B (zh) 一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法
CN116179740B (zh) 一种用于薏苡品种鉴定的ssr引物组合及其鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant