CN105132420B

CN105132420B - 一种鉴定玉米品种纯度的成套引物及应用

Info

Publication number: CN105132420B
Application number: CN201510613500.7A
Authority: CN
Inventors: 王凤格; 易红梅; 葛建镕; 王璐; 任洁; 杨扬
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2018-02-13
Anticipated expiration: 2035-09-23
Also published as: CN105132420A

Abstract

本发明提供了一种鉴定玉米品种纯度的成套引物及应用。本发明的成套引物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8组成。通过实验证明：本发明的成套引物具有杂合度高、品种识别率高、检测效率高和检测成本低等特点，能快速、准确的获得种子纯度鉴定结果。在对玉米单交种进行纯度鉴定时无需再做品种纯度鉴定引物的筛选工作及小样本实验等步骤，而且该成套引物不再局限于只能鉴定个别品种纯度，可适用于国内绝大部分品种纯度快速鉴定。

Description

一种鉴定玉米品种纯度的成套引物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定玉米品种纯度的成套引物及应用。

背景技术

玉米目前是全球第一大作物，也已跃升为我国第一大作物。玉米产量的提高主要得益于杂种优势的利用及优良杂交种的普及。而优良杂交种的推广应用需要大量优质的种子。种子的品种纯度是评价种子质量的最重要的指标之一。近年来据市场统计，玉米种子纯度在国家标准以下每下降1％，将造成减产214kg/hm，即3％左右。目前品种纯度鉴定主要有传统种植形态学鉴定法、同功酶和种子贮藏蛋白、分子标记纯度鉴定方法。

传统种植鉴定方法种植周期长、费用高，同功酶和种子贮藏蛋白鉴定法实验结果随发育时期、取样部位和环境条件而变化，而且同功酶和种子贮藏蛋白法对于亲缘关系较近的材料没有区分能力，使得这两种方法在品种纯度鉴定应用上受到一定的限制。SSR标记具有快速、准确，信息含量高、呈共显性遗传、易于分析、重复可靠等特点，为品种纯度鉴定提供了准确、可靠、快速、方便的方法。

SSR引物的选择直接影响到SSR纯度鉴定结果的准确性和可重复性，对于承担委托检验及市场鉴定抽查检验的种子检测中心，在进行纯度鉴定时，在不了解制种亲本一致性、制种隔离条件等情况下，要获得准确的纯度鉴定结果需要进行引物筛选、小样本实验等繁琐步骤，不能满足纯度快速鉴定的需要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定玉米品种纯度的成套引物。

本发明提供的鉴定玉米品种纯度的成套引物为由引物对(1)-(8)组成：

(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成的引物对1；

(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA分子和SEQ ID No.4所示的单链DNA分子组成的引物对2；

(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA分子和SEQ ID No.6所示的单链DNA分子组成的引物对3；

(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA分子和SEQ ID No.8所示的单链DNA分子组成的引物对4；

(5)为由SEQ ID No.9所示的单链DNA分子和SEQ ID No.10所示的单链DNA分子组成的引物对5；

(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA分子和SEQ ID No.12所示的单链DNA分子组成的引物对6；

(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA分子和SEQ ID No.14所示的单链DNA分子组成的引物对7；

(8)为由SEQ ID No.15所示的单链DNA分子和SEQ ID No.16所示的单链DNA分子组成的引物对8。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定玉米品种纯度的PCR试剂组。

本发明提供的鉴定玉米品种纯度的PCR试剂组由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7和PCR试剂8组成；

所述PCR试剂1包括上述成套引物中的引物对1；

所述PCR试剂2包括上述成套引物中的引物对2；

所述PCR试剂3包括上述成套引物中的引物对3；

所述PCR试剂4包括上述成套引物中的引物对4；

所述PCR试剂5包括上述成套引物中的引物对5；

所述PCR试剂6包括上述成套引物中的引物对6；

所述PCR试剂7包括上述成套引物中的引物对7；

所述PCR试剂8包括上述成套引物中的引物对8。

上述PCR试剂组中，每个所述引物对中的各条引物的物质的量相同。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定玉米品种纯度的试剂盒。

本发明提供的鉴定玉米品种纯度的试剂盒包括上述成套引物或上述PCR试剂组。

上述成套引物或上述PCR试剂组或上述试剂盒在鉴定玉米品种纯度中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述玉米品种为郑单958、先玉335、浚单20、鲁单981、金海5号、中科11、蠡玉16、中单909、登海605、伟科702、京科968、东单80、农华101、德美亚1号、京科糯2000、KWS2564、良玉88号或龙单59。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴定待测玉米品种纯度的方法。

本发明提供的鉴定待测玉米品种纯度的方法包括如下步骤：

1)用上述成套引物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8分别对待测玉米的籽粒群中每个个体进行PCR扩增，分别得到引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8对应的PCR扩增产物；电泳检测所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8对应的PCR扩增产物；

若所述籽粒群中某个个体的PCR扩增产物满足如下条件：所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8对应的PCR扩增产物带型均为目标品种的特征带型，则该个体为或候选为目标品种；

若所述籽粒群中某个个体的PCR扩增产物不满足上述条件，则该个体为或候选为非目标品种；

2)用如下公式计算所述待测玉米品种纯度：

品种纯度＝待测玉米的籽粒群中属于目标品种的个体数/待测玉米的籽粒群个体数×100％。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测玉米品种的基因组DNA。

上述方法中，所述目标品种为郑单958或先玉335。

上述方法中，若所述目标品种为郑单958时，

所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为322bp和354bp的DNA片段；

所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为364bp和380bp的DNA片段；

所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为202bp和213bp的DNA片段；

所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为221bp和237bp的DNA片段；

所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为393bp和413bp的DNA片段；

所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为185bp的DNA片段；

所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为266bp的DNA片段；

所述引物对8的PCR扩增产物含有大小为265bp和269bp的DNA片段；

若所述目标品种为先玉335时，

所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为350bp的DNA片段；

所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为364bp和382bp的DNA片段；

所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为191bp和208bp的DNA片段；

所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为237bp的DNA片段；

所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为408bp和413bp的DNA片段；

所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为185bp和190bp的DNA片段；

所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为253bp和267bp的DNA片段；

所述引物对8的PCR扩增产物含有大小为263bp和275bp的DNA片段。

本发明建立了一套适用于目前国内审定推广品种纯度鉴定引物组合，在进行玉米品种纯度鉴定时，只需要8个引物组成的成套引物直接进行品种纯度鉴定，而且鉴定结果准确、稳定。通过实验证明：本发明的成套引物具有杂合度高、品种识别率高、检测效率高和检测成本低等特点，能快速、准确的获得种子纯度鉴定结果。在对玉米单交种进行纯度鉴定时无需再做品种纯度鉴定引物的筛选工作及小样本实验等步骤，而且该成套引物不再局限于只能鉴定个别品种纯度，可适用于国内绝大部分品种纯度快速鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴定玉米品种纯度的成套引物

一、鉴定玉米品种纯度的成套引物的筛选

本发明以表1所示的能代表目前我国玉米杂交种的遗传背景和遗传多样性的276份国家审定品种标准样品及292份具有代表性的自交系品种的基因组DNA为模板，采用DNA快速碱煮法及表2所示的40对引物进行PCR扩增，并综合40对引物的杂合率、累计识别能力及40对引物的扩增效果和扩增产物带型等情况，最终筛选了如下8对用于鉴定玉米品种纯度的成套引物：

bnlg439w1(引物对1)：上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC(SEQ ID No.1)；下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC(SEQ ID No.2)；

bnlg249K2(引物对2)：上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG(SEQ ID No.3)；下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAG(SEQ ID No.4)；

bnlg2291k4(引物对3)：上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG(SEQ ID No.5)；下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCC(SEQ ID No.6)；

umc1545y2(引物对4)：上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC(SEQ ID No.7)；下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT(SEQ ID No.8)；

umc1506k12(引物对5)：上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG；(SEQ ID No.9)；下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACAC(SEQ ID No.10)；

bnlg240k1(引物对6)：上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC(SEQ ID No.11)；下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC(SEQ ID No.12)；

phi96100y1(引物对7)：上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG(SEQ ID No.13)；下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCC(SEQ ID No.14)；

phi065k9(引物对8)：上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC(SEQ ID No.15)；下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACC(SEQ ID No.16)。

上述引物序列的信息如表3所示。

表1、276份玉米审定品种及292份玉米自交系信息来源

表2、40对引物信息

表3、纯度鉴定入选的8个引物

实施例2、成套引物在鉴定玉米品种纯度中的应用

一、成套引物在国内主推玉米品种的DNA指纹图谱

采用实施例1的成套引物分别对表4中的18个国内主推玉米品种(郑单958、先玉335、浚单20、鲁单981、金海5号、中科11、蠡玉16、中单909、登海605、伟科702、京科968、东单80、农华101、德美亚1号、京科糯2000、KWS2564、良玉88、龙单59，上述品种公众均可从北京市农林科学院获得)的DNA指纹片段大小进行检测。具体步骤如下：

1、DNA的提取

采用碱裂解法分别提取表4中的18个国内主推玉米品种的基因组DNA。

2、PCR的扩增

分别以步骤1获得的18个国内主推玉米品种的基因组DNA为模板，采用实施例1的成套引物(bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、bnlg240k1、phi96100y1和phi065k9)分别进行PCR扩增，得到8种PCR扩增产物。

PCR扩增的反应体系：DNA模板2μL、ddH₂O 14.35μL、10×Buffer(2.5mmol/L MgCl₂)2μL、dNTP(10mmol/L)1.2μL、5U/μL Taq DNA Enzyme0.2μL、引物0.25μL。反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

3、电泳检测

采用ABI3730XL荧光标记毛细管电泳检测法分别检测步骤2获得的扩增产物。

4、数据分析

成套引物组对国内18个主推玉米品种的DNA指纹分析的结果如表4所示：从表4中可以看出：18个主推玉米品种中，2个品种(KWS2564和德美亚1号)在成套引物组中的所有8个SSR位点上均为杂合带型，3个品种(登海605、伟科702和东单80)在成套引物组中的7个SSR位点上均为杂合带型，9个品种(郑单958、先玉335、浚单20、中科11、蠡玉16、中单909、京科968、京科糯2000、龙单59)在成套引物组中的6个SSR位点上均为杂合带型，1个品种(鲁单981)在成套引物组中的5个SSR位点上均为杂合带型，3个品种(金海5号、农华101和良玉88号)在成套引物组中的4个SSR位点上均为杂合带型。说明本发明的成套引物在国内绝大部分品种中的杂合度较高，可适用于玉米品种纯度的鉴定。

表4、国内18个主推品种在成套引物组上的DNA指纹图谱

注：表中字体加粗表示品种在该位点为杂合带型

二、成套引物在鉴定郑单958品种纯度中的应用

采用实施例1的成套引物对某批次郑单958样品进行纯度鉴定。具体步骤如下：

1、DNA的提取

采用碱裂解法分别提取100粒郑单958种子的DNA。

2、PCR的扩增

以步骤1的100粒郑单958种子的DNA为模板，采用实施例1的成套引物(bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、bnlg240k1、phi96100y1和phi065k9)分别进行PCR扩增，得到8种PCR扩增产物。

3、电泳检测

采用ABI3730XL荧光标记毛细管电泳检测法检测步骤2获得的扩增产物。

4、数据分析

郑单958在bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、bnlg240k1、phi96100y1和phi065k9引物上的指纹(片段大小)如表5所示，8个引物中共计6个引物(bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、bnlg240k1、phi065k9)为杂合带型，该6个引物(bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、bnlg240k1、phi065k9)可用于100粒郑单958种子的纯度鉴定。纯度计算公式：品种纯度＝待测玉米品种个数/待测玉米的籽粒群个体数×100％。其中，待测玉米品种个数＝待测玉米的籽粒群个体数-非供检品种粒数，非供检品种粒数包括自交苗和杂株的个数。

表5、郑单958在8个引物位点上的指纹

引物编号	引物名称	指纹片段大小(bp)
			P01	bnlg439w1	322/354
P08	bnlg2291k4	364/380
			P13	umc1545y2	202/213
P15	bnlg240k1	221/237
			P17	phi065k9	393/413
P20	umc1506k12	185/185
			P23	phi96100y1	266/266
P31	bnlg249K2	265/269

郑单958种子的纯度鉴定结果如表6所示：从表中可以看出：100粒种子中，共有2个自交苗和2个杂株。本实施例的供检品种为郑单958，待测玉米的籽粒群个体数为100，非供检品种粒数为4，根据纯度计算公式，该批次郑单958种子纯度为96％。说明本发明的成套引物可以有效的鉴定玉米品种纯度。

表6、郑单958纯度鉴定结果

(注：P(仅双带中的一条带)代表自交苗；Q(有非双带的带型)代表杂株；空格(正常双带)代表正常)

二、成套引物在鉴定先玉335品种纯度中的应用

采用实施例1的成套引物对某批次先玉335样品进行纯度鉴定。具体步骤如下：

1、DNA的提取

采用碱裂解法分别提取100粒先玉335种子的DNA。

2、PCR的扩增

以步骤1的100粒先玉335种子的DNA为模板，采用实施例1的成套引物(bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、bnlg240k1、phi96100y1和phi065k9)分别进行PCR扩增，得到8种PCR扩增产物。

3、电泳检测

4、数据分析

先玉335在bnlg439w1、bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、bnlg240k1、phi96100y1、phi065k9引物上的指纹(片段大小)如表7所示，8个引物中共计6个引物(bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、phi96100y1、phi065k9)为杂合带型，该6个引物(bnlg249K2、bnlg2291k4、umc1545y2、umc1506k12、phi96100y1、phi065k9)可用于100粒先玉335种子的纯度鉴定。纯度计算公式：品种纯度＝待测玉米品种个数/待测玉米的籽粒群个体数×100％。其中，待测玉米品种个数＝待测玉米的籽粒群个体数-非供检品种粒数，非供检品种粒数包括自交苗和杂株的个数。

表7、先玉335在8个引物位点上的指纹

引物编号	引物名称	指纹片段大小(bp)
			P01	bnlg439w1	350/350
P08	bnlg2291k4	364/382

P13	umc1545y2	191/208
			P15	bnlg240k1	237/237
P17	phi065k9	408/413
			P20	umc1506k12	185/190
P23	phi96100y1	253/267
			P31	bnlg249K2	263/275

先玉335种子的纯度鉴定结果如表8所示：从表中可以看出：100粒种子中，共有1个自交苗和1个杂株。本实施例的供检品种为先玉335，待测玉米的籽粒群个体数为100，非供检品种粒数为2，根据纯度计算公式，该批次先玉335种子纯度为98％。说明本发明的成套引物可以有效的鉴定玉米品种纯度。

表8、先玉335纯度鉴定结果

(注：自交苗代号P(仅双带中的一条带)；杂株带型Q(有非双带的带型)；正常带型(正常双带)为空格) 。

Claims

1.一种鉴定玉米品种纯度的成套引物，为由引物对（1）-（8）组成：

（1）为由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成的引物对1；

（2）为由SEQ ID No.3所示的单链DNA分子和SEQ ID No.4所示的单链DNA分子组成的引物对2；

（3）为由SEQ ID No.5所示的单链DNA分子和SEQ ID No.6所示的单链DNA分子组成的引物对3；

（4）为由SEQ ID No.7所示的单链DNA分子和SEQ ID No.8所示的单链DNA分子组成的引物对4；

（5）为由SEQ ID No.9所示的单链DNA分子和SEQ ID No.10所示的单链DNA分子组成的引物对5；

（6）为由SEQ ID No.11所示的单链DNA分子和SEQ ID No.12所示的单链DNA分子组成的引物对6；

（7）为由SEQ ID No.13所示的单链DNA分子和SEQ ID No.14所示的单链DNA分子组成的引物对7；

（8）为由SEQ ID No.15所示的单链DNA分子和SEQ ID No.16所示的单链DNA分子组成的引物对8。

2.一种鉴定玉米品种纯度的PCR试剂组，由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7 和PCR试剂8组成；

所述PCR试剂1包括权利要求1所述成套引物中的引物对1；

所述PCR试剂2包括权利要求1所述成套引物中的引物对2；

所述PCR试剂3包括权利要求1所述成套引物中的引物对3；

所述PCR试剂4包括权利要求1所述成套引物中的引物对4；

所述PCR试剂5包括权利要求1所述成套引物中的引物对5；

所述PCR试剂6包括权利要求1所述成套引物中的引物对6；

所述PCR试剂7包括权利要求1所述成套引物中的引物对7；

所述PCR试剂8包括权利要求1所述成套引物中的引物对8。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂组，其特征在于：每个所述引物对中的各条引物的物质的量相同。

4.一种鉴定玉米品种纯度的试剂盒，包括权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂组。

5.权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒在鉴定玉米品种纯度中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述玉米品种为郑单958、先玉335、浚单20、鲁单981、金海5号、中科11、蠡玉16、中单909、登海605、伟科702、京科968、东单80、农华101、德美亚1号、京科糯2000、KWS2564、良玉88号或龙单59。

7.一种鉴定待测玉米品种纯度的方法，包括如下步骤：

1）用权利要求1所述的成套引物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8分别对待测玉米的籽粒群中每个个体进行PCR扩增，分别得到引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8对应的PCR扩增产物；电泳检测所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8对应的PCR扩增产物；

2）用如下公式计算所述待测玉米品种纯度：

品种纯度=待测玉米的籽粒群中属于目标品种的个体数/待测玉米的籽粒群个体数×100%。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测玉米品种的基因组DNA。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目标品种为郑单958或先玉335。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：

若所述目标品种为郑单958时，所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为322 bp和354bp的DNA片段；

所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为364 bp和380 bp的DNA片段；

所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为202 bp和213 bp的DNA片段；

所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为221 bp和237 bp的DNA片段；

所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为393 bp和413 bp的DNA片段；

所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为185 bp的DNA片段；

所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为266 bp的DNA片段；

所述引物对8的PCR扩增产物含有大小为265 bp和269 bp的DNA片段；

若所述目标品种为先玉335时，所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为350 bp的DNA片段；

所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为364bp和382bp 的DNA片段；

所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为191 bp和208bp的DNA片段；

所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为237 bp的DNA片段；

所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为408 bp和413 bp的DNA片段；

所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为185 bp和190 bp的DNA片段；

所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为253 bp和267 bp的DNA片段；

所述引物对8的PCR扩增产物含有大小为263 bp和275 bp的DNA片段。