CN105018630B - 一种鉴定玉米品种的pcr方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定玉米品种的PCR方法及其应用。包括如下步骤：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性2s，60℃退火15s，72℃延伸2s，共35个循环；72℃延伸2min。通过实验证明：本发明的快速PCR方法无需专用的快速PCR试剂，通过耶拿SpeedCycler 2 PCR仪即可快速实现对玉米品种的鉴定。

Description

一种鉴定玉米品种的PCR方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定玉米品种的PCR方法及其应用。
背景技术
PCR技术发明至今已有二十多年的时间，用于PCR实验的仪器不断的推陈出新，但运行一个完整的PCR实验一般为2～3个小时，PCR实验运行时间过长的问题始终困扰着研究人员。快速PCR这一概念是由美国犹他大学的Carl Wittwer教授等人在二十世纪九十年代提出的，快速PCR可以在很短时间内(30分钟左右)完成扩增实验，大大节省实验时间，提高工作效率和仪器使用率。更重要的是由于高速的升降温速率使退火停留的时间更短，这样引物便可在极短的时间内与模板特异结合，最终获得高特性、高质量的PCR产物。
玉米品种的DNA鉴定需要经过DNA提取、PCR扩增和电泳检测等步骤。目前DNA提取、电泳等步骤都得到了优化，采用快速碱煮DNA提取法，20分钟可以得到适用于玉米品种纯度鉴定的DNA，采用荧光毛细管电泳可以在30分钟内得到样品的数据。但PCR扩增仍然还需要2～3个小时才能完成。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种玉米DNA片段的PCR扩增方法。
本发明提供的一种玉米DNA片段的PCR扩增方法包括如下步骤：对玉米DNA片段进行PCR扩增，得到玉米DNA片段的PCR扩增产物；
所述PCR扩增的反应程序：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性2s，60℃退火15s，72℃延伸2s，共35个循环；72℃延伸2min。
上述方法中，所述PCR扩增是在耶拿SpeedCycler 2PCR仪上进行的。
上述方法中，所述PCR扩增的引物为如下(1)-(10)中任一种：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7；
(8)为由SEQ ID No.15所示的单链DNA和SEQ ID No.16所示的单链DNA组成的引物对8；
(9)为由SEQ ID No.17所示的单链DNA和SEQ ID No.18所示的单链DNA组成的引物对9；
(10)为由SEQ ID No.19所示的单链DNA和SEQ ID No.20所示的单链DNA组成的引物对10。
上述方法中，所述玉米的品种为郑单958和/或先玉335。
上述方法在区别不同玉米品种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种区分玉米品种的方法。
本发明提供的区分玉米品种的方法包括如下步骤：
1)用上述方法中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10分别对待测玉米A和待测玉米B分别进行PCR扩增，得到待测玉米A的10种PCR扩增产物和待测玉米B的10种PCR扩增产物；
所述PCR扩增的反应程序：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性2s，60℃退火15s，72℃延伸2s，共35个循环；72℃延伸2min；
2)检测所述待测玉米A的10种PCR扩增产物和所述待测玉米B的10种PCR扩增产物，比对所述待测玉米A和所述待测玉米B的10种PCR扩增产物来区分玉米品种。
上述方法中，所述PCR扩增是在耶拿SpeedCycler 2PCR仪上进行的。
上述方法中，2)为电泳检测所述待测玉米A的10种PCR扩增产物和所述待测玉米B的10种PCR扩增产物，比对所述待测玉米A和所述待测玉米B的电泳图谱来区分玉米品种。
上述方法中，所述待测玉米A为郑单958；所述待测玉米B为先玉335。
本发明提供了一种鉴定玉米品种的PCR方法，包括如下步骤：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性2s，60℃退火15s，72℃延伸2s，共35个循环；72℃延伸2min。本发明提供的方法采用常规的PCR试剂，通过耶拿SpeedCycler 2PCR仪即可快速实现对玉米品种的鉴定，在原有的玉米品种鉴定标准化PCR程序基础上，大大缩短PCR反应程序各环节的时间，建立适用于玉米品种鉴定的快速PCR方法。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的SpeedCycler 2快速PCR仪是德国耶拿公司的产品。
实施例1、鉴定玉米品种的快速PCR方法
一、PCR扩增
1、DNA提取
分别提取郑单958和先玉335的基因组DNA。
2、PCR扩增
以步骤1获得的郑单958和先玉335的基因组DNA为模板，采用表1中的10对引物分别对郑单958和先玉335样品的基因组DNA进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。PCR扩增程序分别采用常规的PCR程序和快速PCR程序(表2)。
PCR扩增的反应体系均如下所示：DNA模板2μL、ddH2O 14.35μL、10×Buffer(2.5mmol/L MgCl2)2μL、dNTP(10mmol/L)1.2μL、5U/μL Taq DNA Enzyme 0.2μL、Primer0.25μL。PCR试剂为常规的PCR试剂，无需专用快速PCR试剂。
表1、引物信息
表2、常规的PCR程序和快速PCR程序
3、检测PCR产物：采用ABI3730XL荧光标记毛细管电泳检测PCR产物。
二、结果检测
常规的PCR程序和快速PCR程序对同一样品的扩增结果相同，采用常规的PCR程序和快速PCR程序得到的郑单958和先玉335在10对引物对的PCR扩增产物的毛细管电泳的检测结果均如表3所示：从表3中可以看出：采用常规的PCR程序和快速PCR程序得到的郑单958和先玉335的9个引物对(P01、P02、P03、P04、P05、P06、P08、P09和P10)的PCR扩增产物大小均有差异(只有P07引物在郑单958和先玉335上的PCR扩增产物相同)，例如：P01引物对郑单958的扩增产物含有322bp和354bp大小的两条带，而对先玉335上仅含有大小为350bp的一条带，与郑单958和先玉335为不同品种的结果相符，说明采用常规的PCR程序和快速PCR程序均可鉴定郑单958和先玉335。但常规PCR程序的扩增时间为85min；快速PCR程序的扩增时间仅为15min，和常规方法相比，节省了70min，因此本发明的快速PCR程序可快速、准确的鉴定玉米品种。
表3、郑单958、先玉335两个品种10个引物的毛细管电泳的检测结果

Claims (6)

1.一种玉米DNA片段的PCR扩增方法，包括如下步骤：对玉米DNA片段进行PCR扩增，得到玉米DNA片段的PCR扩增产物；
所述PCR扩增的反应程序：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性2s，60℃退火15s，72℃延伸2s，共35个循环；72℃延伸2min；
所述PCR扩增的引物为如下(1)-(9)中任一种：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.15所示的单链DNA和SEQ ID No.16所示的单链DNA组成的引物对8；
(8)为由SEQ ID No.17所示的单链DNA和SEQ ID No.18所示的单链DNA组成的引物对9；
(9)为由SEQ ID No.19所示的单链DNA和SEQ ID No.20所示的单链DNA组成的引物对10；
所述玉米的品种为郑单958和/或先玉335。
2.根据权利要求1所述的PCR扩增方法，其特征在于：所述PCR扩增是在耶拿SpeedCycler 2PCR仪上进行的。
3.权利要求1所述的PCR扩增方法在区别不同玉米品种中的应用。
4.一种区分玉米品种的方法，包括如下步骤：
1)用权利要求1所述的方法中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对8、引物对9和引物对10分别对待测玉米A和待测玉米B分别进行PCR扩增，得到待测玉米A的9种PCR扩增产物和待测玉米B的9种PCR扩增产物；
所述PCR扩增的反应程序：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性2s，60℃退火15s，72℃延伸2s，共35个循环；72℃延伸2min；
2)检测所述待测玉米A的9种PCR扩增产物和所述待测玉米B的9种PCR扩增产物，比对所述待测玉米A和所述待测玉米B的9种PCR扩增产物来区分玉米品种；
所述待测玉米A为郑单958；所述待测玉米B为先玉335。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增是在耶拿SpeedCycler 2PCR仪上进行的。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：2)为电泳检测所述待测玉米A的9种PCR扩增产物和所述待测玉米B的9种PCR扩增产物，比对所述待测玉米A和所述待测玉米B的电泳图谱来区分玉米品种。
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