CN102653790A - 苹果种质资源改良tp-m13-ssr分子标记方法 - Google Patents

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王昆
高源�
龚欣
刘立军
王大江
刘凤之
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Abstract

本发明提出的是苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法。不同SSR分子标记引物合并到同一体系，并将两次PCR程序合并为一次，减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，进一步的提高实验效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色荧光标记的PCR产物可同时在毛细管电泳仪上检测，改良之前一次能够检测384×4共计1536个样品，而现在一次最多可检测384×3×4共计4608个样品，一次可多检测3072个样品。进一步地提高TP-M13-SSR荧光标记分析通量，并且减少了操作步骤，最大限度地减少了因检测流程较多而造成的实验误差。适宜作为苹果种质资源分类的试验应用。

Description

苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法
技术领域
本发明涉及果树分子生物学技术，具体地说是苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法。
背景技术
苹果属(Malus Mill.)种质资源丰富，品种类型多样，包括大量的野生种、半野生种及栽培品种。苹果种质资源的准确鉴定是种质资源保存和利用的前提，以往主要利用形态学观察、同工酶等方法进行鉴定。随着分子生物学技术的发展，其在苹果种质资源的研究中也得到了越来越广泛的应用。
自Litt和Luty首次将SSR技术(simple sequence repeat，即简单序列重复又称微卫星)用于进行人类遗传学研究以来，SSR技术因多态性高、分布广、重复性好、共显性以及成本较低等优点而被广泛应用，也因此而被应用到苹果种质资源的鉴定中。传统的SSR分子标记PCR产物检测采用的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析通量较低、扩增产物检测流程繁琐、数据记录的工作量过大。而荧光测序技术即毛细管电泳技术在SSR-PCR扩增产物检测上的应用，实现了数据收集和处理的自动化，克服了银染法的不足。但其一个重要限制因素即是其成本过高，一旦实验需要增加另外的SSR位点时，又必须得重新合成新增位点的荧光引物，该技术也仅仅在少量材料和较少位点的研究中应用较多。
TP-M13-SSR分子标记技术是将SSR分子标记技术、荧光测序技术相结合的高通量、低成本的高效、快速、准确的检测方法，如何能将两次PCR程序合并为一次，不同SSR分子标记引物合并到同一体系中，则可减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，并且可以进一步的提高实验效率。
发明内容
为了能够将TP-M13-SSR分子标记技术中不同SSR分子标记引物合并到同一体系中，并能将两次PCR程序合并为一次，尽可能地减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，进一步的提高实验效率。本发明提出了苹果种质资源改良的TP-M13-SSR分子标记技术。
本发明解决技术问题所采用的方案是：
1、提取苹果基因组DNA，并稀释到20 ng/μL。
2、SSR荧光标记反应：
（1）TP-M13-SSR反应体系： 
模板DNA：2.0ul；
Mg2+（25mM）：1.62ul；
TP-M13-SSR引物1：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 
TP-M13-SSR引物2：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul；
TP-M13-SSR引物3：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 
同一荧光标记的M13接头：1.8 ul；
Buffer(10×)：2.25ul；
dNTP(25 mM)：0.18 ul；
Taq(5u/ul)：0.24 ul；
ddH2O：2.95 ul；
Total：15 ul。
（2）PCR程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。不同引物扩增所需要的An.T即退火温度不同，因此需要经过实验确定在同一体系中的三对引物具有相同的退火温度。
三对具有相同退火温度的TP-M13-SSR引物与同一荧光颜色的M13接头在15 ul的反应体系中，采用两套循环的一次PCR反应，在PCR仪上进行扩增，从而实现一次PCR反应三对TP-M13-SSR引物的PCR扩增及同一颜色的荧光标记。
3、TP-M13-SSR标记的荧光检测
TP-M13-SSR扩增产物经过纯化，不同荧光颜色标记的PCR扩增产物（最多四色）在毛细管电泳仪（如ABI3730）上进行毛细管电泳检测。
4、数据分析：
电泳结束后，得到数据利用Genescan和Genotyper两套软件进行分析，自动获取所有数据，最后得到所有样品的毛细管电泳图谱，即SSR指纹图谱，从而完成TP-M13-SSR荧光标记。
积极效果：不同SSR分子标记引物合并到同一体系，并将两次PCR程序合并为一次，减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，进一步的提高实验效率。用96孔PCR板或384孔PCR板，四色荧光标记的PCR产物可同时在毛细管电泳仪上检测，改良之前一次能够检测384×4共计1536个样品，而现在一次最多可检测384×3×4共计4608个样品，一次可多检测3072个样品。进一步地提高TP-M13-SSR荧光标记分析通量，并且减少了操作步骤，最大限度地减少了因检测流程较多而造成的实验误差。
具体实施方式
利用毛细管电泳仪，将毛细管电泳技术和荧光标记技术相结合，不同SSR分子标记引物合并到同一体系，并将两次PCR程序合并为一次，建立改良TP-M13-SSR分子标记方法，其实验流程和具体的实验步骤如下：
1、提取苹果基因组DNA，并稀释到20 ng/μL。
2、SSR荧光标记反应：
（1）TP-M13-SSR反应体系： 
模板DNA：2.0ul；
Mg2+（25mM）：1.62ul；
TP-M13-SSR引物1：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 
TP-M13-SSR引物2：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul；
TP-M13-SSR引物3：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 
同一荧光标记的M13接头：1.8 ul；
Buffer(10×)：2.25ul；
dNTP(25 mM)：0.18 ul；
Taq(5u/ul)：0.24 ul；
ddH2O：2.95 ul；
Total：15 ul。
（2）PCR程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。不同引物扩增所需要的An.T即退火温度不同，因此需要经过实验确定在同一体系中的三对引物具有相同的退火温度。
三对具有相同退火温度的TP-M13-SSR引物与同一荧光颜色的M13接头在15 ul的反应体系中，采用两套循环的一次PCR反应，在PCR仪上进行扩增，从而实现一次PCR反应三对TP-M13-SSR引物的PCR扩增及同一颜色的荧光标记。
3、TP-M13-SSR标记的荧光检测
TP-M13-SSR扩增产物经过纯化，不同荧光颜色标记的PCR扩增产物在毛细管电泳仪上进行毛细管电泳检测。
4、数据分析：
电泳结束后，得到数据利用Genescan和Genotyper两套软件进行分析，自动获取所有数据，最后得到所有样品的毛细管电泳图谱，即SSR指纹图谱，从而完成TP-M13-SSR荧光标记。
至此，一次毛细管电泳可检测四次PCR扩增的产物，即可检测4×3对TP-M13-SSR引物对384×12共计4608个样品进行扩增的荧光标记产物，减少操作步骤，最大限度的减少人为实验误差，进一步的提高实验效率。
基本原理是：把扩增产物片段长度相差较大、但具有相同退火温度的三对TP-M13-SSR引物放到同一PCR体系中，添加具有相同荧光颜色M13接头，采用两套具有不同退火温度的循环一次PCR反应程序进行扩增，经过PCR产物的纯化，利用毛细管电泳仪对其进行荧光检测，自动获取PCR产物数据，同时实现苹果种质资源三对TP-M13-SSR引物的荧光标记和检测。 

Claims (1)

1. 苹果种质资源改良TP-M13-SSR分子标记方法，利用毛细管电泳仪，将毛细管电泳技术和荧光标记技术相结合，不同SSR分子标记引物合并到同一体系，并将两次PCR程序合并为一次，建立改良TP-M13-SSR分子标记方法，其特征是：
实验步骤：
1）、提取苹果基因组DNA，并稀释到20 ng/μL；
2）、SSR荧光标记反应：
（1）TP-M13-SSR反应体系： 
模板DNA：2.0ul；
Mg2+（25mM）：1.62ul；
TP-M13-SSR引物1：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 
TP-M13-SSR引物2：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul；
TP-M13-SSR引物3：P-Primer（2uM）：1.2 ul；F-Primer（2uM）：0.12 ul； 
同一荧光标记的M13接头：1.8 ul；
Buffer(10×)：2.25ul；
dNTP(25 mM)：0.18 ul；
Taq(5u/ul)：0.24 ul；
ddH2O：2.95 ul；
Total：15 ul；
（2）PCR程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16个循环；72℃延伸10 min；4℃保存；不同引物扩增所需要的An.T即退火温度不同，因此需要经过实验确定在同一体系中的三对引物具有相同的退火温度；
三对具有相同退火温度的TP-M13-SSR引物与同一荧光颜色的M13接头在15 ul的反应体系中，采用两套循环的一次PCR反应，在PCR仪上进行扩增，从而实现一次PCR反应三对TP-M13-SSR引物的PCR扩增及同一颜色的荧光标记；
3）、TP-M13-SSR标记的荧光检测：
TP-M13-SSR扩增产物经过纯化，不同荧光颜色标记的PCR扩增产物在毛细管电泳仪上进行毛细管电泳检测；
4）、数据分析：
电泳结束后，得到数据利用Genescan和Genotyper两套软件进行分析，自动获取所有数据，最后得到所有样品的毛细管电泳图谱，即SSR指纹图谱，从而完成TP-M13-SSR荧光标记。
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