CN102041298A - 凝结芽孢杆菌的pcr快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法。首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用;再利用凝结芽孢杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物;然后使用该引物对待测样品增菌液的基因组DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。其加样参数为:每个PCR反应总体积为25μl,包括待测样品增菌液的基因组DNA,2μl;10×PCR Buffer,2.5μl;Mg2+1.5mmol/L;Tag酶1u;dNTP0.1mmol/L;权利要求1中的特异性引物各10pmol;最后加ddH2O至25μl;PCR反应程序为:95℃变性5min;95℃30s,56℃30s,72℃40s,该反应进行35个循环;72℃延伸5min,4℃保存。具有检测速度快、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌的PCR快速检测方法。
背景技术
引起罐头食品酸败变质而又不胖听(即产酸不产气)的微生物在罐头工业上称为平酸菌。它是需氧芽孢杆菌科中的一群高温型,具有嗜热、耐热的特点,其适宜生长温度为45℃~60℃。凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)是造成罐头食品平盖酸败的一种重要微生物。凝结芽孢杆菌同时也是益生素,是近年来国内外迅速崛起的一类微生态制剂,它广泛地应用于医疗、保健、食品、畜牧和水产等行业。因其具有调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平、能够避免服用抗生素带来的耐药性和二重感染等问题的优点,一直受世人瞩目。凝结芽孢杆菌除了具有上述优点外,同时还具有抗逆性强、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性,成为当今研究和应用的热点,也是我国农业部2004年被批准使用的微生物级饲料添加剂品种之一。当前,凝结芽孢杆菌的检测方法主要是传统的增菌培养——纯分离培养——生化鉴定,该方法的缺点是操作繁琐、检测时间长,而且生化鉴定的项目较多。随着人们生活水平的提高,对食品安全的需求越来越高,同时,凝结芽孢杆菌微生态制剂的研制,生产规模的扩大,传统检测方法的低效率已经不能满足当前批量化的检测任务。因而,研究的凝结芽孢杆菌快速检测方法很有必要。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点,是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的不足,提供一种检测速度快、成本低的快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法。
本发明的技术解决方案是:一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法,其特征在于有如下步骤:
首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应,每个PCR反应总体积为25μl,包括提取的基因组DNA,2μl;10×PCRBuffer,2.5μl;Mg2+1.5mmol/L;Tag酶1u;dNTP 0.1mmol/L;凝结芽孢杆菌特异性引物各10pmol;最后加ddH2O至25μl;设置PCR仪的程序参数为:95℃变性5min;95℃30sec,56℃30s,72℃40sec,该反应进行35个循环;72℃延伸5min,4℃保存。其中凝结芽孢杆菌特异性引物为:
B.coag-F:5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’;
B.coag-R:5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’
最后进行电泳检测,PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合,在加Gelred染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记对照进行检测,如果在紫外灯下存在555bp的核酸片段,则说明有凝结芽孢杆菌。
本发明提供了一对扩增凝结芽孢杆菌的特异引物B.coag-F、B.coag-R,从而提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法,同现有技术相比具有如下优点:
1.检测速度快,直接利用增菌液的基因组DNA进行检测,省去了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤,而分离纯化和生化鉴定一般需要48~72h。
2.成本低,由于省略了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤,节省了革兰氏染色、分离纯化培养基和生化试剂的费用,降低了检测成本。
具体实施方式
首先无菌操作取1g待测样品,加入盛有9ml酸性肉汤(酸性罐头食品)或溴甲酚紫葡萄糖肉汤(低酸性罐头食品及其它待测样品)的灭菌容器内,55℃±1℃,需氧条件下培养48h。取培养的菌液加入离心管中,以12000rpm离心1min,弃上清液,利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应,每个PCR反应总体积为25μl,包括提取的基因组DNA,2μl;10×PCRBuffer,2.5μl;Mg2+1.5mmol/L;Tag酶1u;dNTP 0.1mmol/L;凝结芽孢杆菌特异性引物各10pmol;最后加ddH2O至25μl;设置PCR仪的程序参数为:95℃变性5min;95℃30sec,56℃30s,72℃40sec,该反应进行35个循环;72℃延伸5min,4℃保存。其中凝结芽孢杆菌特异性引物为:
B.coag-F:5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’;
B.coag-R:5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’
最后进行电泳检测,取9μl PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合,在加入万分之一的Gelred染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测,如果在紫外灯下存在555bp的核酸片段,则说明有凝结芽孢杆菌。
凝结芽孢杆菌PCR引物序列表
<110>中粮新疆屯河股份有限公司
<120>凝结芽孢杆菌的PCR快速检测方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)...(20)
<400>1
TACGGCATTGGCAAGTATCA 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)...(20)
<400>2
CGACATGATTTGGTTTTCCA 20
Claims (2)
1.一种快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法,其特征在于首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用;再利用凝结芽孢杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物;然后使用该引物对待测样品增菌液的基因组DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,其中所述的凝结芽孢杆菌特异性引物为:
B.coag-F:5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’;
B.coag-R:5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’;用该引物时的退火温度为56℃。
2.根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的PCR方法,其加样参数为:每个PCR反应总体积为25μl,包括待测样品增菌液的基因组DNA,2μl;10×PCR Buffer,2.5μl;Mg2+1.5mmol/L;Tag酶1u;dNTP0.1mmol/L;权利要求1中的特异性引物各10pmol;最后加ddH2O至25μl;设置PCR仪的程序参数为:95℃变性5min;95℃30sec,56℃30s,72℃40sec,该反应进行35个循环;72℃延伸5min,4℃保存。
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