CN102041299B - 发酵乳酸杆菌的pcr快速检测方法 - Google Patents

发酵乳酸杆菌的pcr快速检测方法 Download PDF

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Abstract

一种快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法。首先提取待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用发酵乳酸杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物；然后使用该引物对待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。其加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP 0.1mmol/L；权利要求1中的特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃30s，62℃30s，72℃40s，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。具有检测速度快、成本低的优点。

Description

发酵乳酸杆菌的PCR快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种发酵乳酸杆菌的PCR快速检测方法。
背景技术
酸性罐头食品(pH 4.5以下)，在其中存活的微生物多为耐酸、抗热性极强的杆菌、球菌等，它们的存在通常会引起罐头的腐败。由于酸性罐头食品提供的酸性环境，其中通常是以喜欢酸性环境的乳酸菌为优势菌群，发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)是其中的一种。发酵乳酸杆菌目前常用的检测方法是厌氧平板培养法，待生长出菌落后用肉眼观察挑选可疑菌落，然后进行革兰氏染色和生化鉴定。发酵乳酸杆菌营养要求复杂，培养特性比较特殊，而且传统平板培养生长缓慢，分离培养鉴定周期约需7～9d，因此建立快速检测和鉴定发酵乳酸杆菌的检验方法势在必行。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点，已广泛应用于微生物的鉴定，然而，迄今国内还未见有利于PCR方法快速检测发酵乳酸杆菌的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、成本低的快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法。
本发明的技术解决方案是：一种快速检测发酵乳酸杆菌的方法，其特征在于有如下步骤：
首先提取待测样品分离琼脂平板上可疑菌落纯培养的基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP 0.1mmol/L；发酵乳酸杆菌特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃30s，62℃30s，72℃40s，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。其中发酵乳酸杆菌特异性引物为：
L.fermen-F：5’-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3’；
L.fermen-R：5’-TCAACACCGGTAACAGTGGA-3’。
最后进行电泳检测，PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合，在加Gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记对照进行检测，如果在紫外灯下存在456bp的核酸片段，则说明有发酵乳酸杆菌。
本发明提供了一对扩增发酵乳酸杆菌的特异引物L.fermen-F、L.fermen-R，从而提供一种快速检测发酵乳酸杆菌的方法，同现有技术相比具有如下优点：
1.检测速度快，直接利用分离琼脂平板上可疑菌落纯培养的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色和生化鉴定步骤，而生化鉴定一般需要24～72h。
2.成本低，由于省略了革兰氏染色和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色和生化试剂的费用，降低了检测成本。
具体实施方式
首先无菌操作取25g待测样品，充分剪碎，加入盛有225ml灭菌生理盐水的灭菌容器内，进行10倍系列稀释后，选择2个～3个适当稀释度，各以0.1mL涂布到MRS琼脂平板上，36℃±1℃，兼性厌氧条件下培养48h。挑取3个或以上可疑菌落，接种于MRS琼脂平板上进行纯培养，36℃±1℃，兼性厌氧条件下培养48h，提取基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP 0.1mmol/L；发酵乳酸杆菌特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃30s，62℃30s，72℃40s，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。其中发酵乳酸杆菌特异性引物为：
L.fermen-F：5’-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3’；
L.fermen-R：5’-TCAACACCGGTAACAGTGGA-3’。
最后进行电泳检测，取9μl PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合，在加入万分之一的Gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测，如果在紫外灯下存在456bp的核酸片段，则说明有发酵乳酸杆菌。
发酵乳酸杆菌PCR引物序列表
<110>中粮屯河股份有限公司
<120>发酵乳酸杆菌的PCR快速检测方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)...(20)
<400>1
TGATGGTCCTATGCCACAAA 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)...(20)
<400>2
TCAACACCGGTAACAGTGGA 20

Claims (2)

1.一种快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法，其特征在于首先提取待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用发酵乳酸杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物；然后使用该引物对待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中所述的发酵乳酸杆菌特异性引物为：
L.fermen-F：5’-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3’；
L.fermen-R：5’-TCAACACCGGTAACAGTGGA-3’；用该引物时的退火温度为62℃。
2.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法，其加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ 1.5mmol/L；Taq酶1u；dNTP 0.1mmol/L；权利要求1中的特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃30s，62℃30s，72℃40s，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
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KR20030033719A (ko) * 2001-10-24 2003-05-01 서진호 유산균 검정방법 및 검정용 프라이머
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