CN102154473A - 一种基因芯片及其在水产病原微生物检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水产病原微生物检测基因芯片，其制备方法及其在水产病原微生物检测中的应用。将从目标病原微生物靶基因中选出的保守序列固定在固相载体上作为寡聚核苷酸探针，在适当的杂交条件下，加入经标记的待测样品进行反应，根据基因芯片上探针显示信号可以鉴定出相对应的水产病原微生物。本发明提供的基因芯片能快速检测水产病原微生物如嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌等，检测灵敏度高、特异性强，能大幅缩短检测周期。

Description

一种基因芯片及其在水产病原微生物检测中的应用

技术领域

本发明涉及一种水产病原微生物检测基因芯片，其制备方法及其在水产病原微生物检测中的应用。

背景技术

改革开放以来，我国渔业取得了举世瞩目的成就，水产品总产量自1990年以来一直居世界首位，已发展成为世界渔业大国，渔业在我国国民经济，特别是农业经济发展中占有越来越重要的地位。

然而，生态环境的破环、生长率的下降、病害的大量爆发等已成为水产养殖业不容忽视、亟待解决的问题。近年来，草鱼出血病、甲壳类的白斑综合症和桃拉综合症、淡水鱼细菌性败血症以及鳖腮腺炎病等屡屡给水产养殖产业带来较大的损失，这种损失不仅仅体现在疾病的爆发对水产养殖动物存活率的毁灭性打击上，更不容忽视的是为了防治疾病，药物特别是抗生素的不当使用对包括水产养殖在内的整个产业链的影响，甚至由于水产养殖业所赖于生存的水的特殊性，对生态环境乃至人的健康的影响尤为值得关注。

病原微生物作为重要的致病因子，其快速准确的检测尤为关键。作为餐桌食品的重要组成部分，水产品中的金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌等食源性微生物的检测一直都是保障餐桌安全的重要工作。

随着水产品流动的日趋频繁，市场准入制度的逐渐深入，人民生活水平的不断提高，水产品特别是鲜活水产品卫生的快速检测已成为各方的迫切要求。传统的微生物鉴定法费时费力，以PCR为代表的分子生物学及自动化控制技术的发展使得快速检测病原微生物成为可能。目前报道较多PCR法、PCR加杂交法等方法虽然大大提高了检测的灵敏度，简化了检测手续，但也存在一些不足之处。其中最局限的是上述方法在一次实验中只能检测一种或几种微生物，检测微生物的种类非常少。这对于一个水产品标本中就含有数十种细菌的实际情况来说，要达到一个较理想的检测结果还是相当困难的。

本世纪以来，基于悬浮芯片技术、蛋白质芯片技术及纳米金基因芯片技术的病原体快速检测系统的研究逐步展开。生物芯片是最近十年发展起来的应用于分子生物学研究的一项新技术，它是以核酸分子杂交技术为基本原理，并结合机械制造技术、计算机技术等其他诸多高新科技，被广泛运用于核酸序列测定、基因突变检测、基因表达情况分析等领域。近年来将生物芯片运用于微生物的检测和分类的报道也越来越多。设计合成特异性微生物探针，将其点样于芯片上，待测微生物样品经DNA抽提，PCR标记，即可与芯片进行杂交反应，经扫描测读，输出结果，经分析可判断出样品中微生物种类。相对于一般的分子生物学方法，用生物芯片检测微生物更具有大容量、灵敏、快速、准确、高效、简便等优点，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速检测水产病原微生物如嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌等的基因芯片，以克服现有技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，缩短检测周期。

本发明所述的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从以下基因序列中选取的一种或多种：

(1)从沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的femA基因、单增李斯特氏菌的prfA基因，副溶血性弧菌的tlh基因，迟缓爱德华氏菌的gadB基因或嗜水气单胞菌的16S rRNA基因、aerA基因、hlyA基因、ahpA基因中选取的DNA片段；

(2)所述(1)中的DNA片段的互补DNA序列。

上述的病原微生物寡聚核苷酸探针长度一般为20-40个核苷酸，按其设计原则为每个探针解链温度相近(68℃±3℃上下波动)，以避免发夹二聚体形成，相同序列尽量减少(避免单一碱基连续重复7次以上)。为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在上述探针的寡核苷酸5’端补T使探针长度达到40bp，同时进行氨基修饰。探针可利用生物信息学相关软件设计完成，例如可将病原微生物靶基因序列用Clustal进行比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入Oligo软件中，输入相关参数，运行程序，从输出结果中优选长度在27bp±2bp，T_m值68℃±3℃的探针。

本发明的较佳实施例中，上述固定在固载体上的寡聚核苷酸探针具有表1中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的至少一种。

表1针对不同水产病原微生物的寡聚核苷酸探针

本发明所述的基因芯片，还包括阳性对照探针。所述阳性对照探针为使用λDNA作为阳性对照及点阵位置的参照物。

根据探针的总数和各细菌特异的探针数目，设计点阵图。在芯片上制备两个完全相同的点阵，作为重复。在点阵的四个角设计为阳性对照，用以确定各个基因片段的位置。

本发明还提供一种检测水产中病原微生物检测的试剂盒，其包括上述的基因芯片。上述的试剂盒，还包括检测引物，该检测引物优选具有表2所示的引物对中的至少一种。

表2常见水产病原微生物PCR扩增引物表

本发明还提供了一种利用上述基因芯片或试剂盒检测水产中致病微生物的方法，包括如下步骤：

(1)、提取待检测样品的基因组DNA，利用PCR方法从中克隆出靶基因的cDNA序列并标记；

(2)、在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测样品并使之反应足够的时间；

(3)、检测杂交反应的结果。

上述方法中，采用待测样品的基因组DNA为模板，加入表2所示的至少一对引物，优选所有引物对进行PCR扩增。扩增产物采用Cy3或Cy5进行荧光标记。

进行杂交处理后，将处理好的芯片于扫描仪上，分别用Cy3和/或Cy5的光线进行扫描，调整光的扫描强度，使扫描结果达到最佳。将Cy3和Cy5的扫描结果用软件进行分析。根据基因芯片上探针显示信号可以鉴定出相对应的水产病原微生物。

以下通过实施例对本发明进行详细说明。

具体实施方式

实施例1嗜水气单胞菌PCR检测体系的建立

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，是人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中，是多种水产动物的主要致病菌。嗜水气单胞菌是自然界尤其是水环境中广泛存在的条件致病菌。嗜水气单胞菌的毒力差异较大，广泛存在无毒菌株，传统的细菌分离鉴定要结合毒素的生物学或血清学方法才能确定其致病性，费时、费力而且敏感性不高；由于存在aer⁺ahp^-基因型和aer^-ahp⁺基因型的致病菌株，针对aer或a如单个基因建立的PCR方法可能存在漏检；此外aer和a如不具有种属特异性，气单胞菌属的其它细菌如豚鼠气单胞菌也有这两个基因，而且基因的序列同源性比较高，所以只针对毒力基因进行检测而不进行种的鉴定会导致误检，因此在进行毒力基因的检测同时再进行种的鉴定是该致病菌准确检测的有效保证。

以能检测嗜水气单胞菌并且同时区分致病性和非致病性嗜水气单胞菌为目标，参考NCBI上的相关序列信息，借助比对(BLAST)和引物设计(Oligo等)工具，寻找高保守的序列，设计嗜水气单胞菌PCR检测用引物如表3所示，送上海生工合成。

表3嗜水气单胞菌相关基因引物序列

用表3所示的四对引物分别对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、健康三角鲂尾鳍基因组DNA进行扩增。结果如表4所述。

PCR检测体系为：10×PCR buffer 5μl，MgCl₂ 4μl(25mmol/L)，dNTP 4μl(1.25μmol/ml)，Taq酶2.5U，16S-F/16S-R、AerA-F/AerA-R和AhpA-F/AhpA-R引物各2μl(10μmol/L)，DNA模板2μl，用双蒸水补足至50μl。反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，60℃45s，72℃45s，35个循环，72℃延伸10min。方法检出限为200fg模板DNA。

引物16S-F/16S-R对供试嗜水气单胞菌检测结果阳性，在600～700bp间发现特征条带；而阴性对照组均未观察到相应条带，即使退火温度低至50℃时，也未发现非特异性扩增条带。因此，可以用16S-F/16S-R引物对鉴定嗜水气单胞菌。

而借助上述的PCR体系，利用16S-F/16S-R、AerA-F/AerA-R和AhpA-F/AhpA-R引物对，可以同时区分致病性和非致病性嗜水气单胞菌。

表4PCR和常规鉴定法检测嗜水气单胞菌

备注：上述菌种购自工业微生物菌种保藏管理中心

比对检验提示引物对16S-F/16S-R具有种特异性，能特异性扩增嗜水气单胞菌16s核糖体核酸片段。

煮沸法提取Aeh-BY-SC09菌株基因组DNA，分光光度法测定浓度，调整起始浓度至100ng/μl，以其10倍连续梯度稀释液为模板，以16S-F/16S-R、AerA-F/AerA-R和AhpA-F/AhpA-R进行三重PCR扩增。敏感性检测结果显示本方法检出限为2μl×100ng/μl×10^-6＝200fg＝2×10^-13g模板DNA(见表5)。

表5PCR法的检测灵敏度

实施例2副溶血弧菌PGR检测体系的建立

副溶血弧菌是水产品中引起食物中毒的重要病原菌之一，是食品安全检测中的一项重要指标。在我国沿海地区，由副溶血弧菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒事件首位。法定的副溶血弧菌检测方法仍然是传统培养方法，操作繁琐、费时、费力，常常需要5-6d才能完成。

副溶血弧菌的主要毒力因子包括多种溶血毒素，主要有不耐热直接溶血毒素(TLH)、耐热直接溶血毒素(TDH)与耐热直接溶血相关毒素(TRH)，分别由tlh、tdh和trh基因编码。Tlh基因存在于所有副溶血弧菌中，具有种特异性。因此，可以参考副溶血弧菌的tlh基因序列信息，借助oligo等软件设计针对tlh的特异性引物tlh-F/tlh-R。通过优化PCR扩增条件，最后确定副溶血弧菌PCR检测体系：tlh-F/tlh-R引物各0.5μl(10μmol/L)，10×PCRbuffer 2μl，MgCl₂ 2μl(25mmol/L)，dNTP 2μl(1.25μmol/ml)，Taq酶0.5U，DNA模板1μl，用双蒸水补足至20μl。反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10min。比对检验提示引物对tlh-F/tlh-R具有种特异性，能特异性扩增副溶血弧菌tlh基因片段，可以用tlh-F/tlh-R引物鉴定副溶血弧菌。

实施例3其他水产致病菌PCR检测体系的建立

参考实施例1和2的思路，通过优化PCR扩增条件，完善设计引物，确定迟缓爱德华氏菌等常见水产病原微生物的PCR检测体系，扩增条件如表6所示。

表6常见水产病原微生物PCR扩增引物

实施例4、探针的设计和制备

从GenBank公共数据库分别下载得到沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的femA基因、单增李斯特氏菌的prfA基因、迟缓爱德华氏菌的gadB、副溶血性弧菌的tlh基因和嗜水气单胞菌16S rRNA基因、aerA基因、hlyA基因、ahpA基因的基因序列。

将上述的病原微生物靶基因序列输入Clustal软件进行比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入Oligo软件中，输入相关参数，运行程序，优选长度在27bp±2bp，Tm值68℃±3℃的探针，其如表1Seq ID No.1-Seq ID No.10所示.

上述探针委托上海生工公司合成。为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在上述探针的寡核苷酸5’端补T使探针长度达到40bp，同时进行氨基修饰，冷藏备用。

实施例5基因芯片的制备

对欲点样的玻片在点样前进行扫描，剔除背景信号强度高、玻片质量差的芯片。将阳性探针和实施例4制备的探针分别溶解于50％的DMSO溶液中，稀释使终浓度为10μM。采用的芯片点样仪为Spotarray72，使用SpotArray的控制软件，运行程序，调整点样参数按表7所示的布阵方式进行点样。

将点样好的芯片放置于点样仪上30-60min。然后在室温下于保湿盒中过夜，使其充分与芯片上的NH₂结合。将芯片于紫外交联炉内照射3-5min，并用丁二酸酐充分清除芯片裸露处的NH₂，防止以后杂交时出现较大的背景。将制备好的芯片放置于室温中保存。

表7基因芯片布阵图

实施例6对基因芯片进行特异性鉴定

采用引物16S-F/16S-R引物，根据实施例1的方法对嗜水气单胞菌进行PCR扩增，扩增时混合引物取2μL，其它试剂量不变。对扩增产物用异丙醇精制后，加39.5μL DEPC水溶解。用Cy3和Cy5标记试剂盒(MIRUS，Wisconsin，USA)进行标记，反应过程参见试剂盒使用说明。标记完成后的产物用G50 Microspin column精制，操作规程见试剂盒使用说明。将精制后分别标记有Cy3和Cy5的扩增产物混合，用氯仿∶异戊醇(24∶1)处理，15,000rpm室温下离心10min，然后用乙醇精制，待用。

取10μl试剂盒中预杂交缓冲液(滴于盖玻片上，芯片点样面朝下盖在盖玻片上，去除盖玻片周围的残液，并用纸带把盖玻片封好，室温下放置2h。在室温的2×SSC(NaCl 175.3g，Na₃Citrate 88.2g，用ddH2O定容至1L，灭菌，用时用灭菌的ddH2O稀释10倍)中浸泡5min，剥离纸带及轻轻移开盖玻片，将芯片放到染色架上。室温下，在装满2×SSC的染色缸中上下摇动5次，室温下，在板式离心机中1000rpm离心5min。将标记好的扩增产物于95℃下变性2min立即取出在冰上冷却，25℃12,000rpm离心10min。取上清液滴于盖玻片上，芯片点样面向下盖在盖玻片上，去除四周残液，用纸带封好，将芯片放入65℃已预热好的湿盒中，在65℃恒温箱中避光保温过夜。

在2×SSC中将盖玻片轻轻与芯片分开，将芯片放在染色架内。在55℃装有2×SSC和0.2％SDS的染色缸中上下摇动20次后，放置30min，换至另一个55℃装有2×SSC和0.2％SDS的染色缸中上下摇动20次，放置30min。在65℃预热的装有2×SSC和0.2％SDS的染色缸中上下摇动20次，放置5min。在室温下的0.05×SSC的染色缸中上下摇动20次，放置5min。待液体充分除去后(注意芯片不要干燥)，25℃1000rpm离心2min。

将处理好的芯片置于扫描仪上，分别用Cy3和Cy5的光线进行扫描，调整光的扫描强度，使扫描结果达到最佳。将Cy3和Cy5的扫描结果用Imagene软件进行分析。

杂交结果显示含有标记有Cy3或Cy5的λDNA与芯片上的λDNA杂交，扫描后出现明显的杂交信号，显示为绿色；扩增产物中的嗜水气单胞菌16S核酸片段与16S探针结合，扫描后出现强烈的杂交信号，显示为黄绿色到红黄色；其它探针没有相应的细菌核酸杂交，显示为深浅不一的蓝色；结果表明基因芯片能特异性地鉴定嗜水气单胞菌。

实施例7采用基因芯片检测水产病原微生物

实施例5制备的基因芯片可用于鉴定水产病原微生物中是否存在迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌或嗜水气单胞菌等致病菌。

抽提待测病原微生物的基因组作为模板，PCR检测体系为：10×PCR buffer 5μl，MgCl₂ 4μl  (25mmol/L)，dNTP 4μl(1.25μmol/ml)，Taq酶2.5U，表2所示引物各1μl(10μmol/L)，DNA模板2μl，用双蒸水补足至50μl。反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。

将扩增产物按实施例6所示方法进行标记，进行杂交处理后，将芯片将处理好的芯片于扫描仪上，分别用Cy3和Cy5的光线进行扫描，调整光的扫描强度，使扫描结果达到最佳。将Cy3和Cy5的扫描结果用Imagene软件进行分析。根据基因芯片上探针显示信号可以鉴定出相对应的水产病原微生物。

Claims (10)

1.一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从以下基因序列中选取的一种或多种：

(1)从沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的femA基因、单增李斯特氏菌的prfA基因，副溶血性弧菌的tlh基因，迟缓爱德华氏菌的gadB基因或嗜水气单胞菌的16S rRNA基因、aerA基因、hlyA基因、ahpA基因中选取的DNA片段；

(2)所述(1)中的DNA片段的互补DNA序列。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的寡聚核苷酸探针具有20-40个核苷酸，探针解链温度为68℃±3℃。

3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：所述的寡聚核苷酸探针长度在27bp±2bp，合成时在寡核苷酸5’端补T使探针长度达到40bp，同时进行氨基修饰。

4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的固定在固载体上的寡聚核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的至少一种：

Seq ID No.1：CGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTG

Seq ID No.2：CAATACCTATGGCCTGAGCGAGAAG

Seq ID No.3：TTTGAAGATACCGACAAGCGTAGAC

Seq ID No.4：AACATAGACCCCTCCAATAGCAACTTC

Seq ID No.5：TCCTCGCTATTATTTCCTTTCTTATCT

Seq ID No.6：ATAACAAGCGAGATAACTTACAACAAC

Seq ID No.7：AAACTAACGGGATAAAACCAAAACAAT

Seq ID No.8：TCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTT

Seq ID No.9：TCACAGATATGGCATGCTTTTGAAC

Seq ID No.10：CGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA。

5.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片还包括阳性对照探针。

6.一种检测水产中病原微生物检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基因芯片。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其在特在于：所述试剂盒还包括检测引物，该检测引物具有gadB-F/gadB-R，femA-F/femA-R，prfA-F/prfA-R，invA-F/invA-R，ipaH-F/ipaH-R，tlh-F/tlh-R，16S-F/16S-R，aerA-F/aerA-R，hlyA-F/hlyA-R，ahpA-F/ahpA-R引物对中的至少一种。

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的基因芯片或试剂盒检测水产中致病微生物的方法，包括如下步骤：

(1)、提取待检测样品的基因组DNA，利用PCR方法从中克隆出靶基因的cDNA序列并标记；

(2)、在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测样品并使之反应足够的时间；

(3)、检测杂交反应的结果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：扩增产物采用Cy3或Cy5进行荧光标记。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行杂交处理后，将处理好的芯片置于扫描仪上，分别用Cy3和/或Cy5的光线进行扫描，扫描结果用软件进行分析，根据基因芯片上探针显示信号可以鉴定出相对应的水产病原微生物。