CN104087665B - 一种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒 - Google Patents

一种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测烟曲霉及黄曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒。本发明的检测烟曲霉及黄曲霉的通用引物能够同时检测扩增出烟曲霉及黄曲霉，同时结合了实时荧光tHDA技术，较其他普通的PCR相比，能够在恒温下进行扩增，省去了变性、退火、延伸等步骤，直接模拟生物体环境进行解旋扩增，有利于简化设备，利于在基层推广。使用本发明的试剂盒，其检测限可达到104copies(拷贝)/ml，可用于临床。能够检测出临床上最常见的两种曲霉菌感染，不但为临床节省大量宝贵的抢救时间，而且成本低廉、操作方便，具有广阔的运用前景。

Description

一种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断核酸检测领域，具体涉及一种在临床样本中检测烟曲霉和黄曲霉感染的荧光tHDA(热稳定解旋酶依赖性恒温扩增)试剂盒。
背景技术
近年来，随着肿瘤患者的增多、化疗药物、免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛使用，特别的是在恶性血液性疾病、骨髓移植中，侵袭性真菌感染的发生率明显增高，曲霉菌感染是仅次于念珠菌感染的侵袭性真菌感染且逐年上升。有研究表明肺部曲霉菌感染的病死率为40％，泛发性曲霉感染为病死率为90％。在反复运用氟康唑预防真菌感染的尸检病例中曲霉已成为首要的致病菌，而在恶性血液病患者尸检中发现曲霉菌感染率高达30％。在中国大陆的一项统计资料表明，在侵袭性曲霉感染中，烟曲霉与黄曲霉占86.82％，成为曲霉菌感染的主要病原菌(高露娟,余进,李若瑜.中国大陆地区曲霉病流行现状分析[J].中国真菌学杂志,2010,04:247-251)。
对于侵袭性曲霉感染，早期诊断不仅能够减少病死率，而且能够减少医疗费用及住院天数，而目前，侵袭性曲霉菌感染的诊断主要依赖于传统的实验室诊断方法，包括：直接涂片镜检、传统的培养方法、组织病理学方法、影像学方法、血清学方法等，然而这些方法，每种方法均存在缺乏敏感性或特异性，而不能满足临床诊疗的需要。因此，以基因组DNA为基础的分子生物学诊断方法倍受关注，成为国内外研究者的探索热点。近来，研究人员报道了许多应用实时定量PCR技术(Real-timePCR)检测致病性真菌的特异核酸序列的研究，提出了实时定量PCR检测方法可以很好地用来快速准确地诊断侵袭性真菌感染。然而，实践表明，实时定量PCR检测方法存在着一些不足之处，例如:1)须要昂贵的PCR仪，尤其是实时荧光PCR仪造价不菲；2)多种因素影响扩增效果；3)常引起非特异性扩增，难以在基层推广应用等，亟待更新的方法来替代。
解旋酶依赖性恒温核酸扩增(helicasedependentamplification，HDA)，其原理是根据解旋酶在ATP存在下能够解开DNA双链，随后两条特异性引物结合于单链DNA并在DNA聚合酶的作用下催化合成双链，并将此次合成的DNA双链作为模版依次扩增实现指数倍的扩增。采用研究表明，HDA能很好地扩增微生物基因组DNA、质粒DNA和cDNA等。目前根据所采用的解旋酶的不同，可以分为1、室温HDA，采用大肠杆菌解旋酶和Mutl蛋白在常温下即可；2、热稳定HDA(thermophilichelicasedependentamplification，tHDA)，从嗜热杆菌中提取的热稳定解旋酶，此过程较室温HDA相比不需要Mutl蛋白及单链结合蛋白(SSB)。本发明是采用tHDA作为扩增方法，在较高的温度下扩增反应可以减少非特异性扩增，同时更有利于解旋酶进行DNA解旋(CN03824150.1)。
作为一种崭新的核酸扩增方法，与普通PCR技术相比，该方法具有不需要经过变性-退火-延伸的多次循环扩增，可以简化设备、降低成本更有利于在偏远地区的推广运用的巨大优势。另外，较其他常见的恒温扩增技术也具有相应优势，如：链替换扩增(SDA)需要4条引物来实现早期扩增，转录介导的扩增(TMA)在转录、cDNA合成以及RNA降解过程需要三种酶来实现恒温的扩增。
实时荧光tHDA是tHDA技术与荧光定量技术的结合。仅利用tHDA扩增技术对终产物进行定性或定量分析，无法对起始模板准确定量，而实时荧光tHDA技术利用荧光信号的变化实时监测HDA扩增反应中每一循环扩增产物量的变化，通过Ct值及其标准曲线的分析能够对起始模板进行定量分析。但是，目前国际上对tHDA扩增技术处于起步阶段，虽现有利用tHDA扩增技术运用于曲霉菌的检测(王小婷.解旋酶依赖性DNA恒温扩增技术用于黄曲霉检测的研究[D].福建医科大学,2012.)，但其敏感性较低，并且无法定量分析起始模板，目前国内外尚未有将实时荧光tHDA技术运用于曲霉菌的检测。
发明内容
针对上述问题，本发明首次建立起一种快速检测曲霉菌的实时荧光tHDA技术，从而更有利于建立简单便捷的临床和实验室诊断，也使对于基因层面的床旁检验成为可能。
本发明的一个目的是提供一组作为引物使用的，能够同时检测出烟曲霉及黄曲霉的寡核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种既快速、准确，又易于标准化的能够检测烟曲霉及黄曲霉的实时荧光定量tHDA试剂盒。
具体而言，一方面，本发明提供一组检测曲霉菌的引物，该组引物包括序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的寡核苷酸序列。其中，扩增检测曲霉菌的正向引物为：TGCATTTAATAGCAATGCACGATAC；扩增检测曲霉菌的反向引物为：CAAAGTAAGGAGCGAAAGGTAATCTA。
为解决所述第二个技术问题，本发明采用的检测曲霉菌的实时荧光tHDA试剂盒，保存于-20℃。包括DNA提取剂，tHDA反应液，酶混合物，dNTP，荧光染料：包括EvaGreenDye和ROXreferenceDye(其为市售染料名称，目前尚无统一中文译文)；灭菌纯水；阴性对照：无插入有特异性片段的pUC18-T载体质粒；阳性对照：含有烟曲霉或黄曲霉DNA样本；标准品：含有插入有曲霉的特异性片段的pUC18-T载体质粒。本发明将采用EvaGreenDye作为实时荧光定量的染料，该染料与常用的荧光定量染料相比，具有良好的稳定性，对扩增反应的抑制性也小。
所述的标准品为含有插入曲霉菌特异序列的pUC18-T载体质粒，所插入的序列如下：
GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTATTACTAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATAATGCTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTAATAGCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCCTTACTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTAACGCATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC
所插入的DNA序列为采用正向引物序列(GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序列(GGTGGAGTTTGCATTGGATTAG)为扩增引物，并以烟曲霉DNA为模板进行普通PCR扩增所得扩增产物。该扩增产物包含有以通用引物tHDA扩增的特异性DNA序列。标准品制备方法是将扩增的产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并利用微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。然后回收产物1ul加入至50μl感受态细胞中冰浴30分钟。然后42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。加入450μl无菌的LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150转/分钟振荡培养45分钟，使菌体复苏。取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。挑选白色菌落进行进一步增殖培养，提取质粒并通过PCR反应鉴定及测序验证，再用紫外分光光度计定量并-20℃保存作为标准品。
所述的标准品为稀释浓度1×108拷贝(copies)/ml、1×107拷贝/ml、1×106拷贝/ml、1×105拷贝/ml、1×104拷贝/ml及1×103拷贝/ml；
所述的阴性对照品为无插入的曲霉菌的序列的载体质粒。
二、试剂盒的试剂组成成分：
1.DNA提取试剂：BufferⅠ、BufferⅡ、BufferⅢ、溶壁酶(Lyticase)、蛋白酶K；
2.tHDA反应液，其中包括：tHDA缓冲液、MgSO4、NaCl、dNTP、引物Ⅰ、引物Ⅱ；其中所述的引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；
3.酶混合物，其中包括：热稳定DNA解旋酶，Bst聚合酶和极高热稳定性单链结合蛋白；
4.荧光染料：包括EvaGreenDye和ROXreferenceDye；
5.阴性对照：无插入曲霉的特异性片段的pUC18-T载体质粒；
6.阳性对照：为含有烟曲霉或黄曲霉DNA样本；
7.标准品：为插入有曲霉的特异性片段的pUC18-T载体质粒；
8.灭菌纯水；
三、根据本发明提供的试剂盒，对人血流感染的曲霉菌感染进行检测，该方法步骤包括：
1.用DNA提取试剂进行待测样本的DNA提取；
2.将提取的DNA和定量标准品加入到含有tHDA反应液中进行实时荧光tHDA扩增，使用实时荧光PCR仪进行检测；
3.利用定量标准品制备的标准曲线通过软件分析确定待测样品对应浓度。
本发明中所指的曲霉菌为烟曲霉和黄曲霉。
本发明中通过对不同的真菌及临床上常见的细菌进行了特异性分析，结果显示具有良好的特异性。
本发明通过对标准品进行稀释分析，可以达到104拷贝/ml。
本发明是采用了实时荧光tHDA方法检测曲霉菌感染。能够实时监控，闭管检测，具有快速简便、灵敏度高等特点(能够达到104拷贝/ml)，通过标准品建立标准曲线，可以快速的测定判断样本中是否含有并含有相应的烟曲霉或黄曲霉。同时采用空白对照可以有效的扣除可能发生感染的，在加样规程中进行了质量控制，能够判断是否在加样中发生了污染。通过快速的鉴定可以为临床的决策判断提供有效的证据，及时合理的运用抗生素，减少耐药的产生，同时减少患者的住院费用及时间。
本发明具有的有益结果如下：
1.本发明首次将tHDA扩增方法结合应用于曲霉菌的检测，有利于简化仪器，节约仪器研发的成本投入，更有利于在基层的开展以及运用，也为基因层面的床旁检验提供思路；
2.本发明结合荧光tHDA技术，采用发明人创新设计的用于烟曲霉及黄曲霉的通用引物检测临床上最常见的曲霉，可以同步对两种常见的曲霉菌进行检测，能够为临床侵袭性真菌感染早期病原体诊断提供依据，以便早期及时的制定治疗方案，为患者的及时准确的提供强大的证据支持，减少患者的医疗费用以及缩短患者的住院时间；本发明的发明人也尝试验证其他引物进行曲霉的检验，但均未获得同样效果。
3.本发明的实验结果表明，本发明的引物和试剂盒具有良好的灵敏度及特异性，同时检测速度快，步骤简单，可重复性高，在临床诊断上具有强大的应用前景。
附图说明
图1为以烟曲霉DNA扩增模板为例的实时荧光tHDA扩增的设置条件；
图2为标准品实时荧光tHDA定量的扩增曲线，针对的模板数为104～108拷贝/ml进行的tHDA分析，图中的横坐标代表扩增的循环数，纵坐标代表荧光强度，其中1-5分别代表标准品扩增曲线，针对不同的拷贝数；
图3为标准品实时荧光tHDA定量检测在StandardCurve标签下的标准曲线，图中横坐标代表标准品浓度(拷贝/ml)，纵坐标代表阈值循环数，标记代表检测的样本；
图4为标准品实时荧光tHDA定量检测的溶解曲线，横坐标表示温度(tHDA产物熔解温度),纵坐标是表示荧光强度/温度的导数值(Derivative)。图中的每一条曲线代表样本的溶解曲线，仅有单一峰出现表示该扩增产物具有较好的特异性，无引物二聚体形成。
图5为通用引物tHDA扩增特异性分析电泳图。
具体实施方式
本发明所用的真菌购买于中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心，细菌标本均为从临床中分离得到的常见的细菌，人类标本为临床收集。
实施例1：曲霉tHDA引物设计与合成
根据Genbank中烟曲霉的线粒体基因序列，选择曲霉的保守序列，通过IDT在线引物设计进行设计引物，得到用于tHDA扩增的通用曲霉引物包括正向引物(其序列为TGCATTTAATAGCAATGCACGATAC)和反向引物(其序列为TGCATTTAATAGCAATGCACGATAC)引物由上海英潍捷基公司合成。
实施例2：构成检测侵袭性曲霉菌的荧光定量tHDA快速诊断试剂盒制备。该试剂盒包括DNA提取剂、实时荧光定量tHDA反应液及质粒模板定量标准品
一、DNA提取剂，其包括如下组分：
1.BufferⅠ：其为细胞裂解液，包括0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1mol/LNaCl，0.05mol/LTris-Cl(pH7.6)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；
2.BufferⅡ：其为真菌破壁液，包含有500mmol/LTris；10mmol/LEDTA；1％β－巯基乙醇；
3.BufferⅢ为苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)；
4.蛋白酶K(10U/ul)；
5.溶壁酶lyticase(10U/ul)；
二、实时荧光定量tHDA反应液
tHDA反应液包括：10×tHDA缓冲液、20uM正向引物、20uM反向引物、100mMMgSO4、500mMNaCl、dNTP混合液、酶混合液、2ulEvagreen20×、1ulROXreferenceDye；
1.其中10×tHDA缓冲液含有10mMKCl、20mMTris-HCl(25°C时pH8.8)；
2.其中dNTP为4.28mMdCTP，4.28mMdGTP，61.4mMdATP,4.28mMdTTP；
3.其中酶混合液为10U/ulBstDNA聚合酶、3.3ng/ul热稳定DNA解旋酶(购自biohelix公司)、8.3ng/ul极高热稳定性单链结合蛋白(购自北京NEB公司)。
三、标准品的制备
本步骤中采用质粒用于定量标准品的制备。采用正向引物序列(GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序列(GGTGGAGTTTGCATTGGATTAG)为扩增引物，并以烟曲霉为DNA模板进行普通PCR扩增。该扩增产物包含有以通用引物tHDA扩增的DNA序列。将扩增的产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并利用微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。然后将回收得到的DNA利用TA连接试剂盒进行连接。首先将回收产物1ul加入至50μl感受态细胞中冰浴30分钟。然后42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。加入450μl无菌的LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150转/分钟振荡培养45分钟，使菌体复苏。取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。挑选白色菌落进行进一步增殖培养，提取质粒并通过PCR反应鉴定及测序验证，再用紫外分光光度计定量并-20℃保存作为标准品。
实施例3实时荧光定量tHDA进行曲霉菌检测的敏感性及特异性分析
本实施例对实时荧光定量tHDA敏感性分析通过检测不同梯度下的阳性标准品，得到最低阳性标准品浓度作为敏感性的指标，特异性分析则通过以实验室提取的真菌、细菌标本及人类DNA作为扩增模板，观察是否能够非特异性扩增。
一、取若干反应管，分别作为敏感性分析及特异性分析检测，tHDA体系的加样量按表1进行，实时荧光tHDA定量分析采用ABI7500定量仪进行检测。
表1为实时荧光定量tHDA反应体系
组分 加样量(ul)
10×tHDA缓冲液 5.0
MgSO4(100mM) 2.0
NaCl(500mM) 4.0
dNTP混合液 3.5
酶混合液 3.0
50×Evagreen Dye 1.0
20×Rox reference Dye 2.0
引物1(20uM) 0.75
引物2(20uM) 0.75
DNA模板 4.0
ddH2O 24.0
二、在进行敏感性分析的反应管中，加入的DNA模板为1×108拷贝/ml、1×107拷贝/ml、1×106拷贝/ml、1×105拷贝/ml、1×104拷贝/ml、1×103拷贝/ml及1×102拷贝/ml；进行特异性分析的反应管中DNA模板则加入实验室提取的实验菌株DNA以及人类基因组，包括(烟曲霉、土曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、白色念珠菌、热带念珠菌、微球杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌以及人类基因组)；
三、根据图1进行设置反应条件，其中预反应温度为61℃，2分钟；反应温度为61℃，反应时间2分钟，45个循环，并收集荧光数据，在反应结束后参照ABI7500定量仪系统默认的溶解曲线进行分析；
四、tHDA敏感性的结果见附图2；
五、tHDA特异性分析的结果见表2及附图5；
表2为tHDA特异性扩增结果
实施例4试剂盒的使用
一、真菌DNA的提取，以临床全血标本为例，具体包括如下步骤：
1.取临床全血标本3ml于15ml离心管中，加入10mL灭菌超纯水，颠倒混匀，3000rpm×10min，弃上清
2.加入5mlbufferⅠ重复震荡至沉淀物消失；进行细胞裂解
3.室温下2800rmp×10min，弃上清；
4.加入300ulbufferⅡ于沉淀物中，将其转移至1.5ml灭菌的eppendorf管中，充分震荡，；
5.加入30U的lyticase，37℃作用2小时；
6.加入10U的蛋白酶K，56℃作用半小时，重复混匀；
7.加入等体积的bufferⅢ，充分混匀，于8000rmp/min离心10min；
8.抽提上层液体于另一个灭菌eppendorf管中(注意避免吸收中间层)，加入2.5倍体积无水乙醇，混匀；
9.于8000rmp/min离心5min，弃上清，加入适量75％乙醇，8000rmp/min离心5min，弃上清；
10.干燥使无水乙醇挥发，加入10ul水溶解。
11.将提取得到的DNA保存于-80℃冰箱保存备用。
标本中真菌DNA提取除本发明中所提到的方法，还可以使用其他成熟的DNA提取方法和试剂。
二、实时荧光tHDA的检测
tHDA反应体系参照实施例3所确定的反应体系进行，具体操作步
骤如下：
1.取反应管若干，其中包含标准品所需反应管6个，阳性对照1个，阴性对照1个，及需要检测的样本，按表3所示的加样体系进行加入，
2.tHDA反应体系根据实施例3所确定的反应体系，其中包括阳性标准品及阴性对照品。
表3实时荧光定量tHDA反应体系
续表3
引物1(20uM) 0.75
引物2(20uM) 0.75
ddH2O 24.0
3.在加入上述组分后，在用于检测待测样本反应管中加入经提取保存的DNA4ul，在标准品反应管中加入不同浓度的标准品4ul，阳性对照反应管中加入阳性质控品4ul，阴性对照反应管中加入阴性对照品4ul。
4.按预反应温度为61℃，2分钟；反应温度为61℃，反应时间2分钟，45个循环，并收集荧光数据，在反应结束后参照ABI7500定量仪系统默认的溶解曲线进行分析；
5.结果判断
a.若阴性质控品出现扩增曲线，则可能试剂出现污染，此次结果无效；
b.若阴性质控品未出现扩增曲线，则根据已知浓度的标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算出从标本中提取出的从标本中所含有的曲霉菌拷贝数；
c.若阳性质控品未出现扩增曲线，表示试剂失效或者加样错误，此次结果无效；
d.若阳性质控品出现扩增曲线，样本中未出现扩增曲线，样本中未含有烟曲霉或者黄曲霉或者其含量低于检测下限。

Claims (4)

1.一种检测曲霉菌感染的实时荧光tHDA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：
(1)DNA提取试剂；
(2)tHDA反应液，其中包括：tHDA缓冲液、MgSO4、NaCl、dNTP、引物Ⅰ、引物Ⅱ，其中，所述引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，所述引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；
(3)酶混合物，其中包括：热稳定DNA解旋酶、Bst聚合酶和热稳定性单链结合蛋白ETSSB；
(4)荧光染料；
(5)阴性对照：为无插入烟曲霉或黄曲霉的特异性片段的pUC18-T载体质粒；
(6)阳性对照：为含有烟曲霉或黄曲霉DNA的样本；；
(7)标准品：为插入有烟曲霉或黄曲霉的特异性片段的pUC18-T载体质粒；
(8)灭菌纯水。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂包括：BufferⅠ，BufferⅡ，BufferⅢ，蛋白酶K，溶壁酶(lyticase)；所述荧光染料包括：EvaGreenDye和ROXreferenceDye。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品中插入的特异性序列如下：
GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTATTACTAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATAATGCTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTAATAGCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCCTTACTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTAACGCATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释浓度分别为1×108拷贝/ml、1×107拷贝/ml、1×106拷贝/ml、1×105拷贝/ml、1×104拷贝/ml和1×103拷贝/ml。
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解旋酶依赖性DNA恒温扩增技术用于黄曲霉检测的研究;王小婷;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20130115(第1期);全文 *

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