CN105256054B - 一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种芽孢杆菌的检测技术，提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重PCR试剂盒，该方法检测快速准确，敏感性高，且操作简单成本低。本发明提供的试剂盒和方法可以特异的扩增凝结芽孢杆菌基因组中的coag基因和comK基因序列，而不会扩增得到其他细菌的基因片段，特异性强。特别是与凝结芽孢杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，不能扩增得到基因片段。能够准确、有效的检测出待检样品中是否存在凝结芽孢杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌的检测技术，特别是快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重PCR试剂盒。
背景技术
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，芽孢端生，可发酵糖类产生L-乳酸，所以又被称为“有孢子性乳酸菌”。由于菌株自身的安全性、有效性、经济性和环境友好性，成为我国农业部《饲料添加剂品种目录》(2008)批准使用的新型微生物饲料添加剂。凝结芽孢杆菌不仅具有普通乳酸菌的益生保健功能，还具较强的耐胃酸、耐高温高压、易培养和储存等优势，是益生菌领域中的后起之秀，被广泛应用于医疗、保健、食品、畜禽及水产养殖等领域。
目前，市场上凝结芽孢杆菌产品制剂较多，但缺乏规范的管理及科学的评估手段和参数标准，使得一部分微生态制剂生产厂家提供的产品质量、价格参差不齐。市面上一些厂家利用甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌冒充凝结芽孢杆菌高价售卖，牟取暴利，严重影响了用户对该类产品的选择。因而，建立一种快速、高效、准确的鉴定方法显得非常重要。
近年来分子生物学技术的快速发展，已有应用PCR技术和环介导等温扩增技术，检测凝结芽孢杆菌的方法。CN102533743B“一种用于扩增凝结芽孢杆菌的特异性引物及其应用”，公开了通过特异性的扩增comK基因来检测凝结芽孢杆菌的方法，用该方法扩增凝结芽孢可获得400bp的特异性片段，扩增炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、红球菌时，则无特异性片段。该检测方法仅扩增凝结芽孢杆菌的一段基因序列，易出现假阳性。
CN104152543A“一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法”，用该方法能从凝结芽孢杆菌DNA中扩增出大量的梯度大小核酸片段，而未能从其他属细菌DNA中扩增出核酸片段。所述其他属细菌为枯草芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和大肠杆菌标准株。
然而与凝结芽孢杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，在上述方法中均没有进行检测，难以保证检测方法的准确性。此外，荧光定量PCR和环介导等温扩增技术，存在仪器昂贵、人员要求较高或难定量、非特异性高等缺陷。
发明内容
本发明提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重PCR试剂盒，该方法检测快速准确，敏感性高，且操作简单成本低。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)PCR扩增；所述PCR扩增以样品DNA为模板，用PCR扩增引物进行扩增；所述PCR扩增引物包含两对PCR扩增引物，分别为引物对1和引物对2；所述引物对1为coag-F和coag-R，引物对2为comK-F和comK-R；所述引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；
(3)结果检测。
进一步的是，所述步骤(2)PCR扩增包括PCR总体系的配置和PCR扩增反应。
进一步的是，所述PCR总体系容积为25μL，包括PCR扩增引物、PCR反应试剂(10×PCR Mix)、DNA模板以及双蒸水(dd H2O)。
进一步的是，所述PCR总体系中各组分含量为：
进一步的是，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃温育5min。
进一步的是，所述结果检测的方法为琼脂糖凝胶电泳。
一种快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，包含两对PCR扩增引物，分别为引物对1和引物对2；所述引物对1为coag-F和coag-R，引物对2为comK-F和comK-R；所述引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。
进一步的是，所述试剂盒包含PCR反应试剂，阳性及阴性对照样品。
本发明具有以下有益效果：提供的试剂盒和方法可以特异的扩增凝结芽孢杆菌基因组中的coag基因和comK基因序列，而不会扩增得到其他细菌的基因片段，特异性强。特别是与凝结芽孢杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，不能扩增得到基因片段。因此能够准确、有效的检测出待检样品中是否存在凝结芽孢杆菌。并且敏感性高、检测快捷方便，可用于凝结芽孢杆菌样品的快速检测，帮助筛选性价比较优良的凝结芽孢杆菌产品，降低用户经济损失。
附图说明
图1为单一引物PCR扩增电泳图；
图2为双重PCR条件优化；
图3为引物特异性检测电泳图；
图4为引物灵敏度检测电泳图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。
实施例1
PCR扩增引物的设计和效果
一、实验方法
1、PCR扩增引物设计与合成
根据GeneBank中凝结芽孢杆菌基因组的coaG基因序列和comK基因序列，用PrimerPremier 5.0软件设计两对引物，见表1。引物对1为coag-F和coag-R，分别扩增coaG基因的正向和反向序列，为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列；引物对2为comK-F和comK-R，分别扩增comK基因的正向和反向序列，为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1 PCR扩增引物资料
2、模板的制备
按照无菌操作要求，将凝结芽孢杆菌标准菌株(CICC 20138)接种于凝结芽孢杆菌培养静置培养36h，取2mL菌液提取DNA。液体培养基，37℃恒温细菌基因组DNA提取操作步骤如下：
(1)取过夜培养的细菌菌液4mL，10 000r/min离心1min，尽量吸尽上清液。
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液(称取20mg的溶菌酶溶解在1mL TE缓冲液中，制成终浓度为20mg/mL的溶菌酶液，0.22μm微孔过滤后保存备用)，37℃处理40min。
(3)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心，去除管盖内壁水珠。
(5)加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL无菌双蒸水，室温放置5min，12 000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
3、单一引物的PCR扩增
取步骤2提取的凝结芽孢杆菌标准菌株基因组DNA作为模板，分别取步骤1中的两对引物按照以下程序分别扩增：
(1)扩增coag基因
PCR总体系为25μL，各组分含量分别为：
反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃温育5min。
(2)扩增comK基因
PCR总体系为25μL，各组分含量分别为：
反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃温育5min。
4、双重PCR扩增
以步骤2提取的凝结芽孢杆菌标准菌株(CICC 20138)基因组DNA作为模板，取步骤1中的两对引物进行双重PCR扩增。
PCR总体系为25μL，各组分含量分别为：
反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃温育5min。
5.结果检测
取5μL PCR扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
二、结果
1、单一引物PCR扩增结果
如图1所示，1号泳道为使用引物对1进行扩增的结果，出现大小约为337bp的扩增片段；2号泳道为使用引物对2进行扩增的结果，出现大小约为752bp的扩增片段。
两个基因扩增的目的片段测序结果在NCBI数据库中进行BLASTn比对分析，比对结果显示，测序结果与数据库中凝结芽孢杆菌coag基因和comK基因序列的相似性高达98％～99％。
2、双重PCR扩增结果
如图2所示，3号泳道为使用两对引物进行扩增的结果，出现两条清晰条带，大小分别约为345bp与769bp。
本实例表明了本发明所设计的引物可以分别扩增出目的基因序列，即扩增出凝结芽孢杆菌基因组中的coag基因与comK基因。并且用本发明所设计的两对引物进行双重PCR，可以特异的扩增出凝结芽孢杆菌基因组coag基因与comK基因，无其他任何杂带。说明两对引物之间无干扰现象，可准确扩增。
实施例2
引物特异性实验
一、实验方法
1.DNA模板制备
按照无菌操作要求，分别培养各类细菌并提取DNA。具体如下：
a.凝结芽孢杆菌标准株(CICC 20138)、解淀粉芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌：接种至凝结芽孢杆菌液体培养基，37℃恒温静置培养36h，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板；
b.葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌：接种至LB液体培养基，37℃恒温振荡培养(180r/min)24h，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板；
c.粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌：接种至MRS液体培养基中,37℃恒温静置培养24h，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板。
各株细菌DNA提取操作步骤如下：
(1)取培养的细菌菌液4mL，10 000r/min离心1min，尽量吸尽上清液。
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液(称取20mg的溶菌酶溶解在1mL TE缓冲液中，制成终浓度为20mg/mL的溶菌酶液，0.22μm微孔过滤后保存备用)，37℃处理40min。
(3)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心，去除管盖内壁水珠。
(5)加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL无菌双蒸水，室温放置5min，12 000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.PCR扩增
取步骤1所制备的DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增。
PCR总体系为25μL，各组分含量分别为：
反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃温育5min。
3.结果检测
取5μL PCR扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
二、结果
如图3所示，1号泳道为凝结芽孢杆菌标准株(CICC 20138)的扩增结果；2-9号泳道分别为解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌的扩增结果。
由图3可以看出，仅有凝结芽孢杆菌标准菌株(CICC 20138)出现两条清晰条带，大小分别约为345bp与769bp。虽然其他菌株能扩增得到一定条带，但所有对照菌株均不能扩增到目的条带。
本实例表明了本发明提供的检测方法特异性强，可以准确的将凝结芽孢杆菌与其他芽孢杆菌或乳酸菌准确的区别开，特别是与凝结芽孢杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌。
实施例3
引物灵敏性实验
一、实验方法
1.DNA模板制备
按照无菌操作要求，将凝结芽孢杆菌标准菌株(CICC 20138)接种于凝结芽孢杆菌培养液体培养基，37℃恒温静置培养36h，取2mL菌液提取DNA。细菌基因组DNA提取操作步骤如下:
(1)取培养的细菌菌液4mL，10 000r/min离心1min，尽量吸尽上清液。
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液(称取20mg的溶菌酶溶解在1mL TE缓冲液中，制成终浓度为20mg/mL的溶菌酶液，0.22μm微孔过滤后保存备用)，37℃处理40min。
(3)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心，去除管盖内壁水珠。
(5)加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，12 000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL无菌双蒸水，室温放置5min，12 000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
测定提取的细菌基因组DNA浓度，确定浓度后，对DNA样品依次按照10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍进行稀释后，制备DNA模板。
2.PCR扩增
取步骤1所制备的DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增。
PCR总体系为25μL，各组分含量分别为：
反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃温育5min。
3.结果检测
取5μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
二、结果
凝结芽孢杆菌DNA浓度测定结果为78ng/μL，因此稀释后浓度依次为7.8ng/μL、3.9ng/μL、1.56ng/μL、7.8×10-1ng/μL、7.8×10-2ng/μL、7.8×10-3ng/μL、7.8×10-4ng/μL、7.8×10-5ng/μL、7.8×10-6ng/μL。
结果如图4所示，1-5号泳道均能出现清晰条带，5号泳道所对应的浓度为7.8×10- 2ng/μL。因此可准确测定凝结芽孢杆菌的最低模板浓度为7.8×10-2ng/μL。即使用本发明提供的试剂盒检测待检样本可准确检测凝结芽孢杆菌浓度不低于1.6×104cfu/mL的待检样品。
本实例表明了本发明提供的凝结芽孢杆菌的检测方法灵敏度高。
Claims (8)
1.一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)PCR扩增；所述PCR扩增以样品DNA 为模板，用PCR 扩增引物进行扩增；所述PCR扩增引物包含两对PCR 扩增引物，分别为引物对1 和引物对2；所述引物对1为coag-F 和coag-R，引物对2为comK-F 和comK-R ；所述引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；
(3)结果检测。
2.根据权利要求1 所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述步骤(2)PCR 扩增包括PCR 总体系的配置和PCR 扩增反应。
3.根据权利要求2 所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述PCR 总体系容积为25μL，包括PCR 扩增引物、PCR 反应试剂、DNA 模板以及双蒸水。
4.根据权利要求3 所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述PCR 总体系中各组分含量为：
10×PCR Mix 12.5 μL
dd H2O 9.1 μL
DNA模板 1.0 μL
coag-F 0.2 μL
coag-R 0.2 μL
comK-F 1.0 μL
comK-R 1.0 μL。
5.根据权利要求2 所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述PCR 扩增反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30 个循环，最后72℃温育5min。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述结果检测的方法为琼脂糖凝胶电泳。
7.一种快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR 试剂盒，其特征在于：包含两对PCR 扩增引物，分别为引物对1 和引物对2 ；所述引物对1 为coag-F 和coag-R，引物对2 为comK-F 和comK-R ；所述引物序列如SEQ ID NO ：1～4所示。
8.根据权利要求7 所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR 试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含PCR反应试剂，阳性及阴性对照样品。
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