JP2008212083A - テレフタル酸含有廃水処理において微生物を検出または定量するためのプライマーセット、それを用いた微生物量のモニタリング方法およびメタン発酵効率を評価する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】テレフタル酸含有廃水処理において微生物を検出または定量するためのプライマーセット、それを用いた微生物量のモニタリング方法およびメタン発酵効率を評価する方法を提供すること。
【解決手段】テレフタル酸含有廃水処理において、特定の３種類の微生物を検出または定量するための３組のプライマーセットが提供され、これらのプライマーを用いて、上記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定してモニタリングを行い、メタン発酵効率を評価する。
【選択図】なし
【解決手段】テレフタル酸含有廃水処理において、特定の３種類の微生物を検出または定量するための３組のプライマーセットが提供され、これらのプライマーを用いて、上記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定してモニタリングを行い、メタン発酵効率を評価する。
【選択図】なし
Description
本発明は、テレフタル酸含有廃水処理において微生物を検出または定量するためのプライマーセット、それを用いた微生物量のモニタリング方法およびメタン発酵効率を評価する方法に関する。
現在、テレフタル酸含有廃水は、そのほとんどが好気性微生物を用いて処理されている。循環型社会の構築を目指している現代社会では、省エネルギーでエネルギーの回収や汚泥発生量の低減が可能な嫌気性微生物を用いた処理法で廃水処理されることが望まれる。
しかし、テレフタル酸の嫌気性微生物による分解処理は極めて難しい技術である。分解に関与する微生物が混合微生物集団の中で優占種となるとともに、共生関係でバランスされることが不可欠であり、従って微生物量や微生物間のバランスを測定し、モニタリングすることが望まれる。
例えば、特許文献１は、メタン発酵微生物系の評価のためのヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ法で特定のメタン生成菌を検出、定量、モニタリング等を行うことを開示している。ここで検出等されるメタン生成菌は、水素資化性メタン生成菌であるＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ属またはＭｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ科に分類される細菌、あるいは酢酸資化性メタン生成菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属またはＭｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｃｅａｅ科に分類される菌群である。
本発明者らは、以前、テレフタル酸を含む有機性排水の処理方法及び処理装置（反応器）を開発した（特許文献２）。この反応器はテレフタル酸の嫌気的分解を行うが、どのような微生物が分解に関与しているか明らかになっていなかった。また、従来、反応器中の特定微生物量の測定は困難であり、測定したとしても浮遊物質の測定などによる総体的・概略的な測定にとどまり、微生物を用いた反応器にもかかわらず、分解に関与している微生物の情報が無く、微生物量の測定やモニタリングが不可能であった。
本発明の目的は、テレフタル酸含有廃水を処理している反応器でテレフタル酸の分解において鍵となる微生物を把握し、それらを定量またはモニタリングし、メタン発酵効率を評価し、それらの結果に基づいてテレフタル酸含有廃水の高効率嫌気性メタン発酵を行うことである。
本発明者らは、１６Ｓ ｒＤＮＡに基づく分子生物学的手法を用いてテレフタル酸分解の鍵となる３種類の微生物を初めて特定し、それらの微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を元に定量的ＰＣＲ法を用いた鍵となる微生物種定量のためのプライマーセットの開発を行い、それを用いて定量、モニタリングを行い、メタン発酵効率を評価する方法を構築し、本発明を完成した。
本発明の概要は以下のとおりである。
〔１〕テレフタル酸含有廃水処理において、
（１）配列番号１に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
（２）配列番号２に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、または
（３）配列番号３に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
を検出または定量するための、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含む、プライマーセット：
（ａ）上記（１）の微生物を検出または定量するための配列番号４に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）上記（２）の微生物を検出または定量するための配列番号６に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）上記（３）の微生物を検出または定量するための配列番号８に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
〔１〕テレフタル酸含有廃水処理において、
（１）配列番号１に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
（２）配列番号２に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、または
（３）配列番号３に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
を検出または定量するための、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含む、プライマーセット：
（ａ）上記（１）の微生物を検出または定量するための配列番号４に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）上記（２）の微生物を検出または定量するための配列番号６に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）上記（３）の微生物を検出または定量するための配列番号８に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
〔２〕テレフタル酸含有廃水処理において、嫌気性メタン発酵微生物系における〔１〕に記載の（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の微生物量をモニタリングする方法であって、上記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１組のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、上記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することを含む、上記方法。
〔３〕上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べることを含む、〔２〕に記載の方法。
〔４〕上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の微生物量を経時的にモニタリングすることを含む、〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕テレフタル酸含有廃水処理において、嫌気性メタン発酵微生物系におけるメタン発酵効率を評価する方法であって、〔１〕に記載の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１組のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することにより、該微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べ、これによってメタン発酵効率を評価することを含む、上記方法。
〔６〕上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物が嫌気性メタン発酵微生物系において７０％以上優占するとき、メタン発酵効率が良好であると評価する、〔５〕に記載の方法。
〔３〕上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べることを含む、〔２〕に記載の方法。
〔４〕上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の微生物量を経時的にモニタリングすることを含む、〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕テレフタル酸含有廃水処理において、嫌気性メタン発酵微生物系におけるメタン発酵効率を評価する方法であって、〔１〕に記載の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１組のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することにより、該微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べ、これによってメタン発酵効率を評価することを含む、上記方法。
〔６〕上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物が嫌気性メタン発酵微生物系において７０％以上優占するとき、メタン発酵効率が良好であると評価する、〔５〕に記載の方法。
なお、本明細書において「実質的に同一の塩基配列」とは、対応する塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列をいう。
本発明のプライマーセットを用いれば、テレフタル酸含有廃水において、特定の微生物を検出または定量でき、これらの微生物の量や優占化の変化による廃水の処理の状況を確認できる。それにより微生物量を最適に制御して、メタン発酵を安定的・高効率的に運転することができる。
本発明の第１の態様において、本発明のプライマーセットは、テレフタル酸含有廃水処理において、
（１）配列番号１に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
（２）配列番号２に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、または
（３）配列番号３に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
を検出または定量するための、下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれか１組のオリゴヌクレオチド：
（ａ）上記（１）の微生物を検出または定量するための配列番号４に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）上記（２）の微生物を検出または定量するための配列番号６に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）上記（３）の微生物を検出または定量するための配列番号８に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を含むことを特徴とする。
（１）配列番号１に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
（２）配列番号２に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、または
（３）配列番号３に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
を検出または定量するための、下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれか１組のオリゴヌクレオチド：
（ａ）上記（１）の微生物を検出または定量するための配列番号４に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）上記（２）の微生物を検出または定量するための配列番号６に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）上記（３）の微生物を検出または定量するための配列番号８に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を含むことを特徴とする。
上記（１）の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号１）、上記（２）の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号２）、上記（３）の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号３）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースに、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４２４７６９、ＡＦ４２４７６５、ＤＱ８９８１４２で開示されている。
上記（１）〜（３）の微生物は、本発明において初めて、本発明者らが開発した特許文献２に記載の有機性廃水の処理装置（反応器）中の活性炭を含む反応器内溶液から優占種として同定され、その挙動がメタン発酵の指標となりうることが今回明らかになった。
上記（１）〜（３）の微生物の同定は、例えば以下のようにして行うことができる。
反応器内溶液をサンプルとして、リゾチームで溶菌させ、プロテイナーゼＫを含む抽出緩衝液中でタンパク質を分解し、ＲＮａｓｅ Ａで処理してＲＮＡ分解を行った後、サンプル中のＤＮＡをスピンカラムのシリカメンブレンに吸着させ、洗浄した後、溶出する。
反応器内溶液をサンプルとして、リゾチームで溶菌させ、プロテイナーゼＫを含む抽出緩衝液中でタンパク質を分解し、ＲＮａｓｅ Ａで処理してＲＮＡ分解を行った後、サンプル中のＤＮＡをスピンカラムのシリカメンブレンに吸着させ、洗浄した後、溶出する。
抽出されたｔｏｔａｌ ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する。このＰＣＲでは全菌叢について解析するためにｔｏｔａｌ ＤＮＡを増幅するので、大部分の原核生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされる、ユニバーサルプライマーを用いる。
ＰＣＲ反応条件は、例えば、２本鎖ＤＮＡの熱変性を９０〜９５℃で３０秒〜５分間行い、アニーリングを５０〜７０℃で３０秒〜２分間行い、伸長反応を７０〜７４℃で１〜５分間行う。任意に、最終伸長反応を伸長反応と同じ温度で５〜１５分間行う。熱変性−アニーリング−伸長反応のサイクルを２０〜５０回行う。
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、バンドを切り出してゲルを溶解させ、スピンカラムなどでＤＮＡを抽出・精製し、ＰＣＲ増幅産物精製サンプルとする。
ＰＣＲ増幅産物をクローニングするため、ベクター（例えばｐＣＲ４、ｐＭＷ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＤＥＬ系などのプラスミドベクター、Ｍ１３ｍｐなどのファージベクター、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９系などのコスミドベクター）に、ＰＣＲ増幅産物をライゲーションさせ、コンピテントセルに形質転換させる。ベクターにはさらにプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを適宜含めることができる。
形質転換したコンピテントセルを培養してコロニーを形成させ、塩基配列の解読のためのサンプルとする。
塩基配列の解読は、従来法を用いればよく、例えばＳａｎｇｅｒ法、サイクルシークエンス法による自動シークエンサーを利用することができる。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法と、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法があるが、いずれの方法でもよい。
解読された塩基配列をＮＣＢＩ（米国）などが提供しているプログラムを用いて、相同性検索を行い、微生物を同定する。
理論上、上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子クローニングにより同定された微生物群集中の各微生物種の出現頻度は、反応器内に存在している全細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中に占める各微生物種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の割合を反映しているはずである。このことから同定された微生物群集のうち、特に占有率の高かった微生物種は反応器内において優占化が進み、有機物分解過程において重要な役割を果たしていると考えられる。そこでプライマーを設計・開発し、優占種の微生物を同定する。プライマーの設計・開発手順を図１に示す。
優占種であると予想される微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対し特異性を持つ塩基配列を決定し、プライマーを設計する。プライマーを合成し、それを用いてＰＣＲにおけるアニーリング温度を検討し、ＰＣＲ反応条件を決定する。なお、ＰＣＲ増幅産物は、電気泳動により確認することが好ましい。
ＰＣＲの増幅効率および設計されたプライマーの標的塩基配列への特異性の確認のため、決定したＰＣＲ反応条件下で定量的ＰＣＲ法（例えばＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法）を行い、増幅曲線分析および融解曲線分析を行う。さらに、増幅されたＤＮＡの塩基配列の解読を上記と同様にして行い、優占種である微生物を同定する。
本発明の上記（ａ）〜（ｃ）のプライマーセットは、上記（１）〜（３）の微生物を検出または定量するために用いることができ、これにより、テレフタル酸含有排水処理の安定的かつ効率的運転のために利用することができる。
配列番号４に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列においてプライマーとして使用することができる。
配列番号６に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列においてプライマーとして使用することができる。
配列番号８に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示される塩基配列においてプライマーとして使用することができる。
また、上記（ａ）〜（ｃ）のプライマーセットは、単独で使用してもよいし、２つまたは３つ組合せて使用してもよい。
本発明の第２の態様において、本発明の、テレフタル酸含有廃水において嫌気性メタン発酵微生物系における上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の微生物量をモニタリングする方法は、上記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１組のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、上記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することを含むことを特徴とする。
１６Ｓ ｒＤＮＡ量の測定は、反応器内溶液をサンプルとし、上述の手法でＤＮＡを抽出し、上記プライマーセット（配列番号４および５、配列番号６および７、配列番号８および９）を用いて定量的ＰＣＲ、例えばＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法などで行うことができる。これにより、メタン発酵微生物系における上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の優占状況を調べることができる。
また、経時的に上記（１）〜（３）の微生物の微生物量をモニタリングすれば、その量を確認しながら反応器を運転することができる。上記（１）〜（３）の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ濃度が一時低下している時期には、流出テレフタル酸およびＣＯＤ濃度も上昇し、メタン生成速度も低下することがわかっている（実施例５参照）。従って、上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の量が減少したときには、廃水の供給量を減らす、一時的に供給を止めるなどの操作により、微生物の良好なバランスを維持することができる。反応器の安定的な高効率運転は、廃水の安定的な処理や効率的なエネルギー回収となり、循環型社会の構築に役立つと考えられる。
本発明の第３の態様において、本発明の、テレフタル酸含有廃水処理において嫌気性メタン発酵微生物系におけるメタン発酵効率を評価する方法は、上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することにより、該微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べ、これによってメタン発酵効率を評価することを含むことを特徴とする。
１６Ｓ ｒＤＮＡ量の測定は、上述のように、反応器内溶液をサンプルとし、上述の手法でＤＮＡを抽出し、上記プライマーセット（配列番号４および５、配列番号６および７、配列番号８および９）を用いて定量的ＰＣＲ、例えばＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法などで行うことができる。そして、メタン発酵微生物系における上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の優占状況を調べ、メタン発酵効率を評価する。
メタン発酵効率の評価は、上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物が嫌気性メタン発酵微生物系において好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上占有するとき、メタン発酵効率が良好であるとする。７０％を下回った場合は、反応器でのメタン発酵効率を向上させるため、上述のように、廃水の供給量を減らす、一時的に供給を止めるなどの操作を行い、負荷率を制御することが好ましい。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
試薬等の調製
本実施例において、全てのオートクレーブ滅菌操作はＴＯＭＹ−ＢＳ３０５により１２０℃、２０分間の条件で行った。蒸留水はＡＤＶＡＮＴＥＣ製蒸留水製造装置ＧＳ−５００により、超純水はＡＤＶＡＮＴＥＣ製超純水製造装置ＣＰＷ−２００により製造された比抵抗値１８ＭΩ以上のものを使用した。以下に各試薬について、その調製方法を示す。
（１）滅菌超純水
超純水を清浄なメディウムビンに入れ、オートクレーブ滅菌したものを使用した。
（２）１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
超純水２００ｍＬに３０．３ｇのＴｒｉｓを加えてスターラーで溶かし、塩酸(和光、試薬特級)を加えながらｐＨメーターでｐＨ８．０になるように調整した後、再び超純水を加え２５０ｍＬまでメスアップした。その後清浄なメディウムビンに移し変え、オートクレーブ後４℃で保存した。
（３）０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
超純水２００ｍＬに４６．５ｇのＥＤＴＡ（アマシャム）を加え、スターラーで撹拌しながら粒状の水酸化ナトリウム（和光、試薬特級）を約５ｇ加えＥＤＴＡを溶解させた。続いて５Ｎ水酸化ナトリウムを加えながらｐＨ８．０になるよう調整した後、超純水を加えて２５０ｍＬまでメスアップした。その後清浄なメディウムビンに移し変え、オートクレーブ後４℃で保存した。
本実施例において、全てのオートクレーブ滅菌操作はＴＯＭＹ−ＢＳ３０５により１２０℃、２０分間の条件で行った。蒸留水はＡＤＶＡＮＴＥＣ製蒸留水製造装置ＧＳ−５００により、超純水はＡＤＶＡＮＴＥＣ製超純水製造装置ＣＰＷ−２００により製造された比抵抗値１８ＭΩ以上のものを使用した。以下に各試薬について、その調製方法を示す。
（１）滅菌超純水
超純水を清浄なメディウムビンに入れ、オートクレーブ滅菌したものを使用した。
（２）１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
超純水２００ｍＬに３０．３ｇのＴｒｉｓを加えてスターラーで溶かし、塩酸(和光、試薬特級)を加えながらｐＨメーターでｐＨ８．０になるように調整した後、再び超純水を加え２５０ｍＬまでメスアップした。その後清浄なメディウムビンに移し変え、オートクレーブ後４℃で保存した。
（３）０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
超純水２００ｍＬに４６．５ｇのＥＤＴＡ（アマシャム）を加え、スターラーで撹拌しながら粒状の水酸化ナトリウム（和光、試薬特級）を約５ｇ加えＥＤＴＡを溶解させた。続いて５Ｎ水酸化ナトリウムを加えながらｐＨ８．０になるよう調整した後、超純水を加えて２５０ｍＬまでメスアップした。その後清浄なメディウムビンに移し変え、オートクレーブ後４℃で保存した。
（４）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２００μＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４０μＬ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光、生化学用）を１２０μＬ入れ、滅菌超純水を加え１０ｍＬにメスアップし、ふたをして激しく混合して均一な溶液とした。
（５）リゾチーム溶液
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを使用直前に必要量だけ取り、卵白由来リゾチーム（和光、生化学用）を２０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かした。
（６）電気泳動用アガロースゲル
ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ（和光、遺伝子工学研究用）にアガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を２．０％（ｗ／ｖ）となるように加え、電子レンジで加熱した。アガロースが完全に溶けたらスターラーで混合しながら冷却し、ゲルが固まる直前（約４５℃）にゲルメーカーに流し込みコームを挿し、その後３０分ほど静置した。完全に固まった後、コームを抜きゲルトレイごとＴＡＥ中に浸して常温で保存した。
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２００μＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４０μＬ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光、生化学用）を１２０μＬ入れ、滅菌超純水を加え１０ｍＬにメスアップし、ふたをして激しく混合して均一な溶液とした。
（５）リゾチーム溶液
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを使用直前に必要量だけ取り、卵白由来リゾチーム（和光、生化学用）を２０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かした。
（６）電気泳動用アガロースゲル
ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ（和光、遺伝子工学研究用）にアガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を２．０％（ｗ／ｖ）となるように加え、電子レンジで加熱した。アガロースが完全に溶けたらスターラーで混合しながら冷却し、ゲルが固まる直前（約４５℃）にゲルメーカーに流し込みコームを挿し、その後３０分ほど静置した。完全に固まった後、コームを抜きゲルトレイごとＴＡＥ中に浸して常温で保存した。
（７）１，０００×カナマイシン
カナマイシン硫酸塩（和光、試薬特級）を蒸留水に５０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かし、０．２μｍγ線滅菌済フィルターにより濾過滅菌してマイクロチューブに分注した。その後−２０℃で保存した。
（８）１，０００×Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（和光、試薬特級）にＸ−ｇａｌ（和光、試薬特級）を４０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かし、マイクロチューブに分注した。その後アルミホイルで覆い、使用時まで−２０℃で遮光保存した。
（９）１，０００×ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
ＩＰＴＧ（和光、試薬特級）を超純水に４０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かした後０．２μｍγ線滅菌済フィルターで濾過滅菌してマイクロチューブに分注した。−２０℃で保存した。
カナマイシン硫酸塩（和光、試薬特級）を蒸留水に５０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かし、０．２μｍγ線滅菌済フィルターにより濾過滅菌してマイクロチューブに分注した。その後−２０℃で保存した。
（８）１，０００×Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（和光、試薬特級）にＸ−ｇａｌ（和光、試薬特級）を４０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かし、マイクロチューブに分注した。その後アルミホイルで覆い、使用時まで−２０℃で遮光保存した。
（９）１，０００×ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
ＩＰＴＧ（和光、試薬特級）を超純水に４０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かした後０．２μｍγ線滅菌済フィルターで濾過滅菌してマイクロチューブに分注した。−２０℃で保存した。
（１０）ＬＢ寒天培地
必要量の超純水にＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｂａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０ｇ／Ｌ、ＬＢ Ａｇａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３２ｇ／Ｌとなるように加えオートクレーブ滅菌して溶かした後、スターラーにより攪拌しながら室温で冷却した。６０℃程度まで温度が下がった時点で１，０００×カナマイシン、１，０００×Ｘ−ｇａｌ、１，０００×ＩＰＴＧ溶液をカナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧの最終濃度がそれぞれ５０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬとなるように加え攪拌した。これを滅菌済ペトリ皿に１枚あたり約１０ｍＬずつ注いでいき、固まってからＡＳパックで包み４℃で保存した。
（１１）各種プライマー
１６Ｓ ｒＲＮＡクローニング過程、プライマー設計・開発およびリアルタイムＰＣＲで使用したプライマーは全てＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳに依頼して合成されたもので、乾燥出荷品を滅菌超純水に溶解して使用した。
必要量の超純水にＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｂａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０ｇ／Ｌ、ＬＢ Ａｇａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３２ｇ／Ｌとなるように加えオートクレーブ滅菌して溶かした後、スターラーにより攪拌しながら室温で冷却した。６０℃程度まで温度が下がった時点で１，０００×カナマイシン、１，０００×Ｘ−ｇａｌ、１，０００×ＩＰＴＧ溶液をカナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧの最終濃度がそれぞれ５０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬとなるように加え攪拌した。これを滅菌済ペトリ皿に１枚あたり約１０ｍＬずつ注いでいき、固まってからＡＳパックで包み４℃で保存した。
（１１）各種プライマー
１６Ｓ ｒＲＮＡクローニング過程、プライマー設計・開発およびリアルタイムＰＣＲで使用したプライマーは全てＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳに依頼して合成されたもので、乾燥出荷品を滅菌超純水に溶解して使用した。
ｔｏｔａｌ ＤＮＡの抽出および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子クローニング
サンプリングは反応器（特許文献２に記載）上部のサンプリング口からオートクレーブ滅菌したテフロンチューブを挿入し、滅菌済シリンジにより無菌的に活性炭を含む反応器内溶液を吸引することで行った。
ａ）サンプルからのｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出
ＤＮＡの抽出にはＱＩＡＧＥＮのＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用し、おおむねキット付属のプロトコルに従った。
（ｉ）溶菌およびタンパク質の分解
まずサンプル１ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに採取し、１０，０００ｇで１０分間遠心した。上澄み液を捨て、残った活性炭に直前に調製したリゾチーム溶液１８０μＬを加え、よく混和した後３７℃で１時間インキュベートし溶菌させた。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ２５μＬおよびキット付属のＡＬ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬを順に加え混和し、さらに７０℃で１時間インキュベートした。
サンプリングは反応器（特許文献２に記載）上部のサンプリング口からオートクレーブ滅菌したテフロンチューブを挿入し、滅菌済シリンジにより無菌的に活性炭を含む反応器内溶液を吸引することで行った。
ａ）サンプルからのｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出
ＤＮＡの抽出にはＱＩＡＧＥＮのＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用し、おおむねキット付属のプロトコルに従った。
（ｉ）溶菌およびタンパク質の分解
まずサンプル１ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに採取し、１０，０００ｇで１０分間遠心した。上澄み液を捨て、残った活性炭に直前に調製したリゾチーム溶液１８０μＬを加え、よく混和した後３７℃で１時間インキュベートし溶菌させた。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ２５μＬおよびキット付属のＡＬ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬを順に加え混和し、さらに７０℃で１時間インキュベートした。
（ｉｉ）ＲＮＡの分解
１００ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ）を４μＬ添加し、室温で２分間静置することでＲＮＡを分解した。
１００ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ）を４μＬ添加し、室温で２分間静置することでＲＮＡを分解した。
（ｉｉｉ）Ｓｉｌｉｃａ ＭｅｍｂｒａｎｅへのＤＮＡ吸着
９９．５％エタノール（和光、試薬特級）２００μＬを加えよく混和した後、全内容物をキット添え付けのＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（以下カラム）のＳｉｌｉｃａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ上に添加し、１０，０００ｇで３分間遠心した。全添加液が通過した後、濾液を捨て、カラムをキット添え付けの新しいｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅにセットし直した。
９９．５％エタノール（和光、試薬特級）２００μＬを加えよく混和した後、全内容物をキット添え付けのＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（以下カラム）のＳｉｌｉｃａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ上に添加し、１０，０００ｇで３分間遠心した。全添加液が通過した後、濾液を捨て、カラムをキット添え付けの新しいｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅにセットし直した。
（ｉｖ）ＤＮＡの洗浄
カラムにＡＷ１ ｂｕｆｆｅｒ ５００μＬを加え、６，０００ｇで１分間遠心し濾液を捨てた後、再びカラムを新しいｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅにセットし直した。続いてカラムにＡＷ２ ｂｕｆｆｅｒ ５００μＬを加え、２０，０００ｇで３分間の遠心を行った後、カラムを新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し変えた。
カラムにＡＷ１ ｂｕｆｆｅｒ ５００μＬを加え、６，０００ｇで１分間遠心し濾液を捨てた後、再びカラムを新しいｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅにセットし直した。続いてカラムにＡＷ２ ｂｕｆｆｅｒ ５００μＬを加え、２０，０００ｇで３分間の遠心を行った後、カラムを新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し変えた。
（ｖ）ＤＮＡの回収
カラムに滅菌超純水１００μＬを加え、１分間静置した後６，０００ｇで１分間遠心するという作業を２回繰り返した。カラムを捨て、濾液約２００μＬをｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出サンプルとした。ＤＮＡサンプルは−２０℃以下の冷凍庫で保存し、次回使用時には室温で解凍して用いた。
カラムに滅菌超純水１００μＬを加え、１分間静置した後６，０００ｇで１分間遠心するという作業を２回繰り返した。カラムを捨て、濾液約２００μＬをｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出サンプルとした。ＤＮＡサンプルは−２０℃以下の冷凍庫で保存し、次回使用時には室温で解凍して用いた。
ｂ）ＰＣＲによる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅および精製
抽出されたｔｏｔａｌ ＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅するため、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。以下にその手順を示す。
抽出されたｔｏｔａｌ ＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅するため、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。以下にその手順を示す。
（ｉ）ＰＣＲ
ここでは全菌叢解析が目的のため、ユニバーサルプライマーＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）およびＵＮＩＶ１４０６Ｒ（配列番号１１）を使用した。
反応液は、表１のとおり調製し、表２に示す反応条件にてＰＣＲを行った。酵素液はＰｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ、Ｅｘ Ｔａｑ ｖｅｒｓｉｏｎ）を使用した。サーマルサイクラーにはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｅｒを用いた。
ここでは全菌叢解析が目的のため、ユニバーサルプライマーＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）およびＵＮＩＶ１４０６Ｒ（配列番号１１）を使用した。
反応液は、表１のとおり調製し、表２に示す反応条件にてＰＣＲを行った。酵素液はＰｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ、Ｅｘ Ｔａｑ ｖｅｒｓｉｏｎ）を使用した。サーマルサイクラーにはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｅｒを用いた。
（ｉｉ）電気泳動
ＰＣＲ増幅産物は電気泳動により確認した。ＰＣＲ反応液およびサイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ）に×５Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）を加え、電気泳動用ゲルにアプライした。電気泳動は１３５Ｖで３０〜４０分行い、その後１μｇエチジウムブロマイド（和光、試薬特級）／ｍＬ ＴＡＥ溶液に約３０分浸漬させた後、トランスイルミネーター（フナコシ製）によりＵＶ光を照射し観察した。サイズマーカーと比較対照することで増幅産物の長さおよび濃度を確認した。
ＰＣＲ増幅産物は電気泳動により確認した。ＰＣＲ反応液およびサイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ）に×５Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）を加え、電気泳動用ゲルにアプライした。電気泳動は１３５Ｖで３０〜４０分行い、その後１μｇエチジウムブロマイド（和光、試薬特級）／ｍＬ ＴＡＥ溶液に約３０分浸漬させた後、トランスイルミネーター（フナコシ製）によりＵＶ光を照射し観察した。サイズマーカーと比較対照することで増幅産物の長さおよび濃度を確認した。
（ｉｉｉ）ゲルからの増幅産物精製
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ増幅産物の精製を行った。精製手順はおおむねキット付属の説明書に従った。
まずトランスイルミネーターによりＵＶを照射しながらγ線滅菌済のメスにより増幅産物と思われるバンドを切り出し、マイクロチューブに移した。切り出したゲル断片の３倍重量のＢｕｆｆｅｒ ＱＧを加え、ボルテックスミキサーにより混和しながら５０℃で約１０分インキュベートした。ゲルが完全に溶解したら溶液の色が黄色であることを視認し、適切なｐＨ範囲にあることを確認した。この溶液を全量ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を除去した。次にＢｕｆｆｅｒ ＰＥ ７５０μＬをカラムに加え、室温で２分静置してから１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。カラムを新しいマイクロチューブに移し、滅菌超純水３０μＬを加え１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、流出液をＰＣＲ増幅産物精製サンプルとした。
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ増幅産物の精製を行った。精製手順はおおむねキット付属の説明書に従った。
まずトランスイルミネーターによりＵＶを照射しながらγ線滅菌済のメスにより増幅産物と思われるバンドを切り出し、マイクロチューブに移した。切り出したゲル断片の３倍重量のＢｕｆｆｅｒ ＱＧを加え、ボルテックスミキサーにより混和しながら５０℃で約１０分インキュベートした。ゲルが完全に溶解したら溶液の色が黄色であることを視認し、適切なｐＨ範囲にあることを確認した。この溶液を全量ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を除去した。次にＢｕｆｆｅｒ ＰＥ ７５０μＬをカラムに加え、室温で２分静置してから１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。カラムを新しいマイクロチューブに移し、滅菌超純水３０μＬを加え１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、流出液をＰＣＲ増幅産物精製サンプルとした。
ｃ）ＴＡクローニングによる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の単離
ＰＣＲ増幅産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングはＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従い、ベクターはｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ、コンピテントセルはＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉを使用した。
ＰＣＲ増幅産物中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングはＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従い、ベクターはｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ、コンピテントセルはＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉを使用した。
（ｉ）ＰＣＲ増幅産物とベクターのライゲーション
まずＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）によりＰＣＲ増幅産物精製サンプル中のＤＮＡ濃度を測定し、マイクロチューブにＰＣＲ増幅産物ＤＮＡ量が約２０ｎｇになるように加え、続いてｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １μＬおよび滅菌超純水を加え全量を５μＬに調製した後、ベクター１μＬを加え、軽く混和し室温で２５分静置した。
まずＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）によりＰＣＲ増幅産物精製サンプル中のＤＮＡ濃度を測定し、マイクロチューブにＰＣＲ増幅産物ＤＮＡ量が約２０ｎｇになるように加え、続いてｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １μＬおよび滅菌超純水を加え全量を５μＬに調製した後、ベクター１μＬを加え、軽く混和し室温で２５分静置した。
（ｉｉ）トランスフォーメーション
ライゲーション溶液２μＬをコンピテントセルチューブに加え、穏やかに混和後氷上で約１５分インキュベートした。続いてコンピテントセルチューブを４２℃で３０秒インキュベートした後、直ちに氷上に戻した。そこにキット備え付けのＳ．Ｏ．Ｃ ｍｅｄｉｕｍ２５０μＬを加え３７℃、２００ｒｐｍでおよそ１時間振とう培養した。
ライゲーション溶液２μＬをコンピテントセルチューブに加え、穏やかに混和後氷上で約１５分インキュベートした。続いてコンピテントセルチューブを４２℃で３０秒インキュベートした後、直ちに氷上に戻した。そこにキット備え付けのＳ．Ｏ．Ｃ ｍｅｄｉｕｍ２５０μＬを加え３７℃、２００ｒｐｍでおよそ１時間振とう培養した。
（ｉｉｉ）選択培養
あらかじめ３７℃にインキュベートしておいたＬＢ寒天培地１枚あたりにつき、培養の終わったコンピテントセル溶液３０〜５０μＬを滅菌済コンラージ棒を用いて撒き、３７℃で一晩培養した。形成された白色コロニー中の大腸菌にはＰＣＲ増幅産物をインサートにもつベクターが正しくトランスフォーメーションされていると見なし、塩基配列の解読作業に供した。
あらかじめ３７℃にインキュベートしておいたＬＢ寒天培地１枚あたりにつき、培養の終わったコンピテントセル溶液３０〜５０μＬを滅菌済コンラージ棒を用いて撒き、３７℃で一晩培養した。形成された白色コロニー中の大腸菌にはＰＣＲ増幅産物をインサートにもつベクターが正しくトランスフォーメーションされていると見なし、塩基配列の解読作業に供した。
ｄ）塩基配列の解読（シークエンシング）
塩基配列の解読作業は、タカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターにて以下のよう行った。
コロニーが形成されたペトリ皿から白コロニーをランダムに選びＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｙｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によりシークエンス用テンプレートを調製した。調製したテンプレートＤＮＡを鋳型としてＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）を用いてＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法によりシークエンス反応を行った。シークエンス反応産物はゲル濾過法または核酸結合ビーズを用いて精製し、キャピラリー型シークエンサを用いてシークエンス解析を実施した。シーケンスデータは機器付属のベースコーラを用いて波形データに変換した。得られた波形データについてＰｈｒｅｄ（Ｃｏｄｏｎ Ｃｏｄｅ Ｉｎｃ， ｖｅｒ．０．０２０４２５．ｃ）によりベースコールを行った後、各塩基のＰｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ値を算出した。Ｐｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ値が１５以上である塩基が３００塩基以上のリードを有効とした。その後、Ｐｈｒｅｄ によりベースコールを行ったデータについてＰＦＰ（Ｐａｒａｃｅｌ Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ Ｐａｃｋａｇｅ、パラセル社）によりｐｈｒｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ値が１５未満の両端低クオリティ塩基のマスキングおよびベクター配列の除去作業を行った。
塩基配列の解読作業は、タカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターにて以下のよう行った。
コロニーが形成されたペトリ皿から白コロニーをランダムに選びＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｙｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によりシークエンス用テンプレートを調製した。調製したテンプレートＤＮＡを鋳型としてＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）を用いてＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法によりシークエンス反応を行った。シークエンス反応産物はゲル濾過法または核酸結合ビーズを用いて精製し、キャピラリー型シークエンサを用いてシークエンス解析を実施した。シーケンスデータは機器付属のベースコーラを用いて波形データに変換した。得られた波形データについてＰｈｒｅｄ（Ｃｏｄｏｎ Ｃｏｄｅ Ｉｎｃ， ｖｅｒ．０．０２０４２５．ｃ）によりベースコールを行った後、各塩基のＰｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ値を算出した。Ｐｈｒｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ値が１５以上である塩基が３００塩基以上のリードを有効とした。その後、Ｐｈｒｅｄ によりベースコールを行ったデータについてＰＦＰ（Ｐａｒａｃｅｌ Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ Ｐａｃｋａｇｅ、パラセル社）によりｐｈｒｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ値が１５未満の両端低クオリティ塩基のマスキングおよびベクター配列の除去作業を行った。
ｅ）相同性検索および微生物同定
最後に解読された塩基配列をデータベース中のエントリーと比較することで相同性検索を行い、その塩基配列がどの微生物のものであるかを同定した。相同性検索にはＮＣＢＩが提供しているウェブプログラムｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を使用し、検索データベースはＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔを使用した。
最後に解読された塩基配列をデータベース中のエントリーと比較することで相同性検索を行い、その塩基配列がどの微生物のものであるかを同定した。相同性検索にはＮＣＢＩが提供しているウェブプログラムｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を使用し、検索データベースはＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔを使用した。
優占種の同定および定量用プライマーの開発
嫌気性メタン発酵微生物系における優占種を同定し、これらの微生物種の量的変化をモニタリングし、その結果を反応器の運転状況と照合することでその微生物指標の有用性を調査するため、リアルタイムＰＣＲを用いてそのＤＮＡ量を定量するためのプライマーを設計・開発した。
嫌気性メタン発酵微生物系における優占種を同定し、これらの微生物種の量的変化をモニタリングし、その結果を反応器の運転状況と照合することでその微生物指標の有用性を調査するため、リアルタイムＰＣＲを用いてそのＤＮＡ量を定量するためのプライマーを設計・開発した。
まず、定量の対象となる微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対し特異性をもつ塩基配列を決定することでプライマーを設計し、ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社へ依頼して合成した。次にＰＣＲの反応条件におけるアニーリング温度の最適値を決定するため、合成されたプライマーを用いて種々のアニーリング温度でＰＣＲを行った。続いてＰＣＲの増幅効率および設計されたプライマーの標的塩基配列への特異性の確認のため、増幅曲線分析および融解曲線分析を試みた。さらに設計されたプライマーを用いて増幅されたＤＮＡの塩基配列を解読することで、目標塩基配列が正しく増幅されていることを確かめた。
ａ）プライマーの設計
プライマーの設計は複数のウェブプログラムを利用して行った。それらの手順およびＵＲＬを図２に示す。
プライマーの設計は複数のウェブプログラムを利用して行った。それらの手順およびＵＲＬを図２に示す。
プライマー候補配列の選出にはｐｒｉｍｅｒ３を利用した。その際デフォルトの設定に対し、プライマーの配列長を１８〜２５ｂｐ、Ｔｍを６０．０〜６５．０、ＧＣ含量４０．０〜６０．０％、また増幅産物の配列長が１００〜３００ｂｐになるように条件を加えた。選出されたプライマー候補配列を用いてｂｌａｓｔｎにより相同性検索を行い、標的配列に対する特異性を確認した。最後にｇｅｎｅ−ｗａｌｋｅｒを用いて、プライマー候補配列自身が二次構造あるいはダイマーを形成しＰＣＲの反応効率に悪影響を及ぼす可能性が低いことを確認した。
ｂ）ＰＣＲにおけるアニーリング温度の最適化
標的塩基配列が最も効率的に増幅されるアニーリング温度を決定するため、設計したプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応液は表３に示す組成で調製した。サーマルサイクラーはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｅｒを使用し、反応条件は表４に示したとおりで、温度勾配機能を用いてアニーリング温度を４６．０〜７０．０℃に設定した。酵素液はＰｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ、Ｅｘ Ｔａｑ ｖｅｒｓｉｏｎ）を使用した。
標的塩基配列が最も効率的に増幅されるアニーリング温度を決定するため、設計したプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応液は表３に示す組成で調製した。サーマルサイクラーはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｅｒを使用し、反応条件は表４に示したとおりで、温度勾配機能を用いてアニーリング温度を４６．０〜７０．０℃に設定した。酵素液はＰｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ、Ｅｘ Ｔａｑ ｖｅｒｓｉｏｎ）を使用した。
ＰＣＲ増幅産物は電気泳動により確認した。ＰＣＲ反応液およびサイズマーカー１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ）に×５Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）を加え、電気泳動用ゲルにアプライした。電気泳動は１３５Ｖで３０〜４０分行い、その後１μｇエチジウムブロマイド（和光、試薬特級）／ｍＬ ＴＡＥ溶液に約３０分浸漬させた後、トランスイルミネーター（フナコシ製）によりＵＶ光を照射し観察した。サイズマーカーと比較対照することで増幅産物の長さおよび濃度を確認した。
ｃ）増幅曲線分析および融解曲線分析
最適化されたアニーリング温度で実際にリアルタイムＰＣＲを行い、その増幅曲線からＰＣＲが一定の反応効率で行われていること、融解曲線から単一の塩基配列が増幅されていることを確認した。
最適化されたアニーリング温度で実際にリアルタイムＰＣＲを行い、その増幅曲線からＰＣＲが一定の反応効率で行われていること、融解曲線から単一の塩基配列が増幅されていることを確認した。
リアルタイムＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒおよび専用の２０μＬガラスキャピラリー（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、２本鎖ＤＮＡ検出のための蛍光物質および酵素液にはＦａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｐｌｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。増幅曲線分析および融解曲線分析におけるＰＣＲ反応液組成を表５に、反応条件を表６に示す。
なお、アニーリング温度は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプライマーセットのいずれにおいても６０℃とした。
ｄ）設計プライマーによる増幅産物の塩基配列解読
設計プライマーによりＰＣＲを行った反応液を用いて、実施例２と同様の方法で電気泳動およびゲルからの増幅産物精製を行い、タカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターに依頼し精製されたＤＮＡの塩基配列を解読した。解読された塩基配列はＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）の提供しているウェブプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｗ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｃｌｕｓｔａｌｗ−ｊ．ｈｔｍｌ）により標的塩基配列とアラインメントを行い、その相同性を確認した。
設計プライマーによりＰＣＲを行った反応液を用いて、実施例２と同様の方法で電気泳動およびゲルからの増幅産物精製を行い、タカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターに依頼し精製されたＤＮＡの塩基配列を解読した。解読された塩基配列はＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）の提供しているウェブプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｗ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｃｌｕｓｔａｌｗ−ｊ．ｈｔｍｌ）により標的塩基配列とアラインメントを行い、その相同性を確認した。
上記方法により同定された優占種は、ＮＣＢＩのデータベースにＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４２４７６９で開示される１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号１）を有する微生物（１）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４２４７６５で開示される１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号２）を有する微生物（２）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ８９８１４２で開示される１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（配列番号３）を有する微生物（３）、であることが明らかとなった。
優占微生物種および全細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量
設計・開発されたプライマー（配列番号４〜９）を使用し、ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出サンプル中に存在する優占微生物種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の定量を行った。以下にその定量方法を示す。
設計・開発されたプライマー（配列番号４〜９）を使用し、ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出サンプル中に存在する優占微生物種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の定量を行った。以下にその定量方法を示す。
ａ）外部標準物質の作製
まず定量の際に増幅サンプルとの蛍光強度を比較し、濃度を算出するための外部標準物質を作製する。外部標準物質は各プライマーセットごとに作製する必要があり、設計・開発した各プライマーセットおよびユニバーサルプライマーセットＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）およびＵＮＩＶ１４０６Ｒ（配列番号１１）に対して作製した。
設計・開発した各プライマーセットおよびユニバーサルプライマーセットＵＮＩＶ５１９ＦおよびＵＮＩＶ１４０６Ｒを使用し、まず表５および表６に示したものと同様の組成および反応条件でリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光強度が１００前後まで増加した時点で反応を停止させた。次に回収したＰＣＲ反応液に対して実施例２と同様の方法で電気泳動およびゲルからの増幅産物精製を行った。このゲルからの精製サンプルを新たなＤＮＡサンプルとして再び表５の組成でリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光強度が１００前後まで増加した時点で反応を停止させた。ＰＣＲ反応液を回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従い増幅産物の精製を行った。この精製作業内容はＰＣＲ反応液に５倍量のＢｕｆｆｅｒ ＰＢを加えて混和してからスピンカラムに添加し、以降の手順は実施例２のゲルからの増幅産物精製と同様に行った。精製されたＤＮＡ溶液中のＤＮＡ濃度はＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）により測定した。滅菌超純水を溶媒として１０倍濃度間隔で精製ＤＮＡサンプルの希釈系列を作製し、リアルタイムＰＣＲの外部標準物質に使用した。
まず定量の際に増幅サンプルとの蛍光強度を比較し、濃度を算出するための外部標準物質を作製する。外部標準物質は各プライマーセットごとに作製する必要があり、設計・開発した各プライマーセットおよびユニバーサルプライマーセットＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）およびＵＮＩＶ１４０６Ｒ（配列番号１１）に対して作製した。
設計・開発した各プライマーセットおよびユニバーサルプライマーセットＵＮＩＶ５１９ＦおよびＵＮＩＶ１４０６Ｒを使用し、まず表５および表６に示したものと同様の組成および反応条件でリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光強度が１００前後まで増加した時点で反応を停止させた。次に回収したＰＣＲ反応液に対して実施例２と同様の方法で電気泳動およびゲルからの増幅産物精製を行った。このゲルからの精製サンプルを新たなＤＮＡサンプルとして再び表５の組成でリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光強度が１００前後まで増加した時点で反応を停止させた。ＰＣＲ反応液を回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従い増幅産物の精製を行った。この精製作業内容はＰＣＲ反応液に５倍量のＢｕｆｆｅｒ ＰＢを加えて混和してからスピンカラムに添加し、以降の手順は実施例２のゲルからの増幅産物精製と同様に行った。精製されたＤＮＡ溶液中のＤＮＡ濃度はＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）により測定した。滅菌超純水を溶媒として１０倍濃度間隔で精製ＤＮＡサンプルの希釈系列を作製し、リアルタイムＰＣＲの外部標準物質に使用した。
ｂ）優占微生物種および全細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量
設計・開発した各プライマーセットおよびユニバーサルプライマーセットＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）およびＵＮＩＶ１４０６Ｒ（配列番号１１）を使用し、各プライマーセットおよびｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出サンプルに対して表５および表６と同様の反応液組成・反応条件にてリアルタイムＰＣＲを行い、外部標準物質の増幅曲線をもとに作成された検量線との比較によりｔｏｔａｌ ＤＮＡサンプル中の上記（１）〜（３）の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ濃度を測定した。
設計・開発した各プライマーセットおよびユニバーサルプライマーセットＵＮＩＶ５１９Ｆ（配列番号１０）およびＵＮＩＶ１４０６Ｒ（配列番号１１）を使用し、各プライマーセットおよびｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出サンプルに対して表５および表６と同様の反応液組成・反応条件にてリアルタイムＰＣＲを行い、外部標準物質の増幅曲線をもとに作成された検量線との比較によりｔｏｔａｌ ＤＮＡサンプル中の上記（１）〜（３）の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ濃度を測定した。
なお、測定されたサンプル中のＤＮＡ濃度の単位をコピー数［ｃｏｐｉｅｓ／Ｌ］として表すために、以下の式１を使用した。
反応器におけるテレフタル酸含有廃水の処理とモニタリング
１０Ｌの反応器でテレフタル酸含有合成廃水を対象に連続処理を行った。上記（１）、（２）および（３）の微生物に対するそれぞれの１６Ｓ ｒＤＮＡの定量は、実施例４に従って、運転が安定してきた約８５０日目から始め、約１，２５０日目まで約１年間にわたって実施した（表７参照）。
１０Ｌの反応器でテレフタル酸含有合成廃水を対象に連続処理を行った。上記（１）、（２）および（３）の微生物に対するそれぞれの１６Ｓ ｒＤＮＡの定量は、実施例４に従って、運転が安定してきた約８５０日目から始め、約１，２５０日目まで約１年間にわたって実施した（表７参照）。
図３に、１６Ｓ ｒＤＮＡ濃度の経時変化を示す。図中、ＯＬＲは有機物負荷率を示す。一時、１６Ｓ ｒＤＮＡ濃度の低下が観測されたが、その後基質負荷の増加に伴い微生物量も増加傾向であることが分かった。
図４に、流出テレフタル酸およびＣＯＤ濃度ならびにメタン生成速度の変化を示す。図３で１６ＳｒＤＮＡ濃度が一時低下している時期には、流出テレフタル酸およびＣＯＤ濃度も上昇し、メタン生成速度も低下していることが分かった。
以上から、今まで機能が知られていなかった上記（１）〜（３）の微生物が本発明において初めて特定され、これらの微生物が鍵となって、テレフタル酸含有廃水の嫌気性メタン発酵が行われていることが明らかとなった。
本発明は、テレフタル酸含有廃水の嫌気性メタン発酵システムの安定的・効率的運転に応用することができる。
Claims (6)
- テレフタル酸含有廃水処理において、
（１）配列番号１に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
（２）配列番号２に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、または
（３）配列番号３に示される１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列または該配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸を有する微生物、
を検出または定量するための、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含む、プライマーセット：
（ａ）上記（１）の微生物を検出または定量するための配列番号４に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号５に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）上記（２）の微生物を検出または定量するための配列番号６に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号７に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）上記（３）の微生物を検出または定量するための配列番号８に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示される塩基配列またはそれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - テレフタル酸含有廃水処理において、嫌気性メタン発酵微生物系における請求項１に記載の（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の微生物量をモニタリングする方法であって、上記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１組のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、上記微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することを含む、上記方法。
- 上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べることを含む、請求項２に記載の方法。
- 上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の微生物量を経時的にモニタリングすることを含む、請求項２または３に記載の方法。
- テレフタル酸含有廃水処理において、嫌気性メタン発酵微生物系におけるメタン発酵効率を評価する方法であって、請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１組のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ量を測定することにより、該微生物の嫌気性メタン発酵微生物系における優占状況を調べ、これによってメタン発酵効率を評価することを含む、上記方法。
- 上記（１）〜（３）の少なくとも１種類の微生物が嫌気性メタン発酵微生物系において７０％以上優占するとき、メタン発酵効率が良好であると評価する、請求項５に記載の方法。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012076023A (ja) * | 2010-10-01 | 2012-04-19 | Kurita Water Ind Ltd | テレフタル酸含有排水の嫌気性処理方法および処理装置 |
| JP2012249558A (ja) * | 2011-06-01 | 2012-12-20 | Tokyo Institute Of Technology | 微生物のｄｎａ情報に基づいたメタン発酵の運転管理 |
| CN105906046A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-08-31 | 燕京啤酒(桂林漓泉)股份有限公司 | 化学药剂投入生产使用对污水厌氧处理系统正常运行的影响强弱程度的判定方法 |
| WO2016159287A1 (ja) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | 住友化学株式会社 | 微生物製剤の製造方法及び微生物製剤 |
| WO2018061693A1 (ja) * | 2016-09-29 | 2018-04-05 | 富士フイルム株式会社 | マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法 |
| WO2022147868A1 (en) * | 2021-01-08 | 2022-07-14 | The University Of Hong Kong | Sewage surveillance for sars-cov-2 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003319798A (ja) * | 2002-05-01 | 2003-11-11 | Shinko Pantec Co Ltd | 標的物質分解菌の検索方法 |
| JP2006110424A (ja) * | 2004-10-13 | 2006-04-27 | Ebara Corp | 有機性廃水の処理方法及び処理装置 |
| JP2006296336A (ja) * | 2005-04-22 | 2006-11-02 | Jfe Engineering Kk | 汚泥分解菌用プライマーおよびプライマーを用いた検出方法 |
| JP2006325591A (ja) * | 2005-05-25 | 2006-12-07 | Hauni Maschinenbau Ag | たばこ加工産業のロッド形状の品物を調製及び／または製造するための装置 |
-
2007
- 2007-03-06 JP JP2007055971A patent/JP2008212083A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003319798A (ja) * | 2002-05-01 | 2003-11-11 | Shinko Pantec Co Ltd | 標的物質分解菌の検索方法 |
| JP2006110424A (ja) * | 2004-10-13 | 2006-04-27 | Ebara Corp | 有機性廃水の処理方法及び処理装置 |
| JP2006296336A (ja) * | 2005-04-22 | 2006-11-02 | Jfe Engineering Kk | 汚泥分解菌用プライマーおよびプライマーを用いた検出方法 |
| JP2006325591A (ja) * | 2005-05-25 | 2006-12-07 | Hauni Maschinenbau Ag | たばこ加工産業のロッド形状の品物を調製及び／または製造するための装置 |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012076023A (ja) * | 2010-10-01 | 2012-04-19 | Kurita Water Ind Ltd | テレフタル酸含有排水の嫌気性処理方法および処理装置 |
| JP2012249558A (ja) * | 2011-06-01 | 2012-12-20 | Tokyo Institute Of Technology | 微生物のｄｎａ情報に基づいたメタン発酵の運転管理 |
| WO2016159287A1 (ja) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | 住友化学株式会社 | 微生物製剤の製造方法及び微生物製剤 |
| JP2016195566A (ja) * | 2015-04-03 | 2016-11-24 | 住友化学株式会社 | 微生物製剤の製造方法及び微生物製剤 |
| US10526223B2 (en) | 2015-04-03 | 2020-01-07 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing microbiologic agent, and microbiologic agent |
| CN105906046A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-08-31 | 燕京啤酒(桂林漓泉)股份有限公司 | 化学药剂投入生产使用对污水厌氧处理系统正常运行的影响强弱程度的判定方法 |
| CN105906046B (zh) * | 2016-06-24 | 2018-08-17 | 燕京啤酒(桂林漓泉)股份有限公司 | 化学药剂投入生产使用对污水厌氧处理系统正常运行的影响强弱程度的判定方法 |
| WO2018061693A1 (ja) * | 2016-09-29 | 2018-04-05 | 富士フイルム株式会社 | マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法 |
| WO2022147868A1 (en) * | 2021-01-08 | 2022-07-14 | The University Of Hong Kong | Sewage surveillance for sars-cov-2 |
| CN114755376A (zh) * | 2021-01-08 | 2022-07-15 | 香港大学 | 关于sars-cov-2的污水监测 |
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