CN114755376A - 关于sars-cov-2的污水监测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及关于SARS‑COV‑2的污水监测。已建立了用于灵敏和准确地检测来自污水和废水的样品中的传染因子的系统。该系统可以快速和有效地检测并记录在来自特定位置的废水和污水内SARS‑CoV‑2和其它病毒的存在。该系统采用定量聚合酶链反应(RT‑qPCR)，以鉴定且定量核酸，其指示从污水流域获得的样品内的SARS‑CoV‑2和其它病毒。该系统可重复和准确地鉴定且定量病毒RNA，从而能够快速和早期监控区域中的市政供水系统，所述区域容纳或涉及由SARS‑CoV‑2和/或其它病毒感染的患者；并且提供数据库来监控在全社区级别下的污水流域内传染因子的存在情况。

Description

关于SARS-COV-2的污水监测
发明领域
本发明总体上涉及污水样品内的冠状病毒RNA的鉴定和定量，以及关于SARS-CoV-2的污水监测。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是高传播性和致病性冠状病毒，其引起人中的急性呼吸道疾病，称为冠状病毒病2019(COVID-19)。从2019年底发现到2020年初，SARS-CoV-2在世界范围内迅速传播，促使世界卫生组织(World Health Organization)(WHO)在2020年3月中旬宣布全球大流行(Hu，B.，Guo，H.，Zhou，P.等人Nat Rev Microbiol(2020). doi.org/10.1038/s41579-020-00459-7)。在报告SARS-CoV-2的首个病例后仅一年多一点，全世界已确诊了超过8560万例感染，并且SARS-CoV-2已与多于180万例死亡相关。到2021年1月初，仅美国就报告了多于2100万个COVID-19病例以及超过360,000例与SARS-CoV-2相关的死亡(WHO冠状病毒病(COVID-19)每周流行病学更新和每周动态更新(WHO Coronavirus disease(COVID-19)Weekly Epidemiological Update and WeeklyOperational Update)；网站who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/)。
SARS-CoV-2病毒在感染个体的大便中排出。即使感染的人没有任何症状，他们也可以在其粪便中排出病毒，并且排出可能在他们不再有传染性后持续数周。因此，需要灵敏的污水测试系统，其可以帮助追踪社区中的感染并提供针对社区中的感染增加的预警。除COVID-19传播的其它临床指标之外，SARS-CoV-2的污水监测也可以提供有价值信息，以告知且支持响应SARS-CoV-2传播的公共卫生行动。
因此，本发明的一个目的是提供用于快速和可重复地检测和定量污水样品中的SARS-CoV-2的组合物和方法。
另一个目的是提供用于尤其是在一个或多个居民被鉴定为感染有SARS-CoV-2病毒的社区中，在污水和废水系统内SARS-CoV-2的全社区监测的方法。
发明内容
已开发了用于快速和可重复地检测和定量污水样品中的SARS-CoV-2的组合物和方法。
提供了对污水流域(sewageshed)进行采样，用于有效检测和评价在由污水流域所服务的区域中的传染病因子存在情况的方法。该方法包括以下步骤：(i)在污水流域的第一指定污水系统位置处收集第一多个污水样品。通常，在第一收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集第一多个污水样品。该方法通常包括合并第一多个污水样品，以形成第一复合污水样品。
在一些形式中，由污水流域所服务的区域是单个建筑物、单个建筑综合体、单个校园、单个城市街区、单个邻里、单个社区、单个城市或单个行政区。通常，第一指定污水系统位置是建筑物排水管、建筑综合体排水管、街道下水道管、泵站或废水处理厂中的一个或多个。
在一些形式中，第一收集期与第一指定污水系统位置相距由第一指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。示例性的第一收集期是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时。收集第一多个污水样品的示例性时间间隔是5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或60分钟。在一些形式中，第一多个污水样品包含至少2个污水样品、3个污水样品、4个污水样品、5个污水样品、6个污水样品、7个污水样品、8个污水样品、9个污水样品、10个污水样品、11个污水样品、12个污水样品、14个污水样品、16个污水样品、18个污水样品、20个污水样品、22个污水样品、24个污水样品、25个污水样品、30个污水样品、35个污水样品、40个污水样品、45个污水样品、50个污水样品、55个污水样品、60个污水样品、65个污水样品、70个污水样品、75个污水样品、100个污水样品或125个污水样品。
该方法任选地包括以下步骤：(ii)在污水流域的第二指定污水系统位置处收集第二多个污水样品，其中在第二收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集第二多个污水样品。该方法通常包括合并第二多个污水样品，以形成第二复合污水样品。在一些形式中，第二指定污水系统位置不同于第一指定污水系统位置。在一些形式中，第二收集期与第二指定污水系统位置相距由第二指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
该方法任选地包括以下步骤：(iii)在污水流域的第三指定污水系统位置处收集第三多个污水样品，其中在第三收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集第三多个污水样品。该方法通常包括合并第三多个污水样品，以形成第三复合污水样品。在一些形式中，第三指定污水系统位置不同于第一指定污水系统位置和第二指定污水系统位置。在一些形式中，第三收集期与第三指定污水系统位置相距由第三指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
还提供了检测在由污水流域所服务的区域中传染病因子的存在情况的方法。该方法包括以下步骤：(a)将从由污水流域所服务的区域收集的污水样品浓缩，以提供浓缩的污水样品。通常，污水样品通过以下进行浓缩：(1)将污水样品离心；(2)收集所得的上清液；(3)将上清液超速离心；并且(4)将所得的沉淀重悬浮，从而产生浓缩的污水样品。
在一些形式中，该方法包括以下步骤：(b)从浓缩的污水样品中提取核酸；并且(c)在提取的核酸中检测指示传染病因子的一个或多个核酸序列，从而检测在由污水流域所服务的区域中传染病的存在情况。
在一些形式中，在步骤(2)之后且在步骤(3)之前，该方法包括将步骤(2)的上清液离心。在一些形式中，该方法包括通过以下从浓缩的污水样品中提取核酸：(1)将浓缩的污水样品裂解；(2)用酚提取裂解的浓缩的污水样品；(3)从酚提取的水相中沉淀核酸；并且(4)清洗旋转柱中的核酸。通常，通过所提取的核酸的定量聚合酶链反应(qPCR)来检测指示传染病的核酸序列。在一些形式中，通过所提取的核酸的逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来检测指示传染病的核酸序列。
在一些形式中，传染病因子是病毒，例如RNA病毒。
通过该方法检测的优选的RNA病毒是冠状病毒，例如SARS-CoV-2病毒。
在一些形式中，一个或多个方法步骤连同一个或多个对照样品一起执行。示例性的对照样品是基质对照，例如，掺有已知量的已知传染病因子的污水样品。在一些形式中，一个或多个方法步骤对试剂空白执行。示例性的试剂空白是无污水对照样品。
在一些形式中，污水样品是根据所述系统和方法形成的复合污水样品，所述系统和方法用于对污水流域进行采样，用于有效检测和评价传染病因子的存在情况。
在一些形式中，在分开的反应中，用针对传染病因子中的两个或更多个靶序列的引物执行qPCR。用于与所述方法一起使用的示例性qPCR运行45个循环。在一些形式中，小于45的循环阈值(Ct)指示对于该反应的引物组的阳性结果。在其它形式中，对引物组无一具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的存在呈阴性。在一些形式中，对仅一个引物组具有小于45的循环阈值(Ct)指示，污水样品中传染病因子的疑似存在。在其它形式中，对两个或更多个引物组具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的存在呈阳性。
根据所述方法检测的优选的传染病因子是SARS-CoV-2。在一些形式中，一个引物组针对SARS-CoV-2的N1基因，而另一个引物组针对SARA-CoV-2的E基因。
在一些形式中，该方法包括一个或多个任选步骤，包括对阳性对照执行qPCR，其中所述阳性对照具有包含SARS-CoV-2的N1基因的质粒，和/或对阴性对照执行qPCR，其中所述阴性对照没有模板，和/或对所扩增的核酸进行测序，以确认所扩增的核酸的身份。
附图说明
图1是调查污水样品中的SARS-CoV-2病毒的工作流。
图2是卡通图解(cartoon diagram)，其显示了用于定量污水样品中的SARS-CoV-2的工作流和实践。
图3A-3B是显示了对于分别使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)(图3A)和TRIzolTM Plus RNA纯化试剂盒(Thermofisher)(图3B)处理的样品，对于PBS和污水各自检测到的Ct值相对于预计TCID50/mL的图。
图4A-4B是条形图，其显示了对于分别使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)(图4A)和TRIzolTM Plus RNA纯化试剂盒(Thermofisher)(图4B)处理的样品，对于PBS和污水各自的Log (拷贝/ml样品)相对于预计TCID50/mL。
图5是显示了来自Lok Hop House污水和参考SARS-CoV-2(NCBI登录号MT929054.1)的Query RT-qPCR产物的单字母代码核酸序列比对的图解。
图6是在样品收集日期时，香港每日本地病例的图。
具体实施方式
I.定义
术语“SARS-CoV-2”和“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”指Sarbecovirus亚属的致病性冠状病毒株，其直接源于2019年底在亚洲出现的动物传染病起源的冠状病毒，并且是人中的大流行性冠状病毒病2019(COVID-19)的致病因子。
术语“N基因”指编码核衣壳蛋白的基因，其位于编码多蛋白的SARS-CoV-2冠状病毒RNA基因组的3'区域处。来自SARS-CoV-2冠状病毒的代表性N基因作为登录号：MN908947.3保藏在GenBank中，其具有SEQ ID NO：1的核酸序列。
术语“E基因”指编码SARS-CoV-2冠状病毒的包膜蛋白的基因。来自SARS-CoV-2冠状病毒的代表性E基因作为登录号：MN908947.3保藏在GenBank中，其具有SEQ ID NO：2的核酸序列。
如本文使用的，术语“核酸分子”广泛用于意指通过共价键连接的两个或更多个核苷酸的任何聚合物，所述共价键例如磷酸二酯键、硫酯键、或本领域已知对于连接核苷酸有用和有效的各种其它键中的任一种。此类核酸分子可以是线性的、环状的或超螺旋的，并且可以是单链或双链的，例如单链或双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。在一些形式中，核酸分子是或包括核酸类似物，其比DNA和/或RNA更不易被核酸酶降解。
如本文使用的，术语“靶向基因”或“靶核酸”或“靶序列”或“靶区段”指在待分析的样品中待检测和/或定量的目的核酸序列。靶核酸可以由基因组的区段、具有或不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分或者探针或引物被设计为与之杂交的核酸的序列构成。靶核酸可以包括野生型序列、突变、缺失、插入或重复、串联重复元件、目的基因、目的基因区域或者其任何上游或下游区域。靶核酸可以代表特定基因的备选序列或等位基因。靶核酸可以衍生自基因组DNA、cDNA或RNA。在优选的形式中，靶序列指冠状病毒内的基因或基因组组分，其被设计为在RT-qPCR过程中选择性地结合且扩增该基因的一种或多种引物所靶向。
如本文使用的，术语“引物”指这样的寡核苷酸，当置于其中诱导与靶核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时，即在适当的缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中以及在合适的温度下在不同的三磷酸核苷酸和聚合酶的存在下，所述寡核苷酸能够充当核酸序列合成的起始点。引物的一个或多个核苷酸可以例如通过添加甲基、生物素部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸进行修饰。引物序列无需反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可以附着至引物的5'端，而引物序列的剩余部分与链基本上互补。如本文使用的，术语引物包括可以合成的所有形式的引物，包括肽核酸引物、标记的引物等等。如本文使用的，术语“正向引物”意指向双链DNA(dsDNA)的反义链退火的引物。“反向引物”向dsDNA的有义链退火。引物的长度通常为至少10、15、18或30个核苷酸，或者长度为至多约100、110、125或200个核苷酸。在一些形式中，引物的长度优选为约15至约60个核苷酸，且长度最优选为约25至约40个核苷酸。在一些形式中，引物的长度为15至35个核苷酸。不存在关于最佳杂交或聚合酶链反应扩增的标准长度。关于特定引物应用的最佳长度可以容易地按H. Erlich，PCR Technology，Principles and Application for DNAAmplification,(1989)中所述的方式进行确定。
如本文使用的，术语“扩增”指增加核酸分子，例如基因或基因片段，例如SARS-CoV-2 RNA的至少一部分的拷贝数。扩增反应的产物称为扩增产物。体外扩增的实例是RT-PCR扩增。
如本文结合所公开的方法使用的术语“对于……足够的条件”指允许所需活性的任何环境，例如，允许两个核酸分子之间的特异性结合或杂交或者允许核酸的逆转录和/或扩增的任何环境。此类环境可以包括但不限于特定的温育条件(例如时间和/或温度)，或者特定因子(例如缓冲液、盐、金属离子、去污剂、核苷酸、酶等)例如在溶液中的存在和/或浓度。
如本文结合所公开的方法使用的术语“接触”指处于直接物理关联的放置；例如以固体和/或液体形式。例如，接触可以在体外与一种或多种引物和/或探针以及生物样品(例如包括核酸的样品)在溶液中发生。
如本文使用的，术语“样品”指在体外以及从污水流域或其它市政或环境水源获得的测试样品，例如水、冰、土壤、污泥或从以下获得的其它物质的样品：污水流域、流域、湖泊、海洋、河流、溪流、市政自来水、淡水处理场、垃圾填埋场、纯净饮用水或者商购可得的瓶装水或其它饮料、或特定的下水道系统例如个别建筑物、多重建筑物和大型住宅区的下水道系统以及常规污水处理设施(污水泵站和污水处理厂)的入口。
术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，并且指哺乳动物，包括但不限于鼠、猿猴、人、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。
在测定的上下文中，术语“检测”和“鉴定”可互换使用，并且指靶例如冠状病毒的遗传组分的阳性鉴定。鉴定或检测可以根据测定的机制进行解释或评价，并且鉴定或检测可以与对照或标准水平进行比较。例如，在RT-qPCR测定中，基因或所表达的基因产物的检测程度，可以定量为对照中的其预计或计算水平的全部(即，100%)或部分(即，1-99.9%)。定量可以作为%值进行测量，例如1%直到100%，例如5%、10%、25%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。例如，靶基因的相对量、或者一种或多种所表达的基因产物的活性或数量，可以相对于对照或相对于另一个实验样品进行评价。在一些形式中，检测或定量根据对应于对照细胞内的靶向遗传元件的RNA或蛋白质水平进行比较。
如本文使用的，术语“灵敏度”指测试正确地鉴定真阳性(即由SARS-CoV-2感染的污水样品)的能力。例如，灵敏度可以表示为百分比，即正确地鉴定为阳性的实际阳性的比例(例如，被测试正确地鉴定为具有SARS-CoV-2的具有SARS-CoV-2的测试样品的百分比)。具有高灵敏度的测试具有低的假阴性(即未鉴定为SARS-CoV-2的SARS-CoV-2的情况)的比率。一般地，所公开的测定和方法具有至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%的灵敏度。
如本文使用的，术语“特异性”指测试正确地鉴定真阴性(即没有SARS-CoV-2感染的污水样品)的能力。例如，特异性可以表示为百分比，即正确地鉴定为阴性的实际阴性的比例(例如，被测试正确地鉴定为没有SARS-CoV-2的没有SARS-CoV-2的测试样品的百分比)。具有高特异性的测试具有低的假阳性(即，污水样品不具有SARS-CoV-2，但被测试建议为具有SARS-CoV-2的情况)的比率。一般地，所公开的方法具有至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%的特异性。
如本文使用的，术语“准确度”指测试以高灵敏度和高特异性提供结果的能力，例如以超过约80%的灵敏度和超过约80%的特异性、以超过约85%的灵敏度和超过约85%的特异性、或以超过约90%的灵敏度和超过约90%的特异性。
除非本文另有说明，否则在本文中的值范围的叙述仅旨在充当个别地指落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入说明书内，如同它在本文中个别地叙述一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/- 10%的范围内高于或低于所陈述的值的值；在其它方面，值可以在大约+/- 5%的范围内高于或低于所陈述的值的值范围内；在其它方面，值可以在大约+/- 2%的范围内高于或低于所陈述的值的值范围内；在其它方面，值可以在大约+/- 1%的范围内高于或低于所陈述的值的值范围内。
II. 组合物
已建立了系统和组合物，其可以用于快速和可靠地鉴定污水或废水样品内SARS-CoV-2病毒的存在情况。该系统采用RT-qPCR，其引物被设计为识别与COVI-19大流行相关的SARS-CoV-2病毒中具有保守序列的两种不同基因。该系统包括用于向测试样品内的病毒RNA退火的一组或多组核酸引物探针。
提供了用于基于RT-qPCR的分子测定系统的组合物，用于检测污水样品内的SARS-CoV-2病毒。该方法和组合物对于快速和灵敏地检测和定量水样品例如污水样品内的SARS-CoV-2病毒特别有效。如果系统和组合物具有特定序列的N基因和/或E基因，则它们鉴定样品内的SARS-CoV-2病毒。基于RT-qPCR的系统采用由可检测探针标记的一对靶特异性引物，以监控混合物(包括实验样品)内的逆转录聚合酶链反应。RT-qPCR测定依赖于引物探针与样品内的模板RNA或DNA的高度序列特异性对齐，以实现实时的序列特异性检测和定量。
A. 病毒靶
该系统和组合物鉴定病毒，特别是SARS-CoV-2病毒，其是Sarbecovirus亚属的冠状病毒。
1. 冠状病毒
冠状病毒(网巢病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus))是大型有包膜的正链RNA病毒的多样化群体，其引起人及其它动物中的呼吸道和肠道疾病(Rota等人，Science，2003年5月，第1/10.1126/1085952页)。
冠状病毒通常具有狭窄的宿主，并且可以在许多动物中引起严重疾病，并且几种病毒(包括传染性支气管炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒和传播性胃肠炎病毒)，是重要的兽医学病原体。人冠状病毒(HCoV)在第1组(HCoV-229E)和第2组(HCoV-OC43)两者中均得到发现，并且在历史上负责~30%的轻度上呼吸道病。
以~30,000个核苷酸，它们的基因组是任何RNA病毒中发现的最大基因组。存在三组冠状病毒；第1组和第2组含有哺乳动物病毒，而第3组仅含有禽病毒。在每组内，通过宿主范围、抗原关系和基因组组构，将冠状病毒分类成不同的物种。基因组组构是冠状病毒典型的，具有特征性基因次序(5'-复制酶[rep]、刺突[S]、包膜[E]、膜[M]、核衣壳[N]-3')，以及在两个末端处的短的非翻译区。构成基因组的大约三分之二的SARS-CoV rep基因，编码两种多蛋白(由ORF1a和ORF1b编码)，所述多蛋白经历共翻译蛋白水解处理。在rep的下游存在四个开放读码框(ORF)，预测其编码所有已知冠状病毒共有的结构蛋白S、E、M和N。
a. SARS-CoV-2
该系统和组合物鉴定了Sarbecovirus亚属的SARS-CoV-2乙型冠状病毒。SARS-CoV-2病毒与2003年鉴定的SARS-CoV病毒共享大约79%的基因组序列同一性。SARS-CoV-2病毒的基因组组构与其它乙型冠状病毒共享；六个功能性开放读码框(ORF)从5’到3’按以下次序排列：复制酶(ORF1a/ORF1b)、刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)。另外，编码辅助蛋白的七个推定的ORF散布在结构基因之间。
关于SARS-CoV-2 N基因的示例性核酸序列在GenBank登录号MN908947.3(SEQ IDNO：1)中示出：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
关于SARS-CoV-2 E基因的示例性核酸序列在GenBank登录号MN908947.3(SEQ IDNO：2)中示出：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
B. 样品
所述系统和组合物检测和/或定量作为液体的污水或废水样品内存在的SARS-CoV-2病毒RNA。在一些形式中，输入样品从液体、凝胶、乳液或固体进行稀释、浓缩或以其它方式获得。
所述系统和组合物基于污水或废水样品内存在的SARS-CoV-2病毒的存在，产生“输出”样品，包括RT-qPCR的产物，其包括用探针标记的扩增产物。
1. 用于RT-qPCR的输入样品
所述系统包括输入样品，其含有从污水或废水样品中提取且纯化的核酸。在一些形式中，输入样品是从环境样品中提取且分离病毒RNA的过程的产物。在一些形式中，输入样品包括分离的和/或纯化的核酸，例如病毒RNA，其从污水或废水样品中分离。用作根据所述系统的输入样品的提取的和/或纯化的病毒RNA，可以通过本领域已知的用于RNA纯化的方法从污水或废水样品中获得。
在一些形式中，输入样品包括分离的和/或纯化的病毒核酸，例如RNA或DNA。RNA或DNA可以以完整的病毒基因组RNA或病毒基因组RNA的片段的形式存在于样品内。在一些形式中，样品包括分离的和/或纯化的核酸，例如RNA或DNA质粒。在一些形式中，输入样品呈无细胞、澄清的水溶液的形式。
通常，用于所述测定中的输入样品为约0.1 μL至约1000 μL(包括端点在内)的体积，优选为约3-5 μL的体积，最优选为约4 μL的体积。
2. 输入样品的起源
用于所述测定中的输入样品可以源于任何水源，并且可以是任何形式，包括液体、冷冻液体或粉末，例如冷冻干燥或冻干的样品。优选地，输入样品来自污水流域或者其它市政或环境水源，例如水、冰、土壤、污泥或从以下获得的其它物质的样品：污水流域、流域、湖泊、海洋、河流、溪流、市政自来水、淡水处理场、垃圾填埋场、纯净饮用水或者商购可得的瓶装水或其它饮料、或特定的下水道系统例如个别建筑物、多重建筑物和大型住宅区的下水道系统以及常规污水处理设施(污水泵站和污水处理厂)的入口。通常，在检测传染因子之前收集并处理样品。
样品可以根据收集的位置和时机进行标识，例如，作为第一、第二、第三、第四或进一步的指定污水系统位置。示例性位置包括建筑物排水管、建筑综合体排水管、街道下水道管、泵站或废水处理厂中的一个或多个。在一些形式中，污水样品包含在容器内，或者连同用于获得样品的一个或多个装置一起包含。
3. 对照样品
在一些形式中，该测定包括一个或多个对照样品，其充当样品内的SARS-CoV-2病毒的特异性、检测和定量的对照。通常，阴性对照样品包括衍生自病毒的纯化RNA或DNA，所述病毒与SARS-CoV-2病毒共享很少的遗传相关性或不共享遗传相关性。示例性的阴性对照病毒包括从以下中提取的RNA：人冠状病毒229E、OC43、HKU1、NL63和OC43、MERS，骆驼冠状病毒HKU23，人甲型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1和H7N9亚型)，禽流感(H1、H4、H6和H9亚型)，人乙型流感病毒(Yamagata和Victoria谱系)，以及腺病毒、肠病毒、人副流感病毒(PIV1、2、3和4)、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒(metapneumovirus)、鼻病毒和人博卡病毒。在一些形式中，阴性对照可以包括从回顾性人呼吸道样本中提取的RNA，所述回顾性人呼吸道样本先前对于这些病毒中的任一种测试呈阳性。在一些形式中，阴性对照是重组产生的核酸载体，其缺少对于待使用的设计引物和探针组的活性所需的一个或多个核酸序列。
在一些形式中，确认用于检测和定量SARS-CoV-2病毒的测定的特异性和功效的阳性对照，包括克隆到质粒内的通过E和N基因测定生成的SARS冠状病毒的RT-qPCR产物以及从SARS-CoV-2感染细胞中提取的病毒RNA。
在一些形式中，将RNA或DNA对照样品连续稀释，以评估测定的性能。
4. 稀释剂、填料和防腐剂
在一些形式中，输入样品包括稀释剂、填料、赋形剂或防腐剂。在一些形式中，样品包括一种或多种试剂，其用于保存或维持污水或废水样品内的SARS-CoV-2病毒数量，以产生代表性的输入样品。因此，在一些形式中，输入样品包括阻止或降低RNA酶酶活性的一种或多种试剂。
C. 设计的核酸寡核苷酸引物和探针
所述系统包括匹配的5'(“正向”)和3'(“反向”)核酸寡核苷酸引物组，其被配置为选择性地扩增传染因子基因组的特定片段(“扩增子”)；以及靶特异性核酸寡核苷酸探针，其被配置为选择性地检测/标记所得到的扩增子。优选的传染因子是SARS-CoV-2病毒。
为了检测衍生自污水流域或废水样品的用于RT-qPCR的输入样品内SARS-CoV-2病毒的存在情况，每个匹配的引物组包括5'(“正向”)和3'(“反向”)引物，其设计为靶向且扩增SARS-CoV-2病毒基因组的一种或多种组分的预定片段。在一些形式中，设计了匹配的引物组，以扩增SARS-CoV-2病毒的单个靶基因的特定片段。可以靶向的示例性基因包括病毒复制酶(ORF1a/ORF1b)基因、病毒刺突(S)基因、病毒包膜(E)基因、病毒膜(M)基因和病毒核衣壳(N)基因。在其它形式中，设计了匹配的引物组，以扩增编码非结构基因的病毒基因组区域的特定片段、或跨越两个病毒基因的病毒基因组片段。通常，基于当前正在传播的病毒株的基因组的核酸序列，例如Genbank登录号：MN908947，设计匹配的引物组。在一些形式中，用于检测SARS-CoV-2病毒的引物包括设计为扩增SARS-CoV-2病毒N基因的区域的引物。在一些形式中，用于检测SARS-CoV-2病毒的引物包括设计为扩增SARS-CoV-2病毒E基因的区域的引物。示例性的靶基因包括SARS-CoV-2病毒(Genbank登录号：MN908947)的N基因(SEQ ID NO：1)和E基因(SEQ ID NO：2)的核酸序列。
还描述了核酸寡核苷酸探针，其序列与分别通过寡核苷酸引物扩增的SARS-CoV-2病毒E和N基因的片段选择性地结合。通常，每种引物以约0.1 µmol/L至约1.0 µmol/L，优选约0.1 µmol/L的浓度存在于RT-qPCR反应内。通常，每种探针以约0.05 µmol/L至约1.0 µmol/L，优选约0.25 µmol/L的浓度存在于RT-qPCR反应内。
D. 用于RT-qPCR的组合物
在一些形式中，RT-qPCR涵盖通常包含两种酶的两步法；第一步使用RNA依赖性DNA聚合酶，也称为逆转录酶，以将RNA复制成DNA(cDNA)，第二步然后切换为DNA聚合酶如Taq聚合酶的使用，所述酶如在标准PCR测试中扩增cDNA。
在优选形式中，使用基于荧光的定量RT-PCR，在单个试管中进行逆转录(RT)和PCR反应。
所述测定需要用于进行RT-qPCR程序的试剂和仪器。通常，测试试剂包括缓冲液、RNA依赖性DNA聚合酶、Taq聚合酶、靶特异性DNA引物和靶特异性DNA探针，所述探针在一端处用荧光标记进行标记，且在另一端处用猝灭剂进行标记。在一些形式中，靶特异性DNA探针进一步包含内部猝灭剂。靶特异性DNA探针上的示例性荧光标记包括FAM染料，并且靶特异性DNA探针上的示例性猝灭剂包括内部ZEN® Quencher，Iowa Black FQ猝灭剂(IBFQ)。在进一步优选的形式中，探针是双重猝灭的探针，例如5’FAM/ZEN/3’IBFQ。
在一些形式中，通常的反应体积为约0.1μL至约1,000 μL，优选约20 μL。示例性的单重RT-PCR反应混合物包括5 µL的4X主反应混合物(可从多个商业源获得，例如来自ThermoFisher的TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix)，0.5 µmol/L正向引物，0.5 µmol/L反向引物，0.25 µmol/L探针和4 µl输入样品。
通常，该测定在热循环仪或适合于执行和监控对于执行RT-qPCR程序所必需的步骤的其它仪器内进行。用于进行RT-qPCR程序的合适仪器是本领域众所周知的，并且可从多个商业源获得，包括来自ThermoFisher的ViiA7 Real-Time PCR系统。
III. 用于检测和定量污水中的传染因子的方法
已开发了使用RT-qPCR系统检测和定量污水样品中的传染因子的方法。
早期检测对于有效控制和监控传染因子如SARS-CoV-2病毒在污水和废水系统内的传播是至关重要的。因此，提供了用于SARS-CoV-2病毒RNA的分子检测的方法。检测时间范围为几分钟到几小时。该方法可以检测从各种废水场所获得的污水样品中的SARS-CoV-2，所述废水场所包括个别建筑物和大型住宅区的社区下水道系统，以及常规污水处理设施(污水泵站和污水处理厂)的入口。通常，该方法包括用于样品收集、样品制备和传染因子检测的步骤。在一些形式中，该方法包括用于记录和评价在污水流域或废水系统内的传染因子程度和传播的步骤。从该方法获得的数据可以为重要的公共卫生决策提供信息，并且有助于流行病学研究。
A. 样品收集
该方法包括用于从污水流域收集一个或多个样品的一个或多个步骤。对污水流域进行采样，用于有效检测和评价在由污水流域所服务的区域中的传染病因子存在情况的方法包括以下步骤：
(i)在污水流域的第一指定污水系统位置处收集第一多个污水样品。通常，在第一收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集第一多个污水样品。该方法通常包括合并第一多个污水样品，以形成第一复合污水样品。
在一些形式中，由污水流域所服务的区域是单个建筑物、单个建筑综合体、单个校园、单个城市街区、单个邻里、单个社区、单个城市或单个行政区。通常，第一指定污水系统位置是建筑物排水管、建筑综合体排水管、街道下水道管、泵站或废水处理厂中的一个或多个。
在一些形式中，第一收集期与第一指定污水系统位置相距由第一指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。示例性的第一收集期是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时。收集第一多个污水样品的示例性时间间隔是5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或60分钟。在一些形式中，第一多个污水样品包含至少2个污水样品、3个污水样品、4个污水样品、5个污水样品、6个污水样品、7个污水样品、8个污水样品、9个污水样品、10个污水样品、11个污水样品、12个污水样品、14个污水样品、16个污水样品、18个污水样品、20个污水样品、22个污水样品、24个污水样品、25个污水样品、30个污水样品、35个污水样品、40个污水样品、45个污水样品、50个污水样品、55个污水样品、60个污水样品、65个污水样品、70个污水样品、75个污水样品、100个污水样品或125个污水样品。
该方法任选地包括以下步骤：
(ii)在污水流域的第二指定污水系统位置处收集第二多个污水样品，其中在第二收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集第二多个污水样品。该方法通常包括合并第二多个污水样品，以形成第二复合污水样品。在一些形式中，第二指定污水系统位置不同于第一指定污水系统位置。在一些形式中，第二收集期与第二指定污水系统位置相距由第二指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
该方法任选地包括以下步骤：
(iii)在污水流域的第三指定污水系统位置处收集第三多个污水样品，其中在第三收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集第三多个污水样品。该方法通常包括合并第三多个污水样品，以形成第三复合污水样品。在一些形式中，第三指定污水系统位置不同于第一指定污水系统位置和第二指定污水系统位置。在一些形式中，第三收集期与第三指定污水系统位置相距由第三指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
该方法任选地包括在污水流域的第四或进一步指定污水系统位置处，收集第四或进一步多个污水样品的第四或进一步步骤。该方法通常包括合并第四或进一步多个污水样品，以形成第四或进一步复合污水样品。在一些形式中，第四或进一步指定污水系统位置不同于其它指定污水系统位置。在一些形式中，第四或进一步收集期与第四或进一步指定污水系统位置相距由第四或进一步指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
示例性的收集程序如下进行：通过香港的DSD获取复合样品(15分钟间隔，对于检查井在早高峰时间为3小时，对于泵站为12小时，且对于WWTP的进水为24小时)，并且装在二级容器中的1L塑料瓶中递送到实验室。在样品递送过程中，样品由二级容器中的冰保持冷却，以使RNA的降解降到最低。样品贮存于4℃冰箱中，并且在24小时内处理。
在一些形式中，样品样本在收集样品之后，在后续处理之前被灭活，例如，样品中的病毒通过在60℃下巴氏灭菌30分钟被灭活。
B. 样品制备
该方法包括纯化和浓缩样品内存在的传染因子的步骤，以增强检测的检测和定量的功效和准确度。因此，该方法包括在通过RT-qPCR的分子探测之前，用于准备每个样品或复合样品的一个或多个步骤。
在一些形式中，该方法采用纯化过程用于处理污水或废水的样品或复合样品。该过程包括：
(i)从样品的液体组分中去除大颗粒物质，以提供初级上清液；
(ii)将初级上清液超速离心，以去除残留的不溶性材料，并且提供次级上清液；和
(iii)从次级上清液中提取RNA，以提供适合于RT-qPCR的纯化RNA的输入样品。
在一些形式中，该方法包括以下步骤：
(a)将从由污水流域所服务的区域收集的污水样品浓缩，以提供浓缩的污水样品。通常，污水样品通过以下进行浓缩：
(1)将污水样品离心；
(2)收集所得的上清液；
(3)将上清液超速离心；和
(4)将所得的沉淀重悬浮，从而产生浓缩的污水样品。
在一些形式中，该方法包括以下步骤：(b)从浓缩的污水样品中提取核酸，然后在提取的核酸中检测指示传染病因子的一个或多个核酸序列，从而检测在由污水流域所服务的区域中传染病的存在情况。
在一些形式中，在步骤(2)之后且在步骤(3)之前，该方法包括将步骤(2)的上清液离心。在一些形式中，该方法包括通过以下从浓缩的污水样品中提取核酸：
(1)将浓缩的污水样品裂解；
(2)用酚提取裂解的浓缩的污水样品；
(3)从酚提取的水相中沉淀核酸；和
(4)清洗旋转柱中的核酸。
通常，通过所提取的核酸的定量聚合酶链反应(qPCR)来检测指示传染病的核酸序列。在一些形式中，通过所提取的核酸的逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来检测指示传染病的核酸序列。
C. 污水内的传染因子检测
提供了检测在由污水流域所服务的区域中传染病因子的存在情况的方法。通过该方法检测的优选的RNA病毒是冠状病毒，例如SARS-CoV-2病毒。通常，检测包括逆转录酶定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的一个或多个步骤。
在一些形式中，在分开的反应中，用针对传染病因子中的两个或更多个靶序列的引物执行RT-qPCR。用于与所述方法一起使用的示例性qPCR运行45个循环。在一些形式中，小于45的循环阈值(Ct)指示对于该反应的引物组的阳性结果。在其它形式中，对引物组无一具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的存在呈阴性。在一些形式中，对仅一个引物组具有小于45的循环阈值(Ct)指示，污水样品中传染病因子的疑似存在。在其它形式中，对两个或更多个引物组具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的存在呈阳性。
在一些形式中，一个引物组被配置为与SARS-CoV-2病毒的N1基因选择性地结合，而另一个引物组被配置为与SARS-CoV-2的E基因选择性地结合。
在一些形式中，该方法包括一个或多个任选步骤，包括对阳性对照执行RT-qPCR，其中所述阳性对照具有包含SARS-CoV-2的N1基因的质粒，和/或对阴性对照执行RT-qPCR，其中所述阴性对照没有模板，和/或对所扩增的核酸进行测序，以确认所扩增的核酸的身份。
1. 定量PCR
用于检测样品内SARS-CoV-2的存在的方法通常包括使从浓缩的污水样品中提取的RNA与组合物接触的步骤，所述组合物包含：
(i)配置为扩增SARS-CoV-2病毒的一个或多个片段的引物组；
(ii)配置为与扩增的核酸片段结合的探针；和
(iii)RT-qPCR反应混合物，其包括对于扩增SARS-CoV-2病毒的一个或多个片段所必需的试剂。
该方法在对于RT-qPCR反应扩增SARS-CoV-2病毒的一个或多个片段以产生输出样品足够的条件下温育组合物。
该方法检测在输出样品内的SARS-CoV-2病毒和探针的一个或多个片段，
其中在输出样品内的SARS-CoV-2病毒和探针的一个或多个片段的存在，将输入样品鉴定为含有SARS-CoV-2。
通常，步骤中的接触在热循环仪或适合于执行和监控对于执行RT-qPCR程序所必需的步骤的其它仪器内发生。
在一些形式中，检测步骤包括用于定量和/或记录样品内的病毒靶RNA的拷贝数的步骤。
在一些形式中，该方法包括在步骤中记录在输入样品内检测到的病毒靶RNA的拷贝数。在一些形式中，记录包括将与输入样品或输入样品衍生自其的环境有关的一个或多个另外的数据片组合在一起。例如，在一些形式中，记录包括注释关于样品的测定结果，连同一个或多个时间点，例如收集时间或间隔时间。在一些形式中，记录将来自两个或更多个测定的数据组合，以形成一个或多个数据库。例如，在一些形式中，记录注释了两个或更多个样品各自内的病毒靶RNA的拷贝数，连同一个或多个时间点。
在一些形式中，该方法检测样品内的SARS-CoV-2病毒量，所述样品衍生自与收容COVID-19患者的医院隔离单元相关的污水场所，由此在从污水场所的初始样品收集之后的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天或周或月内获得样品。
在一些形式中，该方法包括确定被鉴定为含有SARS-CoV-2的样品内，SARS-CoV-2病毒的一种或多种基因的序列的一个或多个另外步骤。在一些形式中，该方法包括一个或多个步骤，其用于在一个或多个数据库内记录来自一种或多种SARS-CoV-2病毒的一种或多种基因的序列数据，任选地连同与相同或不同样品有关的一个或多个数据片一起。
在一些形式中，该方法包括筛选一个或多个阳性对照和/或阴性对照。示例性的阳性对照包括编码一种或多种靶病毒RNA的一个或多个RNA序列。示例性的阳性对照RNA序列包括质粒，或作为表达SARS-CoV-2病毒的细胞，或含有靶序列的DNA质粒。示例性的阴性对照包括对一种或多种不同的人呼吸道病原体特异性的一个或多个RNA序列。
在一些形式中，一个或多个方法步骤连同一个或多个对照样品一起执行。示例性的对照样品是基质对照，例如，掺有已知量的已知传染病因子的污水样品。在一些形式中，一个或多个方法步骤对试剂空白执行。示例性的试剂空白是无污水对照样品。
D. 作为污水监测工具的用途
已开发了用于调查从具有各种场所特征的采样场所收集的污水中的SARS-CoV-2病毒的测试方法。所述方法可用于监测污水流域和废水系统内的传染因子。示例性场所包括个别建筑物和大型住宅区的社区下水道系统，以及服务多达一百万居民的常规污水处理设施(污水泵站和污水处理厂)的入口。
在一些形式中，污水样品是根据所述系统和方法形成的复合污水样品，所述系统和方法用于对污水流域进行采样，用于有效检测和评价传染病因子的存在情况。在一些形式中，该方法包括用于记录和评价在污水流域或废水系统内的传染因子程度和传播的步骤。从该方法获得的数据可以为重要的公共卫生决策提供信息，并且有助于流行病学研究。
如实施例中所述，在香港的第三波和第四波COVID-19暴发期间收集，并且分析检测到的病毒水平与生活在污水流域中的感染个体数目之间的相关性的数据，提供了对于公共卫生行动生成可执行信息的分类方案。因此，在一些形式中，该方法提供了污水监测数据，以对于地方议会或政府生成可执行的信息。在优选的形式中，基于使用所述测试方法获得的污水监测与分类方案组合，发布强制测试的法律执行，用于成功地控制SARS-CoV-2病毒的传播。
IV. 试剂盒
还公开了试剂盒。试剂盒可以包括例如用于采集污水或废水样品和/或用于从样品中提取和纯化病毒RNA的装置。在一些形式中，试剂盒包括用于从污水流域获得样品的器械，例如收集小瓶、弯管、注射器和/或移液管。在一些形式中，试剂盒包括：寡核苷酸引物组，其被配置为扩增SARS-CoV-2病毒RNA的片段；核酸探针，其被配置为选择性结合并检测通过引物扩增的SARS-CoV-2病毒RNA的片段；以及RT-qPCR反应混合物，其包括以适合于执行RT-qPCR的量和浓度的试剂和酶。在一些形式中，试剂盒包括关于根据上述方法使用试剂的印刷的说明书。在一些形式中，试剂盒包括分开包装或一起包装在相同掺和物中的两种或更多种组分。每种试剂可以单独(例如冻干)或在混合物组合物中供应。在一些形式中，试剂盒包括对于多重RT-qPCR反应所需的缓冲液和试剂的供应。在一些形式中，试剂盒包括用于SARS-CoV-2病毒RNA的RT-qPCR扩增的一个或多个阳性对照和/或阴性对照。
本发明通过参考下述非限制性实施例得到进一步理解。
实施例
实施例1：污水测试方法评估
自从报告了大便中的SARS-CoV-2(COIVD-19的致病病毒)排出以来，大量研究已检测到跨越各个地区和国家的污水中的SARS-CoV-2遗传信号。污水中SARS-CoV-2遗传材料的存在据报告是普遍存在的。粪便中的病毒排出可以在有症状、无症状或症状前携带者中发生1，这对于使用SARS-CoV-2的污水监测作为COIVD-19再次出现的预警提供了可能性。在症状发作之前COVID-19的传染性据估计占传播的44%左右，而在社区中鉴定轻度(mid)和无症状病例的预警信号很可能是有效策略的关键前提条件，所述有效策略可以帮助预防这种症状前传播。
几项研究已显示了污水中的SARS-CoV-2信号强度与相应下水道流域(sewershed)中的COVID-19发生率之间的高质量的相关性，提示了污水测试用于评价社区中的COVID-19流行率或发展趋势的潜力。对于估计社区流行率的使用情况，多个来源的不确定性对于评估和计算建模仍然是挑战性的，例如大便中的病毒载量(在香港的确诊COIVD-19病例中102.7至10 7.6个拷贝/mL)、下水道系统中的病毒降解和分布以及污水中的基质组分对方法灵敏度的干扰。按照现在的情况，污水测试数据的收集和解释是新兴的领域。应该解决提供信息的污水监测的挑战，如使用概念验证场所的方法验证和阳性结果的解释连同样品场所特征，以使其成为临床监测的稳健补充方法。
SARS-CoV-2的早期检测和监测是用于有效控制COVID-19的关键前提条件。污水测试已越来越多地用作备选监测工具。样品场所特征可以影响测试结果，并且在使用的早期阶段需要进一步研究。当前的研究旨在比较跨越具有不同污水系统特征的采样场所对于SARS-CoV-2的污水测试的实施。
用于定量污水中的SARS-CoV-2的独特测试方法，使用热灭活的SARS-CoV-2病毒以及从治疗COVID-19患者的当地医院收集的样品。收集了107个污水样品用于测试，所述污水样品覆盖香港的第三波COVID-19感染(从2020年6月8日到9月29日)。调查场所包括与概念验证医院相关的污水系统、服务数千居民的公共屋的社区下水道系统以及具有泵站和下游处理厂的常规污水处理系统。这项研究中阐述的分类方案是全新的，在世界上其它任何地方都没有用过。
典型的测试方法包括三个步骤：1)污水浓缩，2)病毒RNA提取，以及3)经由RT-qPCR(逆转录定量聚合酶链反应)的病毒检测。基于用于SARS-CoV-2的污水监测的一般原理，通过个别地优化用于COVID-19的污水监测的测试方法的三个步骤，已建立了当前研究中的测试方法。
图1中概述了用于测试污水中的SARS-CoV-2的程序。用于测试污水样品中的SARS-CoV-2的方法包括下述主要实验步骤：灭活、样品浓缩、病毒遗传材料提取和定量(图1)。超速离心用于浓缩来自污水样品的SARS-CoV-2。与其中污水样品经受直接超速离心的报告实践不同，当前研究中使用了两步分离方法。第一步是首先从污水中分离上清液和沉淀，而第二步使用上清液用于经由超速离心来浓缩病毒。这种两步分离方法通过使由污水中的复杂基质施加的影响降到最低来改善SARS-CoV-2的回收。该方法已通过掺加实验得到验证。
已显示用于解释测试结果的使用靶向SARS-CoV-2的N和E区域的两个引物和探针组的定量结果的组合具有高灵敏度和特异性。根据两种引物的RT-qPCR结果，提供了关于“阴性”、“疑似”和“阳性”的新分类标准。
整个测试方法足够简单，以在任何实验室中使用，条件是必要的设备如超速离心机和RT-qPCR机是可获得的。此类简单方案使得能够以快速方式递送测试结果。
材料和方法
预处理
将1000 mL灭活样品在Allegra X-15R离心机(Beckman Coulter；Indianapolis，IN)上以4750 g进一步离心30分钟，以分成两个子样品，即沉淀和上清液。在我们的方案中使用两种浓缩方法来浓缩不同体积的上清液，即30 mL(小体积，方法1)和1000 mL(大体积，方法2)。
对于方法1，将30 mL上清液在离心机型号Allegra X-15R(Beckman Coulter)上以150000 g超速离心1小时。小心地去除上清液，而不干扰沉淀。将沉淀用100 µL PBS进一步重悬浮，并且转运到新的1.5 mL微量离心管内用于RNA提取。
对于方法2，将1000 mL上清液通过在Sorvall LYNX 4000高速离心机(ThermoScientific)上以20000 g离心30分钟，并且在离心机型号Allegra X-15R(BeckmanCoulter)上以150000 g进一步超速离心1小时进行浓缩。用移液管从经由300 µL PBS进行的沉淀重悬浮液中收集浓缩的样品(~400 µL)，并且直接用于RNA提取。
基于我们当前方法对污水样品的评估，方法1的阳性率和病毒浓度均高于方法2。换言之，对于污水样品和掺加样品，方法1比方法2更灵敏和可行。
RNA提取
来自浓缩样品的RNA使用TRIzol™ Plus RNA纯化试剂盒(Thermofisher)进行提取，并且用于SARS-CoV-2检测。试剂空白(提取试剂盒中的200 µL不含RNA酶的水)用作RNA提取和定量步骤的阴性对照。该方案的细节显示于下文(从Thermofisher网页thermofisher.com/order/catalog/product/12183555#/12183555的原始方案稍作修改)
1. 将浓缩的样品(~400 µL)分成两个子样品。将1 mL TRIzol™试剂加入两个子样品内。
2. 将裂解产物上下吸取几次，以匀化。
3. 温育5分钟，以允许核蛋白复合物的完全解离。
4. 加入0.2 mL氯仿或50 μL 4-溴苯甲醚/1 mL用于裂解的TRIzol™试剂，然后将管牢固地盖好。
5. 温育2–3分钟。
6. 将样品在4℃下以12,000 × g离心15分钟。混合物分离成下层红色酚-氯仿和中间相，以及无色的上层水相。
7. 将~800 μL含有RNA的无色上层水相转移到新管。
8. 加入等体积的70%乙醇，然后通过涡旋充分混合。
9. 倒转试管，以分散在加入乙醇后可能形成的任何可见沉淀物。
10. 将最多700 μL的两个子样品转移到相同的旋转筒(具有收集管)
11. 以12,000 × g离心1分钟。
12. 弃去流过物，然后将旋转筒重新插入相同收集管内。
13. 重复步骤11和12，直到两个子样品全部已进行处理。
14. 将700 μL洗涤缓冲液I加入旋转筒中。
15. 以12,000 × g离心1分钟。
16. 弃去流过物，然后将旋转筒重新插入相同收集管内。
17. 将500 μL洗涤缓冲液II加入旋转筒中。
18. 以12,000 × g离心1分钟。
19. 弃去流过物，然后将旋转筒重新插入相同收集管内。
20. 将步骤18和19重复一次。
21. 以12,000 × g离心1分钟，以使膜干燥。
22. 弃去收集管，然后将旋转筒插入回收管内。
23. 将40 μL不含RNA酶的水加入旋转筒的中心。
24.温育1分钟。
25. 以>12,000 × g离心2分钟。
26. 弃去旋转筒。
27. 回收管含有纯化的总RNA。
28. 如果在数小时内使用，则将纯化的RNA贮存于冰上。对于长期贮存，将纯化的RNA贮存于-80℃下。
病毒试剂盒(QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen))也可以用于小体积样品，但性能不如TRIzol良好。
SARS-CoV-2的分析
使用TagMan Fast Virus 1-step Master Mix(Thermo Fisher，USA)，将1步RT-qPCR以20 μl反应混合物进行45个循环。我们使用N1和E基因的探针和引物用于检测SARS-CoV-2。如下制备一步RT-qPCR反应溶液：4×TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Thermo Fisher)5 μl，正向引物500 nm，反向引物500 nm，探针250 nm，RNA模板4 μl，以及DEPC处理的水至20 μl。
用于RT-qPCR的条件如下：50℃ 5分钟，95℃ 20秒，95℃ 5秒和55℃ 30秒的45个循环。如果废水样品的Ct值≤ 45，则该样品被视为具有SARS-CoV-2 RNA信号。
为了定量病毒的拷贝数，通过使用携带靶基因的质粒的系列稀释来生成靶区域的标准曲线，所述质粒浓度范围为10至107个拷贝/反应。
关于对照质粒的定量极限是10个拷贝/反应。对于质量保证和质量控制(QA/QC)，我们使用RNA提取试剂盒中的试剂作为用于RNA提取和定量步骤的阴性对照(称为“试剂空白”)。包括无模板对照(NTC)作为用于RT-qPCR的阴性对照。
检测
1)“阴性”：对于任何引物组没有Ct ≤ 45。
2)“疑似”：仅一种引物具有Ct ≤ 45。
3)“阳性”：至少两个引物组的Ct ≤ 45。
关于那些Ct ≤ 45的定量(浓度计算)
1)基于不同引物组的标准曲线进行计算。
2)如果计算的拷贝数/反应低于理论极限(1个拷贝/反应)，则报告为“< 10个拷贝/L污水”，其为当前方法的定量极限。
如果存在多于一个引物组的定量结果，则报告最高浓度。
结果
质量保证和质量控制(QA/QC)
该方法涉及用于SARS-CoV-2的两步浓缩程序，随后为RNA提取，以及经由N基因特异性RT-qPCR的SARS-CoV-2遗传信号定量(图2)。为了确保结果的可靠性，如图2中所示实施质量保证和质量控制(QA/QC)检查表。比较并评估了不同的浓缩方案。检测和定量测定然后对于污水基质进行验证。质量指标包括在个别步骤下：RNA提取试剂盒中的试剂用作用于RNA提取和定量步骤的阴性对照(称为“试剂空白”)。无模板对照(NTC)和携带N2的质粒分别用作用于RT-qPCR的阴性对照和阳性对照。样品元数据连同实验方法和结果一起作为QA/QC的部分进行了彻底探索(数据未显示)。
浓缩方法
首先使用从治疗COVID-19患者的医院收集的相同污水样品，评价用于浓缩SARS-CoV-2遗传信号的方法。评估了通常施加的方法，包括0.45 µm膜过滤、PEG沉淀、AlCl3沉淀、超速离心和超滤。通过比较浓缩方法的类型和处理的污水体积，观察到当与施加于最多1 L的大样品体积的膜过滤或沉淀相比时，施加于小样品体积(90 mL)的离心超滤对于病毒浓缩具有可比较的性能。但是关于测试方法的灵敏度，较大的样品体积允许样品的浓缩系数升高，预计其降低定量测定的检测极限。数据符合该假设。如表1中所示，对于使用90 mL的小样品体积的测定编号3和使用840 mL的大样品体积的测定编号6，尽管污水中病毒的可比较的最终浓度，但前者的拷贝数/RT-qPCR反应差不多是后者的十分之一。该结果提示了，大样品体积可以通过增强灵敏度来增加污水中的病毒检测。然而，由于使用大体积的方法可以使得样品难以在实验室处理，因此在本研究中使用了用于小样品体积的方法，其在最终测试结果中具有可比较的性能。
污水基质中的病毒遗传信号的RT-qPCR测定
已报告N基因特异性RT-qPCR中的引物-探针组具有高效率和分析灵敏度(Pan，Y.等人，The Lancet Infectious Diseases 2020，20,(4)，411-412；Chu，DK等人，Clinicalchemistry 2020，66,(4)，549-555；Vogels，CB等人，Nature microbiology 2020，5,(10)，1299-1305)，使得能够检测范围为10至107个拷贝/反应的SARS-CoV-2病毒RNA。由于污水基质与临床样本非常不同，因此进行了研究，以检查遗传信号的遗传提取和定量可以受污水基质的复杂性影响到哪种程度。通过将热灭活的SARS-CoV-2掺加到小体积的污水样品和对照样品(磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)内，通过比较病毒RNA提取物的浓度来评价污水基质的影响，所述病毒RNA提取物通过两种常用的RNA提取试剂盒(QIAamp病毒RNA微型试剂盒和TRIzolTM Plus RNA纯化试剂盒)获得。污水的基质影响就检测到的Ct值而言是可忽略不计的(图3A-3B)，这指示了所施加的定量方法对于污水样品具有相当大的实用性。关于以病毒拷贝数/mL样品定量的病毒浓度，污水基质并不产生超过0.6个对数单位/mL的差异(图4A-4B)。对于通过QIAamp病毒RNA微型试剂盒和TRIzolTM Plus RNA纯化试剂盒获得的RNA提取物，污水的基质影响范围分别为0.1-0.6和0.1-0.2个对数病毒拷贝数/mL样品。
治疗COVID-19患者的医院的路径(trail)中的检测率和稀释影响
如表2中所示，在测试的覆盖香港的第三波COVID-19感染(从2020年6月8日到9月29日)的107个污水样品中，在107个污水样品中的20个(19%)中检测到SARS-CoV-2的信号。这些样品包括从与治疗COVID-19患者的医院相关的场所收集的7个(12个中的，58%)样品，从个别建筑物和公共屋的合流检查井收集的4个(8个中的，50%)样品，以及从污水泵站和污水处理厂(其服务范围为约4万到多于100万的人口)收集的10个(87个中的，11%)样品。图6显示了在样品收集日期时的香港每日本地病例。
总体而言，建立的用于SARS-CoV-2的污水测试方法对于下水道流域是技术上可行的，所述下水道流域规模从个别建筑物的检查井到大型污水处理设施的入口。对于从医院路径、社区下水道系统和污水处理设施收集的样品，分别观察到58%、50%和10%的平均检测率。关于医院路径和社区下水道系统的可比较检测率提示了，当前方法在对于社区污水提供SARS-CoV-2的存在/不存在信息方面的有效性。
由于与医院路径相关的场所充当待测试场所的阳性对照，因此在医院路径场所中的阳性信号的检测发生率(即，检测率)，可能反映了随机性在提供存在/不存在信息方面的影响。对于在下游泵站处收集的医院污水，报告了66.7%(15个中的10个)的检测率。
在从PMH隔离病房的检测孔(PMH-1)直接收集的污水中，观察到最高水平的SARS-CoV-2 (1975个拷贝/mL污水)。此类病毒浓度高于对于在医院的调节池处收集的样品报告的255个拷贝/L和633个拷贝/L。沿着这条医院路径，从下游处的检查井(PMH-2)获取的样品具有0.4~16个拷贝/mL的范围，而在PMH-3(Waterboat Dock SPS)处的进一步下游样品具有46个拷贝/mL(7月23日)和0.7个拷贝/mL(8月18日)。这些结果显示了沿着污水管道从上游到下游的信号稀释。
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用于测试污水处理设施的方法的灵敏度
一般而言，由于沿着管道从上游到下游的信号稀释，对于来自污水处理设施的87个样品，随机观察到阴性或疑似阳性结果。关于定量来自污水处理设施的样品中的SARS-CoV-2的阳性结果的随机性易受下水道系统中的遗传信号稀释影响，所述稀释可能达到检测方法的边缘水平。为了使用在污水处理设施处的SARS-CoV-2的污水监测作为大行政区中的COVID-19暴发的指标，应该集中精力解决低浓度或稀释信号的挑战。
总结
这是报告香港的SARS-CoV-2污水测试的首例研究。污水测试方法已使用热灭活的SARS-Cov-2进行验证，并且该方法的适用性已在确定建筑物外部的检查井、连接社区污水的管道、以及下游泵站和常规处理厂的入口中的SARS-CoV-2遗传信号中得到确认。尤其是，通过分析来自医院路径的“阳性”样品来评估污水测试方法的性能。已揭示了医院路径中的12个样品中的7个(58%)为阳性，并且观察到沿着医院路径的管道的病毒信号稀释。还观察到信号丢失，其很可能是由于在上游医院检查井处的采样随机性或在下游污水处理设施处的稀释的影响所指出的。这是对于医院路径实施污水测试并比较跨越下水道系统特征的结果的首例研究，从而对于阳性污水样品的解释提供了更多背景。
该研究指示了，污水监测结果的解释连同采样场所特征对于决策者生成评价原理和可操作的建议是更具信息性的。使用SARS-CoV-2的污水监测来获得潜在社区暴发的预警信号已在回顾性研究(3、13、22-24)中得到大体报告，而只有两项研究已成功地证实了关于覆盖28,000 ~ 101,000人口的大型污水处理厂的这种使用情况(12、16)。在当前研究中，在鉴定COVID-19的首个病例之前，污水测试已用于提供关于感染个体的存在的信息，所述感染个体将SARS-CoV-2排出到服务约一千居民的单个建筑物下水道系统。尽管关于公共住宅有希望的结果，但在大面积的个别建筑物级别下的监控是非常耗资源的。由于监控在下游污水处理设施处的病毒浓度可以用于推断感染趋势(25)，因此对于从污水处理设施收集的污水的测试更适用于纵向污水监测。但是，当污水中的SARS-CoV-2病毒浓度很低时，该策略也充满挑战。这是排水流域中的感染病例与人口的比率(假设病毒载量/个体是相同的)。为了克服在下游污水处理设施处的稀释影响，需要灵敏度增加的方法。通过降低整个方法的定量极限(包括采样策略优化至粪便物排出的高峰时间、用于较大体积的污水样品的病毒浓缩和提取方案评估、以及RT-qPCR中的引物-探针组和试剂盒评价)，当前测试方法的灵敏度改善是可能的。对于使用RT-qPCR的SARS-CoV-2定量，关于靶向病毒的各种遗传基因座的不同引物-探针组的比较有助于辨别其对于污水样品的性能。考虑利用更大的反应体积以增加的样品模板用于一步RT-qPCR，目的是降低检测极限。
对于阳性样品的解释，应该规定分析限制。用于过程的合适质量指标的实施被视为对于测试性能必需的，也是改善测试结果的可重复性和可靠性的方法。基于序列的病毒鉴定是用于测试方法的有用的质量指标。此外，需要在样品的处理和加工中的明确分离，以降低样品交叉污染的风险。然而，阴性样品并不意味着病毒的不存在。采样中的随机性是不确定性源之一。在这项研究中也已观察到这种不确定性。在7月29日从Lok Yan House获取的样品对于SARS-CoV-2测试呈阴性，但在采样时间之前该建筑物中报告了感染病例(#2881)。这暗示所施加的测试方法可能漏掉建筑物或小排水流域面积中的阳性病例，如根据基本原理可知的。另一方面，如果检测到，则信号可能是非常强的。
污水监测数据与临床测试数据之间的相关性评价，对于在下一次COVID-19激增之前生成可操作信息是至关重要的。覆盖大部分COVID-19暴发的纵向污水分析，有助于避免污水测试结果的潜在误解。例如，一项研究在2020年1月到5月的整个暴发期过程中(首批病例在2020年3月3日报告)，测试了来自当地污水处理厂的116个污水样品，并且探索了与社区中的感染率的相关性。这项研究证实了污水中的SARS-CoV-2遗传信号强度与感染病例数目之间的高质量的相关性(27)。并且它得出结论，污水处理厂中的SARS-CoV-2动态可以用于预示COVID-19传播的趋势，比报告临床病例提前4-10天。应该注意的是，原则上，4 -10天的时滞反映了社区中的传播速率，因此这个数字可能不适用于其它地区如香港的情况。相比之下，在当前的研究中，这种相关性分析受限于测试的污水样品中的低浓度SARS-CoV-2(一般为几个拷贝/mL污水，与报告的研究中的高达1500个拷贝/mL相比)，以及当地社区中感染病例的相对低流行率。在提供预警和趋势分析之上，查明污水流域中的感染个体数目以及整合当前数据源以设定可操作的评价标准，可以成为该新兴方法的前进方向。
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Claims (36)

1.一种对污水流域进行采样，用于有效检测和评价在由该污水流域所服务的区域中的传染病因子存在情况的方法，所述方法包括：
在该污水流域的第一指定污水系统位置处收集第一多个污水样品，其中在第一收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集所述第一多个污水样品；和
合并所述第一多个污水样品，以形成第一复合污水样品。
2.权利要求1的方法，其中由该污水流域所服务的所述区域是单个建筑物、单个建筑综合体、单个校园、单个城市街区、单个邻里、单个社区、单个城市或单个行政区。
3.权利要求1或2的方法，其中所述第一指定污水系统位置是建筑物排水管、建筑综合体排水管、街道下水道管、泵站或废水处理厂。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第一收集期与第一指定污水系统位置相距由第一指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一收集期是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中收集所述第一多个污水样品的所述时间间隔是5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或60分钟。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述第一多个污水样品包含至少2个污水样品、3个污水样品、4个污水样品、5个污水样品、6个污水样品、7个污水样品、8个污水样品、9个污水样品、10个污水样品、11个污水样品、12个污水样品、14个污水样品、16个污水样品、18个污水样品、20个污水样品、22个污水样品、24个污水样品、25个污水样品、30个污水样品、35个污水样品、40个污水样品、45个污水样品、50个污水样品、55个污水样品、60个污水样品、65个污水样品、70个污水样品、75个污水样品、100个污水样品或125个污水样品。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其进一步包括：
在该污水流域的第二指定污水系统位置处收集第二多个污水样品，其中在第二收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集所述第二多个污水样品；和
合并所述第二多个污水样品，以形成第二复合污水样品。
9.权利要求8的方法，其中所述第二指定污水系统位置不同于所述第一指定污水系统位置。
10.权利要求8或9的方法，其中所述第二收集期与第二指定污水系统位置相距由第二指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其进一步包括：
在该污水流域的第三指定污水系统位置处收集第三多个污水样品，其中在第三收集期过程中，以大致相等的时间间隔收集所述第三多个污水样品；和
合并所述第三多个污水样品，以形成第三复合污水样品。
12.权利要求11的方法，其中所述第三指定污水系统位置不同于所述第一指定污水系统位置和所述第二指定污水系统位置。
13.权利要求8或9的方法，其中所述第三收集期与第三指定污水系统位置相距由第三指定污水系统位置所服务的建筑物的平均距离大致成比例。
14.一种检测在由污水流域所服务的区域中传染病因子的存在情况的方法，所述方法包括：
(a)将从由该污水流域所服务的区域收集的污水样品浓缩，其中所述污水样品通过以下进行浓缩：
(1)将污水样品离心；
(2)收集所得的上清液；
(3)将上清液超速离心；和
(4)将所得的沉淀重悬浮，
从而产生浓缩的污水样品；
(b)从浓缩的污水样品中提取核酸；和
(c)在提取的核酸中检测指示传染病因子的一个或多个核酸序列，从而检测在由该污水流域所服务的区域中传染病的存在情况。
15.权利要求14的方法，其进一步包括在步骤(2)之后且在步骤(3)之前，将步骤(2)的上清液离心。
16.权利要求14或15的方法，其中通过以下从浓缩的污水样品中提取核酸：
(1)将浓缩的污水样品裂解；
(2)用酚提取裂解的浓缩的污水样品；
(3)从酚提取的水相中沉淀核酸；和
(4)清洗旋转柱中的核酸。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中通过所提取的核酸的定量聚合酶链反应(qPCR)来检测指示传染病的核酸序列。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中通过所提取的核酸的逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来检测指示传染病的核酸序列。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述传染病因子是病毒。
20.权利要求14-19中任一项的方法，其中所述传染病因子是RNA病毒。
21.权利要求14-20中任一项的方法，其中所述传染病因子是冠状病毒。
22.权利要求14-21中任一项的方法，其中所述传染病因子是SARS-CoV-2。
23.权利要求14-22中任一项的方法，其进一步包括对基质对照执行所述方法步骤，其中所述基质对照是掺有所述传染病因子的污水样品。
24.权利要求14-23中任一项的方法，其进一步包括对试剂空白执行所述方法步骤，其中所述试剂空白是无污水对照样品。
25.权利要求14-23中任一项的方法，其中所述污水样品是根据权利要求1-13中任一项的方法形成的复合污水样品。
26.权利要求17-25中任一项的方法，其中在分开的反应中，用针对所述传染病因子中的两个或更多个靶序列的引物执行所述qPCR。
27.权利要求26的方法，其中所述qPCR运行45个循环。
28.权利要求26或27的方法，其中小于45的循环阈值(Ct)指示对于所述反应的引物组呈阳性。
29.权利要求26-28中任一项的方法，其中对引物组无一具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的存在呈阴性。
30.权利要求26-28中任一项的方法，其中对仅一个引物组具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的疑似存在。
31.权利要求26-28中任一项的方法，其中对两个或更多个引物组具有小于45的循环阈值(Ct)指示，对于污水样品中传染病因子的存在呈阳性。
32.权利要求26-31中任一项的方法，其中所述传染病因子是SARS-CoV-2。
33.权利要求32的方法，其中一个引物组针对SARS-CoV-2的N1基因，而另一个引物组针对SARA-CoV-2的E基因。
34.权利要求26-33中任一项的方法，其进一步包括对阳性对照执行qPCR，其中所述阳性对照具有包含SARS-CoV-2的N1基因的质粒。
35.权利要求26-34中任一项的方法，其进一步包括对阴性对照执行qPCR，其中所述阴性对照没有模板。
36.权利要求26-35中任一项的方法，其进一步包括对所扩增的核酸进行测序，以确认所扩增的核酸的身份。
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