JP2016195566A - 微生物製剤の製造方法及び微生物製剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明に係る微生物製剤の製造方法は、対象化合物を含む培地中で、対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、バイオマスに含まれる微生物を無機微粒子に担持させ、無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、を備え、対象化合物分解性微生物の存在割合が、無機微粒子担体に担持された微生物の16S rRNA遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる。
【選択図】なし
Description
[1]対象化合物分解性微生物を担持する微生物製剤の製造方法であって、対象化合物を含む培地中で、対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、バイオマスに含まれる微生物を無機微粒子に担持させ、無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、を備え、対象化合物分解性微生物の存在割合が、無機微粒子担体に担持された微生物の16S rRNA遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる、製造方法。
[2]対象化合物が(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸である、[1]に記載の製造方法。
[3]対象化合物がアンモニアである、[1]に記載の製造方法。
[4][1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法により製造された、微生物製剤。
[5][4]に記載の微生物製剤を用いた、化合物分解方法。
[6][4]に記載の微生物製剤の評価方法であって、微生物製剤に含まれる微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を指標として微生物製剤を評価する工程を備え、対象化合物分解性微生物の存在割合が、微生物製剤に含まれる微生物の16S rRNA遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる、評価方法。
本実施形態の対象化合物分解性微生物を担持する微生物製剤の製造方法は、対象化合物を含む培地中で、対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、バイオマスに含まれる微生物を無機微粒子に担持させ、無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、を備える。
対象化合物分解性微生物の存在割合は、無機微粒子担体に担持された微生物の16S rRNA遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる。
本実施形態の微生物製剤は、対象化合物の分解に利用することができる。対象化合物の分解方法としては、例えば、対象化合物を含む廃液等に対し、本実施形態の微生物製剤を添加し、攪拌する方法が挙げられる。このとき、添加する微生物製剤の量は、対象化合物の種類、反応槽の容量、微生物製剤に担持されている対象化合物分解性微生物の存在割合等により、適宜設定することができる。
本実施形態の微生物製剤の評価方法は、対象化合物分解性微生物の存在割合を指標として微生物製剤を評価する工程を備える。対象化合物分解性微生物の存在割合は、上述した方法を用いることができる。
(材料)
培地の製造に用いる成分の濃縮液を以下に示す方法で調製した。(NH4)2SO4 35.4gとNa2HPO4 7.7gを純水 500mLに溶解して、アンモニア態窒素15000mg/Lの窒素リン溶液とした。KCl 110gとCaCl2・2H2O 50gとCoCl2 1mgを純水 1000mLに溶解して、無機塩溶液1とした。NaMoO4・2H2O 5mgを純水 1000mLに溶解して無機塩溶液2とした。MgSO4・7H2O 85gとFeSO4・7H2O 8.5gとMnSO4・5H2O 2gとZnSO4 100mgとCuSO4・5H2O 100mgを純水 1000mLに溶解して無機塩溶液3とした。培養中に供給する培地は、(NH4)2SO4 0.2gとNa2HPO4 1.54gを純水 1000mLに溶解し、無機塩溶液1 1ml、無機塩溶液2 1ml、無機塩溶液3 1mLを加えることにより製造した。培地は、培養期間中に継続して供給するため、適宜、必要量を製造した。活性汚泥懸濁液は、化学工場の曝気槽から活性汚泥を採取して、活性汚泥濃度が5000mg−MLSS/Lとなるように純水を用いて調整した。MLSSとは、浮遊固形物(Mixed liquorVolatile Suspended Solid)のことである。MLSSは、下水試験方法 上巻 ―2012年度版― 公益社団法人日本下水道協会著に記載の方法に従って測定した。無機微粒子担体分散液は、純水800mlにフライアッシュ500gを加えて混合した懸濁液と、スミフロックFA−40H(MTアクアポリマー社製)60gを純水600mlに溶解した液を混合して製造した。
曝気部と固液分離を行うための沈降部とを備えるエアリフト型連続反応槽を用いて、微生物製剤の製造を行った。反応槽に活性汚泥懸濁液10L、窒素リン溶液10mL、無機塩溶液1 10ml、無機塩溶液2 10ml、無機塩溶液3 10mL、無機微粒子担体分散液1.4Lを加え、エアリフトにより攪拌し、培養を行った。これらを混合した培地は、10質量%H3PO4溶液及び10質量%Na2CO3溶液を用いて、pH7.5付近に制御した。水温は25℃に制御した。以下、反応槽中の培地を培養液という。
反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収し、これを孔径0.45μm、直径25mmのシリンジフィルター(アドバンテック社製)でろ過し、アンモニア態窒素検出キット及び分光光度計スペクトロクワントNOVA60(メルクミリポア社製)を用いて測定した。
反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点における、培養液中に含まれるアンモニア態窒素濃度及び供給用培地に含まれるアンモニア態窒素濃度から、アンモニア態窒素除去率を算出した。
反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点における、培地中に含まれるアンモニア態窒素濃度、供給用培地に含まれるアンモニア態窒素濃度、供給用培地の流量及び反応槽曝気部の培養液容量から、窒素処理能力を算出した。
・DNAの調製
硝化細菌の検出及びその存在割合の算出は、培養中の無機微粒子担体に活性汚泥が固着した対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、そこに含まれる微生物の16S rRNA遺伝子を用いた塩基配列データに基づいて求めた。対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中の微生物のDNAは以下の方法で調製した。
調製したDNA溶液中の二本鎖DNA濃度を測定し、その測定値に基づいて計算した50ngのDNAを鋳型として、ユニバーサルプライマーセット(フォワードプライマー及びリバースプライマー)を用いて、16S rRNA遺伝子のV3−V4領域をPCR増幅した。PCRはタカラバイオ社製の「Premix Ex Taq Hot Start Version」(登録商標)を用いて、各プライマーを50pmol含む反応液50μLを調製し、94℃で2分間のプレヒーティングを行った後、変性、アニーリング、伸長をそれぞれ98℃×10秒間、50℃×30秒間、72℃×80秒間で行い、これを25サイクル繰り返した。ユニバーサルプライマーセットを用いたPCRにより、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる各種微生物のDNA断片(約570bp)を増幅した。
増幅したPCR産物を、DNAクリーナー(和光純薬社製)で処理し、DNAを精製した。精製DNAは200μLのTE溶液で溶出・回収した。回収した精製DNA溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約570bpの位置に検出されるバンドをゲルごと切り出した。切り出したゲルからMinElute Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いてDNAを抽出し、これをシークエンサーに供するシークエンス用サンプルとした。
上記高精度塩基配列データを、OTU解析に供した。OTU解析では、95%以上の相同性を有する各配列データ同士を同じグループに分類し、複数のグループを形成した。OTU解析は、Uclustを用いて行った。OTU解析により得られた情報から、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の種類の決定及びそれぞれの微生物の存在割合の算出を行った。
対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を各日数培養した後のアンモニア態窒素除去率、窒素処理能力及び対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる硝化細菌(アンモニア酸化細菌(Nitrosomonas属)、亜硝酸酸化細菌(Nitrobacter属、Nitrospira属))の存在割合をまとめたものを表1に示す。培養中の対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の遺伝子解析情報によって、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中に含まれる硝化細菌の存在割合の変化を経時的に測定することができた。また、各種硝化細菌の増加に伴い、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体の窒素処理能力が増加していることも示された。
(材料)
培地の製造に用いる成分の濃縮液を以下に示す方法で調製した。MgSO4・7H2O 100gを純水 1000mLに溶解して、無機塩溶液Aとした。Na2HPO4 4.152gとNaH2PO4 2.244gと(NH4)2SO4 1.2gを純水 300mLに溶解して、無機塩溶液Bとした。(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸(純度約85質量%)1.18gを純水 100mLに溶解した(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸溶液(10g/L)を用いた。無機微粒子担体分散液は、純水250mlに活性汚泥焼却灰50gを加えて混合、懸濁させて製造した。活性汚泥懸濁液は、化学工場の曝気槽から活性汚泥を採取したものをそのまま用いた。培養中に供給する培地は、(NH4)2SO4 1.0gとNa2HPO4 1.3gとNaH2PO4 0.9gを純水 1000mLに溶解し、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸溶液 4.0mL、及び無機塩溶液1 1ml、無機塩溶液2 1ml、無機塩溶液3 1mLを加えることにより製造した。培地は、培養期間中に継続して供給するため、適宜、必要量を製造した。その他、培養開始時に用いる炭素源として、メタノールと水を7:3(v/v)程度の割合で含む工場由来副生油を用いた。
曝気部(容量1L)及び沈降部(容量0.4L)を備えるエアリフト型連続反応槽を用いて、微生物製剤の製造を行った。反応槽に、活性汚泥懸濁液570mLと無機塩溶液A 4.9mLと無機塩溶液B 300mLと工場由来副生油 13.2μLと(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸溶液 9.876mLと無機微粒子担体分散液と250mL、純水 70mLを加え、培地を調製した。この培地をエアリフトにより攪拌し、培養を行った。培地は、10質量%Na2CO3溶液を用いて、pH6.9付近に制御した。水温は25℃に制御した。以下、反応槽中の培地を培養液という。
培地中の(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸濃度は、培地を下記の条件でHPLCに供することで算出した。
・装置:LC−10A(島津製作所社製)
・カラム:SUMIPAX ODS A−211 4.6mm×250mm、5μ(住化分析センター社製)
溶媒:A液 0.01% TFA水溶液、B液 アセトニトリル、A液:B液=4:6
流速:1.0mL/分
オーブン温度:40℃
検出器:UV 220nm
サンプル注入量:10μL
反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点での、培養液中に含まれる(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸濃度、供給用培地に含まれる(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸濃度から、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去率を算出した。
反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点での、培地中に含まれる(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸濃度、供給用培地に含まれる(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸濃度、供給用培地の流量、反応槽曝気部の培養液容量から、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸処理能力を算出した。
(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解菌の検出及びその存在割合の算出は、培養中の無機微粒子担体に活性汚泥が固着した対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、そのDNAを用いた遺伝子解析情報に基づいて求めた。対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中の微生物の遺伝子解析情報は実施例1と同様の方法で得た。
対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を各日数培養した後の(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去率、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸処理能力及び対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性菌(Sphingomonadaceae科)の存在割合をまとめたものを表2に示す。培養中の対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の遺伝子解析情報によって、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性菌の存在割合の変化を経時的に測定することができた。また、Sphingomonadaceae科細菌の増加に伴い、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体の(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸処理能力が増加していることも示された。
培地の製造に用いる無機塩溶液は、実施例1と同じ、無機塩溶液1、無機塩溶液2、無機塩溶液3とした。(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸溶液は、実施例2と同じものを用いた。流入水は、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸溶液1mL、(NH4)2SO4 1g、Na2HPO4 1.298g、NaH2PO4 0.912gを純水 1000mLに溶解し、無機塩溶液1 1ml、無機塩溶液2 1ml、無機塩溶液3 1mLを加えることにより製造した。流入水は、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去反応期間中に継続して供給するため、適宜、必要量を製造した。活性汚泥懸濁液は、化学工場の曝気槽から活性汚泥を採取したものをそのまま用いた。
曝気部(容量3L)及び沈降部(容量1L)を備えるエアリフト型連続反応槽を用いて、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去反応を行った。(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去反応は、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物製剤が無い条件(A系列)と有る条件(B系列)の2種類の条件で行った。反応槽に流入水を加え、活性汚泥懸濁液を加え、活性汚泥濃度が2408mg−MLSS/Lとなるように調整し、培養液とした。MLSSとは、浮遊固形物(Mixed liquorVolatile Suspended Solid)のことである。B系列にのみ、更に上清を遠心分離により取り除いた実施例2で製造した、培養後54日目の(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物製剤を459mL分加え、培養液とした。A系列及びB系列の培養液を攪拌し、反応を開始した。流入水は1mL/分の速度で加えた。流入水は、10質量%Na2CO3溶液を用いて、pH7付近に制御した。水温は25℃に制御した。微生物製剤中の微生物の遺伝子解析情報は実施例1と同様の方法で得た。
(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去率及び(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物の測定は、実施例2に記載の方法と同様にして行った。
A系列及びB系列における、流入水の(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去率及び(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物の割合をまとめたものを、表3に示す。B系列では、反応開始時から(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物製剤を加えているため、4.6日目の時点から(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物の割合が高く、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去率も高かった。一方、A系列ではB系列に比べ、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸分解性微生物の割合の上昇が遅く、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸除去率も低かった。
Claims (6)
- 対象化合物分解性微生物を担持する微生物製剤の製造方法であって、
対象化合物を含む培地中で、前記対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、前記バイオマスに含まれる微生物を前記無機微粒子に担持させ、前記無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、
対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、
を備え、
前記対象化合物分解性微生物の存在割合が、
前記無機微粒子担体に担持された微生物の16S rRNA遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、
を含む方法によって得られる、製造方法。 - 前記対象化合物が(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記対象化合物がアンモニアである、請求項1に記載の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、微生物製剤。
- 請求項4に記載の微生物製剤を用いた、化合物分解方法。
- 請求項4に記載の微生物製剤の評価方法であって、
前記微生物製剤に含まれる微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を指標として前記微生物製剤を評価する工程を備え、
前記対象化合物分解性微生物の存在割合が、
前記微生物製剤に含まれる微生物の16S rRNA遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、
を含む方法によって得られる、評価方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020142187A (ja) * | 2019-03-06 | 2020-09-10 | 栗田工業株式会社 | 解析装置、解析システム及び解析方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020227548A1 (en) * | 2019-05-07 | 2020-11-12 | Aobiome Llc | Preparations of ammonia oxidizing microorganisms and related products |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5988098A (ja) * | 1982-11-09 | 1984-05-21 | Suntory Ltd | 固定化微生物の活性評価法 |
JPH06153989A (ja) * | 1992-11-25 | 1994-06-03 | Meidensha Corp | 生物固定化担体からの微生物剥離法及び生物分解機能評価法 |
JP2002282826A (ja) * | 2001-03-29 | 2002-10-02 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | メタン発酵方法およびその装置 |
JP2003274937A (ja) * | 2002-03-25 | 2003-09-30 | Sumitomo Chem Co Ltd | 微生物製剤の製造方法および微生物製剤 |
JP2007268471A (ja) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Ebara Corp | メタン発酵系における嫌気性微生物活性とメタン生成能の評価および制御方法 |
JP2008142704A (ja) * | 2006-11-15 | 2008-06-26 | Kobelco Eco-Solutions Co Ltd | 生物学的水処理のシミュレーション方法およびシミュレーション装置 |
JP2008212083A (ja) * | 2007-03-06 | 2008-09-18 | Kyoto Univ | テレフタル酸含有廃水処理において微生物を検出または定量するためのプライマーセット、それを用いた微生物量のモニタリング方法およびメタン発酵効率を評価する方法 |
JP2010531640A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-09-30 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 毒性化合物の分解方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5580770A (en) * | 1989-11-02 | 1996-12-03 | Alliedsignal Inc. | Support containing particulate adsorbent and microorganisms for removal of pollutants |
JPH09131178A (ja) | 1995-11-13 | 1997-05-20 | Sumitomo Chem Co Ltd | 微生物の凝集造粒方法 |
JPH09187272A (ja) | 1996-01-08 | 1997-07-22 | Sumitomo Chem Co Ltd | 硝化菌の連続培養法 |
JP2000354484A (ja) | 1999-04-16 | 2000-12-26 | Sumitomo Chem Co Ltd | 好気性微生物の保存方法 |
JP2002027976A (ja) | 2000-07-12 | 2002-01-29 | Sumitomo Chem Co Ltd | 硝化細菌及び硝化細菌資材の保存方法 |
JP2003334587A (ja) | 2001-05-16 | 2003-11-25 | Sumitomo Chem Co Ltd | 微生物製剤の施用方法 |
JP2003088355A (ja) | 2001-09-13 | 2003-03-25 | Sumitomo Chem Co Ltd | 好気性微生物の培養装置およびこれを使用した培養方法 |
JP3928492B2 (ja) | 2002-06-11 | 2007-06-13 | 栗田工業株式会社 | 混合微生物系の監視方法および管理方法 |
JP2005007262A (ja) | 2003-06-18 | 2005-01-13 | Sumitomo Chem Co Ltd | 排水中のアンモニア性窒素の硝化方法 |
KR20050112023A (ko) * | 2004-05-24 | 2005-11-29 | 주식회사 프로바이오닉 | 다이옥신 분해.제거용 미생물제제 및 이를 이용한다이옥신의 분해.제거방법 |
JP2010048566A (ja) * | 2008-08-19 | 2010-03-04 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Dnaを定量又は検出する方法 |
JP5170446B2 (ja) * | 2009-01-30 | 2013-03-27 | 株式会社日立プラントテクノロジー | 亜硝酸型硝化反応汚泥の製造方法及び製造装置、並びに廃水処理方法及び廃水処理装置 |
KR101095476B1 (ko) * | 2009-07-15 | 2011-12-16 | 이화여자대학교 산학협력단 | 신규한 메탄산화세균 큐프리아비더스 속 및 이를 이용한 메탄 및 휘발성유기화합물의 동시 저감방법 |
KR20170068259A (ko) * | 2015-12-09 | 2017-06-19 | 대한민국(관리부서:국립수산과학원) | 아질산 분해 능력이 있는 미생물 균주 및 이를 이용한 아질산 분해 방법 |
-
2015
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5988098A (ja) * | 1982-11-09 | 1984-05-21 | Suntory Ltd | 固定化微生物の活性評価法 |
JPH06153989A (ja) * | 1992-11-25 | 1994-06-03 | Meidensha Corp | 生物固定化担体からの微生物剥離法及び生物分解機能評価法 |
JP2002282826A (ja) * | 2001-03-29 | 2002-10-02 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | メタン発酵方法およびその装置 |
JP2003274937A (ja) * | 2002-03-25 | 2003-09-30 | Sumitomo Chem Co Ltd | 微生物製剤の製造方法および微生物製剤 |
JP2007268471A (ja) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Ebara Corp | メタン発酵系における嫌気性微生物活性とメタン生成能の評価および制御方法 |
JP2008142704A (ja) * | 2006-11-15 | 2008-06-26 | Kobelco Eco-Solutions Co Ltd | 生物学的水処理のシミュレーション方法およびシミュレーション装置 |
JP2008212083A (ja) * | 2007-03-06 | 2008-09-18 | Kyoto Univ | テレフタル酸含有廃水処理において微生物を検出または定量するためのプライマーセット、それを用いた微生物量のモニタリング方法およびメタン発酵効率を評価する方法 |
JP2010531640A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-09-30 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 毒性化合物の分解方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BELLUCCI, M. ET AL.: "Chapter Eleven Ammonia-oxidizing bacteria in wastewater", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 496, JPN6016024278, 2011, pages 269 - 286, ISSN: 0003977820 * |
KRAIGHER, B. ET AL.: "Nitrification activity and community structure of nitrite-oxidizing bacteria in the bioreactors oper", JOURNAL OF HAZARDOUS MATERIALS, vol. 188, JPN6016024275, 2011, pages 78 - 84, XP028162508, ISSN: 0003977819, DOI: 10.1016/j.jhazmat.2011.01.072 * |
中村洋介, 外1名: "バイオオーグメンテーション用微生物製剤の開発", 住友化学 技術誌 2003-II, JPN6016024272, 28 November 2003 (2003-11-28), pages 19 - 25, ISSN: 0003977818 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020142187A (ja) * | 2019-03-06 | 2020-09-10 | 栗田工業株式会社 | 解析装置、解析システム及び解析方法 |
JP7287009B2 (ja) | 2019-03-06 | 2023-06-06 | 栗田工業株式会社 | 解析装置、解析システム及び解析方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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