JP2000354484A - 好気性微生物の保存方法 - Google Patents
好気性微生物の保存方法Info
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Abstract
るいは微生物資材をその生理活性を維持したまま保存
し、使用を始める際には保存の時点と同等、あるいはそ
れに近い生理活性を発現し得るような保存方法を提供す
る。 【解決手段】 好気性微生物あるいは微生物資材を予め
高酸素分圧ガスに接触して保存する。
Description
に関するものである。
凍結乾燥、L−乾燥、継代培養、懸液等が知られてお
り、研究用微生物試料や工業利用微生物種菌株の保存の
ために利用されている。これらの方法は、微生物細胞内
の水分を制限したり、微生物の置かれる環境の温度、栄
養分や酸素などを制限したりして微生物の生理活性を抑
制することで保存を可能せしめるものである。しかし、
高い生理活性を発現している状態の微生物あるいは微生
物資材を、その生理活性を維持したまま保存し、かつ再
使用時に保存時点と同等、或いはそれに近い生理活性を
発現する技術としては、例えば特開平5−23170号
公報に記載されるようにVA(Vesicular Arbuscular M
ycorrhiza)菌根菌を保存する場合に酸素濃度を20容
積%未満とするといった、ごく限られた例しか報告され
ていない。
を含有する資材(以下、単に微生物資材という場合があ
る)を農工業や環境保全等に広く普及せしめるために
は、高い生理活性を発現している状態の微生物あるいは
微生物資材をその生理活性を維持したまま保存し、例え
ばそれを製造地点から使用する場所まで輸送した後、使
用を始める際に保存の時点と同等、或いはそれに近い生
理活性を発現し得るような保存方法の開発が強く求めら
れていた。
生理活性を発現している状態の微生物あるいは微生物資
材をその生理活性を維持したまま保存し、使用を始める
際には保存の時点と同等、或いはそれに近い生理活性を
発現し得るような保存方法を見出すことを目的として鋭
意検討した結果、好気性微生物あるいは微生物資材を予
め高酸素分圧ガスに接触しておけば、その後通気を遮断
して保存しても保存時点と同等、或いはそれに近い生理
活性を発現することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
気性微生物を高酸素分圧ガスで処理した後、保持するこ
とを特徴とする好気性微生物の保存方法を提供するにあ
る。
する。本発明は、好気条件で培養している好気性微生物
を高酸素分圧ガス(高濃度に酸素を含む空気)に接触、
例えば、好気性微生物に高酸素分圧ガスを通気する等の
方法で処理することにより、常温で保持する場合に於い
ても、保存時点と同等の生理活性を維持し得る微生物の
保存方法を提供するものである。
性微生物としては、液体培養可能な好気性菌全般、活性
汚泥、あるいはこれらを構成要素とし適当な微生物支持
材料等を混合した微生物資材等が挙げられ、就中、亜硝
酸菌、硝酸菌等の硝化菌を保存する場合に適している。
しては、例えば特開平9−131178号公報に記載
の、支持材料としての石炭焼却灰を微生物の懸濁液に添
加することにより得られる微生物の凝集造粒方法等があ
げられる。また、かかる凝集造粒方法により調製した微
生物資材を出発材料として、例えば特開平9−1872
72号公報に記載の、菌増殖槽へ供給するアンモニア量
を培養時間の経過に伴い対数増加させる連続培養方法に
よって硝化菌を増殖させ、硝化活性を高めた微生物資材
の調製方法も挙げられる。より具体的には、例えば培養
体積1000mLあたり、石炭焼却灰を約1g〜約20
0g、好ましくは約10g〜約100g、活性汚泥をML
SS(懸濁浮遊物質)濃度で約1000mg/L〜約2
0000mg/L、好ましくは約3000mg/L〜約
10000mg/Lを各々加えて混合し、硫酸アンモニ
ウム等のアンモニウム塩を含有する物質を主成分とし他
に金属塩類等を含有する水溶液、培地、下水、産業排水
等を回分または連続的に加えることにより硝化菌を増殖
した培養液等が挙げられる。
例えば化学工業的に生産された純酸素、あるいはPSA
(圧力スイング吸着)方式により空気中の酸素を濃縮し
酸素濃度を95%程度以上に高めた気体などをいう。本
発明の微生物保存方法においては、微生物の利用量を満
たしてなお余りある酸素、培養液溶存酸素濃度として約
2mg/L以上、好ましくは約6mg/L以上を好気性
微生物の培養液や懸濁液等に供給し、微生物を酸素雰囲
気に晒しておいたのち、通気を停止することにより行う
ことができる。
微生物資材は、少なくとも1ヶ月程度は保存微生物等の
生理活性を保持することが可能である。これは一般に国
内外の輸送には十分な期間であり、このようにして保存
した微生物等を直ちに機能発現可能な微生物資材とし
て、農工業・環境保全・医療・食品・バイオテクノロジ
ー等の用途に広く活用することを実現せしめるものであ
る。
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
Cu 0.061%, Ni 0.014%, Cr 0.006%, Pb 0.0055%, Sb
0.003%, Mo 0.0016%, As 0.00061%;粒径分布(個数分
布として)4.22μm〜75.45μm(ピーク9.12μm)]110g
を、0.3%カチオン性高分子凝集剤溶液(住友化学工業
製「スミフロック」FC-300 0.528gを水176mLに溶解した
もの)に4回に分けて加え、よく撹拌した後、0.1%アニ
オン性高分子凝集剤溶液(住友化学工業製「スミフロッ
ク」FA-30 0.132gを水132mLに溶解したもの)を追加し
てさらに30分以上撹拌した。
て11g混和し、硫酸アンモニウム0.71g/L(終濃度、以下
同じ)、リン酸二ナトリウム0.57g/L、塩化カリウム0.1
1g/L、硫酸マグネシウム七水和物0.085g/L、硫酸鉄(I
I)七水和物0.0085g/L、塩化カルシウム二水和物0.005g
/L、硫酸マンガン四水和物0.002g/L、モリブデン酸ナト
リウム二水和物0.05mg/L、硫酸亜鉛七水和物0.1mg/L、
硫酸銅五水和物0.1mg/L、塩化コバルト六水和物0.001mg
/Lからなる培地及び水を加えて3.4Lとしたものを同容量
のアクリル製円筒形反応器に入れた。この微生物懸濁液
のpHをpHコントローラにより約7.5に自動調節しな
がら反応器底部より一晩空気を供給して回分培養を行っ
た。培養温度は常温(約25℃)とした。
部を固形物の沈殿ゾーンとするための間仕切り)および
ドラフトチューブを挿入し、反応部有効容積2.2Lの三相
流動床型の気泡塔反応器とした。これに上記の培地を、
時間の経過とともにアンモニア濃度を対数的に増加しな
がら、pH約7.5、常温条件で連続培養を行った。培養
液の時間あたり容積あたりのアンモニア態窒素の酸化速
度(硝化活性mg-N/L/Hr)が約200を越えて以後、反応器
には高分圧酸素ガスを供給した。高分圧酸素ガスは、米
国AirSep社製PSA方式酸素発生装置「NEWLIFE Oxygen
Concentrator」を使用して生産し、酸素濃度95%±3%
のものを使用した。以後、反応器内の溶存酸素濃度は平
均約13mg/L(最低約2.5mg/L、最高約20mg/L)に保たれ
た。また、アンモニア態窒素の供給量を制限して、反応
器の硝化活性を約300mg-N/L/Hr、供給アンモニア態窒素
の除去率99%とした。これを高酸素分圧ガスの供給を遮
断し同時にエアリフトによる撹拌も停止して、固形物が
自然沈降した状態で反応器ごと常温(約25℃から約30
℃)に放置した。
応器を使用して、途中から反応器に高分圧酸素ガスを供
給することなく空気のままでエアレーションを継続した
という点を除き、同等条件で行った。この場合、培養液
の硝化活性が約200mg-N/L/Hを越えて以後、反応器内の
溶存酸素濃度は平均約1mg/L(最低約0.7mg/L、最高約1.
4mg/L)となった。反応器の硝化活性が約330mg-N/L/H
r、供給アンモニア態窒素の除去率87%の状態のもの
を、通気を停止し、常温放置した。いずれも保存中は反
応器内の撹拌やpH調節をとくに行わなかった。保存5
日を経過した時点で、空気エアレーションを行ってから
保存に至った反応器の方は沈殿固形物の一部が黒色化し
始めた。また、反応器内のpHも9.3まで上昇してい
た。これらのことより、微生物の腐敗が進行し始めたと
判断された。ゆえに、保存直前条件とほぼ同等の条件で
連続培養を再開した。培養再開の翌日、反応器の硝化活
性は約120mg-N/L/Hrまで低下していた。その後いったん
活性が急速に回復するかに見えたが停滞して、完全に復
帰するまでに通算9日間を要した。
常温保存に移行した反応器には、外観上の変化は見られ
なかったので約1ヶ月(36日)経過後、保存前と同条件
で培養を再開した。このとき反応器内のpHは8.3まで
しか上昇していなかった。培養再開後は、図1に示すよ
うにただちに保存前と同等の硝化活性が認められ、以後
培養を継続しても活性の低下は生じなかった。保存直前
に最確数法によって測定した反応器内の亜硝酸菌数は1.
6×1010個/mLであったものが、約1ヶ月後の培養再開直
前でも4.9×108個/mL生存していた。尚、図1は、実施
例における連続培養微生物の保存及び培養再開後の経過
を示すものであり、縦軸が硝化活性(硝化の量を表す一
つの指標)、横軸が通気を停止してからの経過日数を示
すものである。
汚泥を連続培養し、途中から高酸素分圧曝気を行ったも
のと行わなかったもの、それぞれの培養液を取り出し、
小分けして25℃で保存した場合の呼吸速度の経時変化を
測定した。
ン製回転子を入れ、これに硫酸アンモニウム1.4g/L及び
リン酸水素二ナトリウム3.0g/Lからなる溶液(pHおよそ
7)100mLを加えて、あらかじめ十分なエアレーションを
行って瓶内液の溶存酸素濃度を飽和状態とした。次に、
試料培養液5mLを加えて直ちに溶存酸素計(堀場製作所
製D-25型)の電極を挿入し、気泡を完全に排除しながら
瓶の口を封じた。マグネチックスターラーで瓶内液を攪
拌した状態で溶存酸素濃度の経時変化を5〜15分間計測
し、溶存酸素計に接続した記録計(横河電機製DR-130
型)によって記録した。同じ操作を瓶内液に硝化阻害物
質であるアリルチオ尿素を終濃度2mg/Lになるように添
加したものについて行い、同様に溶存酸素濃度の経時変
化を計測及び記録した。アリルチオ尿素を添加しない場
合の溶存酸素濃度の減少速度から同を添加した場合のそ
れを差し引き、別途測定した各懸濁浮遊物質の濃度(mg
-MLSS/L)あたりに換算したものを各試料の呼吸速度と
した。
たものと行わなかったもの、それぞれの微生物培養液を
汲み出した状態で約100mLずつガラス製バイヤル瓶に分
注しゴムキャップをしたもの各6点を一斉に25℃の保温
庫に静置保管し、保存0日目から34日目までの間に適宜
取り出して前記の呼吸速度測定を行った。図2(a)は、
高酸素分圧曝気を行った場合、同(b)は行わなかった場
合の微生物保存試料の相対酸素消費速度を示す。図2に
おいて、縦軸は、懸濁浮遊物質濃度あたりの相対酸素消
費速度であり、保存0日目を1とする。横軸は、保存後の
経過日数を表す。高酸素分圧曝気を行った場合は相対呼
吸速度の経時低下が緩やかであり、保存後34日目におい
ても呼吸速度が1割程度しか低下しなかった。他方、高
酸素分圧曝気を行わなかった場合は相対呼吸速度の経時
低下が顕著であり、保存後17日目には保存開始時の3分
の1付近まで呼吸速度が低下した。
ば、好気性微生物の保存に際し、高酸素分圧ガスで処理
するという極めて簡単な方法を採用するのみで、高い生
理活性を維持したまま常温で保存し得ることを可能とし
たもので、その産業上の利用価値は頗る大である。
化活性を示す。
す。
Claims (4)
- 【請求項1】好気性微生物を高酸素分圧ガスで処理した
後、保持することを特徴とする好気性微生物の保存方
法。 - 【請求項2】高酸素分圧ガスで処理される好気性微生物
が、好気性微生物を含有する資材であることを特徴とす
る請求項1記載の方法。 - 【請求項3】保持温度が常温であることを特徴とする請
求項1記載の方法。 - 【請求項4】微生物を含有する資材が、石炭焼却灰を使
用して微生物を凝集・造粒化したものであることを特徴
とする請求項1記載の方法。
Priority Applications (1)
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JP2000113346A JP2000354484A (ja) | 1999-04-16 | 2000-04-14 | 好気性微生物の保存方法 |
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JP2000113346A JP2000354484A (ja) | 1999-04-16 | 2000-04-14 | 好気性微生物の保存方法 |
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-
2000
- 2000-04-14 JP JP2000113346A patent/JP2000354484A/ja active Pending
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