JPS60133892A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニンの製造方法Info
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- JPS60133892A JPS60133892A JP59226949A JP22694984A JPS60133892A JP S60133892 A JPS60133892 A JP S60133892A JP 59226949 A JP59226949 A JP 59226949A JP 22694984 A JP22694984 A JP 22694984A JP S60133892 A JPS60133892 A JP S60133892A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/222—Phenylalanine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーセラ使用してト
ランス型ケイ皮酸をＬ−フェニルアラニンに転化する酵
素的方法は一般的に（ａ）フェニルアラニンアンモニア
リアーゼ（以後ＰＡＬと記す）生産微生物を相当量のＰ
ＡＬが生産されるまで水性栄養培地中で好気的に繁殖す
る、（ｂ）全培養性もしくはそれから分離した細胞また
は単離酵素のいずれかの形態で工程（＆）からのＰＡＬ
生産微生物の細胞をアンモニウムイオンおよびトランス
型ケイ皮酸塩イオンと接触して、制御した温度とｐＨ条
件下でＬ−フェニルアラニンへの転化が実質的に完了す
るまで反応を続行させる、および（Ｃ）反応混合物から
Ｌ−フェニルアラニンを分離回収する、各工程から成る
。
ランス型ケイ皮酸をＬ−フェニルアラニンに転化する酵
素的方法は一般的に（ａ）フェニルアラニンアンモニア
リアーゼ（以後ＰＡＬと記す）生産微生物を相当量のＰ
ＡＬが生産されるまで水性栄養培地中で好気的に繁殖す
る、（ｂ）全培養性もしくはそれから分離した細胞また
は単離酵素のいずれかの形態で工程（＆）からのＰＡＬ
生産微生物の細胞をアンモニウムイオンおよびトランス
型ケイ皮酸塩イオンと接触して、制御した温度とｐＨ条
件下でＬ−フェニルアラニンへの転化が実質的に完了す
るまで反応を続行させる、および（Ｃ）反応混合物から
Ｌ−フェニルアラニンを分離回収する、各工程から成る
。
前記の方法は、例えば、英国特許第１，４８９．４６８
号（１９７７年１０月１９日）に記載されている。この
方法を商業的製造に使用するための欠点はＰＡＬが比較
的不安定なことと基質ｔ−ケイ皮酸によるＰＡＬの阻害
でらった。Ｌ−フェニルアラニンの製造の方に反応を向
かわせ、基質阻害の影響に対処するために、上述の英国
特許はＰＡＬを大きな塊で、過剰濃度のアンモニウムイ
オンと共に使用する方法を記載している。
号（１９７７年１０月１９日）に記載されている。この
方法を商業的製造に使用するための欠点はＰＡＬが比較
的不安定なことと基質ｔ−ケイ皮酸によるＰＡＬの阻害
でらった。Ｌ−フェニルアラニンの製造の方に反応を向
かわせ、基質阻害の影響に対処するために、上述の英国
特許はＰＡＬを大きな塊で、過剰濃度のアンモニウムイ
オンと共に使用する方法を記載している。
ヤマダ、ニス（Ｙａｍａｄａ、Ｓ、）等（Ａｐｐｌ、ａ
ｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ。
ｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ。
Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、４２．７８７３−７７８（１９
８１））はＰＡＬ含有ロドトルラグルテ＝ ス（Ｒｈｏ
ｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｔｎｉａ）細胞を使用する
、ｔ−ケイ皮酸からＬ−フェニルアラニンを製造する方
法を記載している。彼らはこれまでにこの方法の実施が
適用されないのは微生物ＰＡＬの低い活性と不安定さに
帰することができると考えた。ヤマダ（Ｙａｍａｄｅ）
等はＬ−インロイシンがＰＡＬを安定させる効果を持
ち、その酵素の活性の有用期間を延ばすことを見出した
。従らはｔ−ケイ皮酸の実用的濃度（１５０ｍＭ ）に
おいてＬ−フェニルアラニンへの転化速度が最大速度の
半分に減少したことに注目して、基質の阻害効果にさら
に気づいた。
８１））はＰＡＬ含有ロドトルラグルテ＝ ス（Ｒｈｏ
ｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｔｎｉａ）細胞を使用する
、ｔ−ケイ皮酸からＬ−フェニルアラニンを製造する方
法を記載している。彼らはこれまでにこの方法の実施が
適用されないのは微生物ＰＡＬの低い活性と不安定さに
帰することができると考えた。ヤマダ（Ｙａｍａｄｅ）
等はＬ−インロイシンがＰＡＬを安定させる効果を持
ち、その酵素の活性の有用期間を延ばすことを見出した
。従らはｔ−ケイ皮酸の実用的濃度（１５０ｍＭ ）に
おいてＬ−フェニルアラニンへの転化速度が最大速度の
半分に減少したことに注目して、基質の阻害効果にさら
に気づいた。
上述の改良法にもかかわらず、本出願人が知るかぎり上
記のＰＡＬによる方法ばＬ−フェニルアラニンの商業的
製造には使用されていない。酵素の不安定さと低い活性
がこの方法の不利な点とじて依然として未解決のままで
必った。
記のＰＡＬによる方法ばＬ−フェニルアラニンの商業的
製造には使用されていない。酵素の不安定さと低い活性
がこの方法の不利な点とじて依然として未解決のままで
必った。
本発明によれば、Ｌ−フェニルアラニンヲ製造する改良
方法は次の工程を含む。
方法は次の工程を含む。
（ａ） 好気性生育促進条件下でＰＡＬ生産微生物を培
養する工程； （ｂ） ＰＡＬ生産条件下で工程（ａ）によって生産さ
れた細胞を誘発してＰＡＬを生産する工程；（ｃ） 工
程（ｂ）からのＰＡＬ含有細胞を実質的に嫌気性静止条
件下におきＰＡＬ活性を維持する工程；（ｄ） 工程（
ｂ）によって生産されたＰＡＬをｔ−ケイ皮酸およびア
ンモニウムイオンと実質的に嫌気性の静止Ｌ〜フェニル
アラニン製造条件下に化合させて、Ｌ−フェニルアラニ
ンを製造する工程；および （ｅ） そのようにして生産したＬ−フェニルアラニン
を回収する工程。
養する工程； （ｂ） ＰＡＬ生産条件下で工程（ａ）によって生産さ
れた細胞を誘発してＰＡＬを生産する工程；（ｃ） 工
程（ｂ）からのＰＡＬ含有細胞を実質的に嫌気性静止条
件下におきＰＡＬ活性を維持する工程；（ｄ） 工程（
ｂ）によって生産されたＰＡＬをｔ−ケイ皮酸およびア
ンモニウムイオンと実質的に嫌気性の静止Ｌ〜フェニル
アラニン製造条件下に化合させて、Ｌ−フェニルアラニ
ンを製造する工程；および （ｅ） そのようにして生産したＬ−フェニルアラニン
を回収する工程。
微生物的に生産したフェニルアラニンアンモニアリアー
ゼの触媒活性をＰＡＬ生産後の発酵培地中の酸素を低い
濃度に維持することによって安定化できることがわかっ
た。
ゼの触媒活性をＰＡＬ生産後の発酵培地中の酸素を低い
濃度に維持することによって安定化できることがわかっ
た。
本発明を実施することによシ、Ｌ−フェニルアラニンア
ンモニアリアーゼの存在下にトランス型ケイ皮酸とアン
モニアを反応してＬ−フェニルアラニンを製造する方法
が改良され、その結果Ｌ〜フェニルアラニンを高収率で
得られ、そしてＰＡＬの触媒活性を反応中高度に維持で
きる。
ンモニアリアーゼの存在下にトランス型ケイ皮酸とアン
モニアを反応してＬ−フェニルアラニンを製造する方法
が改良され、その結果Ｌ〜フェニルアラニンを高収率で
得られ、そしてＰＡＬの触媒活性を反応中高度に維持で
きる。
この改良法は実質的に嫌気性の静止条件下で酵素的転化
反応を実施することを含む。これらの条件はその反応の
過程においてＰＡＬ活性を非常に安定にし、従って、転
化速度および収率を高めることがわかった。この安定効
果の正確な機構は知られていないが、しかし、酸素によ
る化学的影響と攪拌による機械的影響が別々に作用して
酵素の活性を低下させるものと思われる。従って、これ
らの影響を最小にすることが酵素の有用寿命を延長する
のに役たつ傾向を示す。
反応を実施することを含む。これらの条件はその反応の
過程においてＰＡＬ活性を非常に安定にし、従って、転
化速度および収率を高めることがわかった。この安定効
果の正確な機構は知られていないが、しかし、酸素によ
る化学的影響と攪拌による機械的影響が別々に作用して
酵素の活性を低下させるものと思われる。従って、これ
らの影響を最小にすることが酵素の有用寿命を延長する
のに役たつ傾向を示す。
嫌気性条件は、不活性ガス（例えば、窒素）を吹き込ん
だ）、攪拌を弱めるかまたは止めたり、または細胞含有
培地上の表面をおおう上部空間を限定するというような
種々の手段によって達成できる。これらの技術の２種以
上を結合するのが有利である。
だ）、攪拌を弱めるかまたは止めたり、または細胞含有
培地上の表面をおおう上部空間を限定するというような
種々の手段によって達成できる。これらの技術の２種以
上を結合するのが有利である。
静止条件は実質的均一性を十分に維持できる最小限度ま
で転化反応混合物の攪拌を弱めることによって達成され
る。固体または固体に着いた反応成分の沈降を防止する
ために、特に全細胞反応において、多少の攪拌が一般的
に望ましい。
で転化反応混合物の攪拌を弱めることによって達成され
る。固体または固体に着いた反応成分の沈降を防止する
ために、特に全細胞反応において、多少の攪拌が一般的
に望ましい。
本発明の方法に使用するＰＡＬ生産微生物は生長するの
に酸素を必要とする。従って、細胞を好気性生育促進条
件下で最初培養する。一般的に、従来の方法を細胞生育
に使用する。炭素、窒素、必須ビタミン、必須無機質お
よび他の生育因子からなる同化源を含む栄養培地中に細
胞を接種する。
に酸素を必要とする。従って、細胞を好気性生育促進条
件下で最初培養する。一般的に、従来の方法を細胞生育
に使用する。炭素、窒素、必須ビタミン、必須無機質お
よび他の生育因子からなる同化源を含む栄養培地中に細
胞を接種する。
適当な炭素源にはブドウ糖、ショ糖、糖みつ、デンプン
、穀物等の種々のＮ製またはｍ製の戻水化物が含まれる
。好ましい炭素源の１つはブドウ糖である。窒素源には
リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、クエン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無
機アンモニウム塩および大豆粉、肉浸出液、アミノ酸類
、コーンステイープリカー（ｃｏｒｎ ５ｔｅｅｐ １
ｉｑｕｏｒ）、タンノ（り質加水分解物類、ペプトン、
酵母抽出液類等の有機含窒素物が含まれる。本発明の方
法に使用するのに好ましい窒素源の１つは酵母抽出液で
ある。
、穀物等の種々のＮ製またはｍ製の戻水化物が含まれる
。好ましい炭素源の１つはブドウ糖である。窒素源には
リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、クエン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無
機アンモニウム塩および大豆粉、肉浸出液、アミノ酸類
、コーンステイープリカー（ｃｏｒｎ ５ｔｅｅｐ １
ｉｑｕｏｒ）、タンノ（り質加水分解物類、ペプトン、
酵母抽出液類等の有機含窒素物が含まれる。本発明の方
法に使用するのに好ましい窒素源の１つは酵母抽出液で
ある。
、２−１イア−の壷差受は張去入りンの両方を供給する
リン酸二アンモニウムと一緒に使用するのが有利な場合
もある。
リン酸二アンモニウムと一緒に使用するのが有利な場合
もある。
ビタミン類、無機質および他の生育因子も炭素および窒
素源（例えば、酵母抽出液として）によって供給できる
し、または別々に供給することもできる。これらの成分
は使用する個々の微生物の種類によって変えうるもので
おる。代表例としてハ、亜鉛、マンガン、鉄、コバルト
およびカルシウムのような微量無機質を無機塩としてそ
れぞれ生長を促進する量で供給することができる。これ
らの無機質は、例えば、プロセス水（例えば、水道水、
海水等）と−緒に供給しうる上述の型の栄養培地はよく
知られており、その組成は広く変化することもできる。
素源（例えば、酵母抽出液として）によって供給できる
し、または別々に供給することもできる。これらの成分
は使用する個々の微生物の種類によって変えうるもので
おる。代表例としてハ、亜鉛、マンガン、鉄、コバルト
およびカルシウムのような微量無機質を無機塩としてそ
れぞれ生長を促進する量で供給することができる。これ
らの無機質は、例えば、プロセス水（例えば、水道水、
海水等）と−緒に供給しうる上述の型の栄養培地はよく
知られており、その組成は広く変化することもできる。
好気性条件下で所望の細胞密度に細胞を生育させた後、
その細胞を好気性のＰＡＬ生産条件下で誘発して、ＰＡ
Ｌを生産する。このＰＡＬ誘発は、ＰＡＬの基質として
作用する化合物を少量添加することによって一般的に達
成される。Ｌ−フェニルアラニンは良好なＰＡＬ誘発物
質の１つであシ、多くのＬ−フェニルアラニンの同族体
もこの酵素の合成を同様に誘発する。例えば、Ｄ、Ｌ−
フェニルアラニン、Ｌ−チロシンおよびり、Ｌ−チロシ
ン〃ぶこの目的のために使用できる。さらに、種々の粗
製窒素源がＰＡＬ誘発に使用できることが見出されたＯ
そのような粗製窒素源にはＬ−フェニルアラニンまたは
Ｌ−チロシンを相当量含有するカロ水分解タンパク質類
が含まれる。カゼインおよび血液カロ水分解物類をＰＡ
Ｌ合成の誘発のための粗製窒素源として有利に使用する
ことが可能である。
その細胞を好気性のＰＡＬ生産条件下で誘発して、ＰＡ
Ｌを生産する。このＰＡＬ誘発は、ＰＡＬの基質として
作用する化合物を少量添加することによって一般的に達
成される。Ｌ−フェニルアラニンは良好なＰＡＬ誘発物
質の１つであシ、多くのＬ−フェニルアラニンの同族体
もこの酵素の合成を同様に誘発する。例えば、Ｄ、Ｌ−
フェニルアラニン、Ｌ−チロシンおよびり、Ｌ−チロシ
ン〃ぶこの目的のために使用できる。さらに、種々の粗
製窒素源がＰＡＬ誘発に使用できることが見出されたＯ
そのような粗製窒素源にはＬ−フェニルアラニンまたは
Ｌ−チロシンを相当量含有するカロ水分解タンパク質類
が含まれる。カゼインおよび血液カロ水分解物類をＰＡ
Ｌ合成の誘発のための粗製窒素源として有利に使用する
ことが可能である。
ＰＡＬ誘発物質をＰＡＬ誘発量で細胞に添力日する。
その量は一般的に発酵培地１１Ｊツトル当たシ約０．１
から１０ｆの範囲でｂる。好ましくは、ＰＡＬ誘発物質
を発酵培地ｌリットリ当たり約４力１ら約８２の濃度で
使用する。この工程中、ＰＡＬ誘発条件（即ち、温度と
ｐＨおよび通気と攪拌）を維持する。
から１０ｆの範囲でｂる。好ましくは、ＰＡＬ誘発物質
を発酵培地ｌリットリ当たり約４力１ら約８２の濃度で
使用する。この工程中、ＰＡＬ誘発条件（即ち、温度と
ｐＨおよび通気と攪拌）を維持する。
一般的に温度とｐＨをＰＡＬ誘発誘発中学理学的合でき
る範囲内に維持する。幾分低くした温度（ｆｌｌえば、
約１５℃から約２５℃）が好ましい。これはこれらの低
めの温度において、酵素の安定性ｉｓ改善し、ＰＡＬ誘
発物質の消費速度が減少するからでおる。ＰＡＬ誘発の
ために好ましいｐＩ（は約５．５から約７．５の範囲で
ある。このｐＨ範囲が比較的より高いレベルのＰＡＬ誘
発をなしうる。
る範囲内に維持する。幾分低くした温度（ｆｌｌえば、
約１５℃から約２５℃）が好ましい。これはこれらの低
めの温度において、酵素の安定性ｉｓ改善し、ＰＡＬ誘
発物質の消費速度が減少するからでおる。ＰＡＬ誘発の
ために好ましいｐＩ（は約５．５から約７．５の範囲で
ある。このｐＨ範囲が比較的より高いレベルのＰＡＬ誘
発をなしうる。
使用細胞がＰＡＬ合成の異化産物抑制の影響を受けやす
いのであるならば、その時、誘発の前に、培地から異化
代謝物質およびそれらの前駆体を減少または排除する手
段を講じるべきで必る。この手段は培地から細胞を分離
し、それらを洗浄しそして異化代謝物質のない培地にそ
れらの細胞を懸濁させることによって果たすことができ
る。上記手段に代わるものとしては、ＰＡＬｉｆ％発工
程を開始する前に、栄養累を実質的に使い尽くすまで細
胞を生育させておくことでらる。
いのであるならば、その時、誘発の前に、培地から異化
代謝物質およびそれらの前駆体を減少または排除する手
段を講じるべきで必る。この手段は培地から細胞を分離
し、それらを洗浄しそして異化代謝物質のない培地にそ
れらの細胞を懸濁させることによって果たすことができ
る。上記手段に代わるものとしては、ＰＡＬｉｆ％発工
程を開始する前に、栄養累を実質的に使い尽くすまで細
胞を生育させておくことでらる。
ＰＡＬ活性が少なくても１ｒｎｔ当９０．５単位、好ま
しくはｌゴ当シ少なくても約２．０単位に達するまで、
細胞をＰＡＬ誘発条件下で培養するのが有利である。こ
の１単位のＰＡＬ活性は２２℃において１分間１り０．
８３マイクロモルのｔ−クイ皮酸または３０℃において
１分間当シ１マイクロモルのｔ−ケイ皮酸を生成する触
媒作用を及ぼす酵素の量として定義される。ＰＡＬ誘発
条件下で、ＰＡＬ活性はある点まで増加し、それから減
少し始めることがわかった。これらの方法によって生産
したＰＡＬを使用してｔ−ケイ皮酸とアンモニアからＬ
−フェニルアラニンを製造することができる。これらの
反応物は水性培地中のＰＡＬ含有細胞に直接添加可能で
ある。また水性培地から単離した細胞または酵素は酵素
活性を維持する限シ再使用できる固体支持体上に公知の
方法によって固定化できる。
しくはｌゴ当シ少なくても約２．０単位に達するまで、
細胞をＰＡＬ誘発条件下で培養するのが有利である。こ
の１単位のＰＡＬ活性は２２℃において１分間１り０．
８３マイクロモルのｔ−クイ皮酸または３０℃において
１分間当シ１マイクロモルのｔ−ケイ皮酸を生成する触
媒作用を及ぼす酵素の量として定義される。ＰＡＬ誘発
条件下で、ＰＡＬ活性はある点まで増加し、それから減
少し始めることがわかった。これらの方法によって生産
したＰＡＬを使用してｔ−ケイ皮酸とアンモニアからＬ
−フェニルアラニンを製造することができる。これらの
反応物は水性培地中のＰＡＬ含有細胞に直接添加可能で
ある。また水性培地から単離した細胞または酵素は酵素
活性を維持する限シ再使用できる固体支持体上に公知の
方法によって固定化できる。
Ｌ−フェニルアラニンはＬ−フェニルアラニン製造条件
下で本方法によって製造される。これらの条件は、全細
胞または細胞から単離した酵素調製物を使用するかの如
何にかかわらず、さらに固定化系を使用するかどうかの
如何にかかわらず、個々の微生物菌株の種類によって変
わるものである。一般的に、ｔ−ケイ皮酸およびアンモ
ニア水（−またけ可溶性アンモニウム塩）をアンモニア
がモル基準でｔ−ケイ皮酸より著るしく多いような一一
山Ｊ＋Ｖ＋ ム ムノ＋馳ハイ甫ｍ婆ｋＥ ｈ−、徂Ａ
−物１リットル当シ約５から約２５ｆ１好ましくは約１
０から約２０？である。これらのｔ−ケイ皮酸濃度にお
いて、アンモニアの濃度は一般的に約ｏ、ｉから約９．
０モル、好ましくは約５．０から約Ｓ、Ｏモルの範囲で
らる。ｔ−ケイ皮酸とアンモニアからし一フェニルアラ
ニンを製造するＦＡＩ、による触媒反応は可逆的である
。そして実際、その平衡点はし一フェニルアラニンの分
解する側におる。それゆえ、好適な反応速度を設定する
には、反応混合物中のｔ−ケイ皮酸濃度を相対的に高濃
度に維持するのが有利である。一方、ｔ−ケイ皮酸を過
度に高濃度にするとＰＡＬ活性を妨げることになる。
下で本方法によって製造される。これらの条件は、全細
胞または細胞から単離した酵素調製物を使用するかの如
何にかかわらず、さらに固定化系を使用するかどうかの
如何にかかわらず、個々の微生物菌株の種類によって変
わるものである。一般的に、ｔ−ケイ皮酸およびアンモ
ニア水（−またけ可溶性アンモニウム塩）をアンモニア
がモル基準でｔ−ケイ皮酸より著るしく多いような一一
山Ｊ＋Ｖ＋ ム ムノ＋馳ハイ甫ｍ婆ｋＥ ｈ−、徂Ａ
−物１リットル当シ約５から約２５ｆ１好ましくは約１
０から約２０？である。これらのｔ−ケイ皮酸濃度にお
いて、アンモニアの濃度は一般的に約ｏ、ｉから約９．
０モル、好ましくは約５．０から約Ｓ、Ｏモルの範囲で
らる。ｔ−ケイ皮酸とアンモニアからし一フェニルアラ
ニンを製造するＦＡＩ、による触媒反応は可逆的である
。そして実際、その平衡点はし一フェニルアラニンの分
解する側におる。それゆえ、好適な反応速度を設定する
には、反応混合物中のｔ−ケイ皮酸濃度を相対的に高濃
度に維持するのが有利である。一方、ｔ−ケイ皮酸を過
度に高濃度にするとＰＡＬ活性を妨げることになる。
従って、本発明における好ましい方法は、反応の後段を
除いて全工程の間反応混合物中にｔ−ケイ皮酸を定期的
または連続的に供給し、上記の濃度範囲内にこの反応物
の濃度を維持することを含む。
除いて全工程の間反応混合物中にｔ−ケイ皮酸を定期的
または連続的に供給し、上記の濃度範囲内にこの反応物
の濃度を維持することを含む。
一般的には、Ｌ−フェニルアラニン製造工程中の温度を
生理学的に容認できる範囲内に維持する。
生理学的に容認できる範囲内に維持する。
好ましい温度は約１０℃から約３０℃、最も好ま１、い
のは約１４℃から約２４℃の範囲である。これらの低い
反応温度が、反応速度に悪影響を与えることなく酵素の
安定性を延長することがわかった。Ｌ−フェニルアラニ
ン製造条件は、またアルカリ性のｐＩ（領域も含み、そ
の範囲は一般的に約９−から約１１、好ましくは約１０
．４から約１０．８のｐＨでらる〇 アンモニウム塩は）・ロゲンイオンを含まないものが好
ましい。基質溶液中にノ・ロダン類が存在するとＰＡＬ
の触媒活性を妨害することがわかった。
のは約１４℃から約２４℃の範囲である。これらの低い
反応温度が、反応速度に悪影響を与えることなく酵素の
安定性を延長することがわかった。Ｌ−フェニルアラニ
ン製造条件は、またアルカリ性のｐＩ（領域も含み、そ
の範囲は一般的に約９−から約１１、好ましくは約１０
．４から約１０．８のｐＨでらる〇 アンモニウム塩は）・ロゲンイオンを含まないものが好
ましい。基質溶液中にノ・ロダン類が存在するとＰＡＬ
の触媒活性を妨害することがわかった。
それゆえ、好適なアンモニウム塩としては、炭酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、クエン
酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモ
ニウムを含む。特に好適なアンモニウム塩は炭酸アンモ
ニウムである。基質溶液を調製するのに便利な方法はア
ンモニア水溶液にｔ−ケイ皮酸を溶解した後、二酸化炭
素を吹き込むか、硫酸のような鉱酸を添加することによ
って溶液のｐＨを所望のｐＨに調整することである。
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、クエン
酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモ
ニウムを含む。特に好適なアンモニウム塩は炭酸アンモ
ニウムである。基質溶液を調製するのに便利な方法はア
ンモニア水溶液にｔ−ケイ皮酸を溶解した後、二酸化炭
素を吹き込むか、硫酸のような鉱酸を添加することによ
って溶液のｐＨを所望のｐＨに調整することである。
ｔ−ケイ皮酸とアンモニアｉＬ−フェニルアラニンに転
化する酵素的方法は生化学反応容器中で行なうのが好ま
しい。この方法はろ過または遠心分離によってそれらの
発酵培地から細胞を分離し、その細胞をｔ−ケイ皮酸と
アンモニウムイオンを含む基質溶液中に懸濁するのが有
利である。この溶液に窒素のような不活性ガスを吹き込
み、溶存酸素を置換し、そして実質的に静止条件下に維
持する。
化する酵素的方法は生化学反応容器中で行なうのが好ま
しい。この方法はろ過または遠心分離によってそれらの
発酵培地から細胞を分離し、その細胞をｔ−ケイ皮酸と
アンモニウムイオンを含む基質溶液中に懸濁するのが有
利である。この溶液に窒素のような不活性ガスを吹き込
み、溶存酸素を置換し、そして実質的に静止条件下に維
持する。
上記した如く、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは
酸素の存在下において、そして攪拌の影響下において非
常に退化しやすいことがわかった。
酸素の存在下において、そして攪拌の影響下において非
常に退化しやすいことがわかった。
通常の反応容器（例えば、探検発酵槽）における攪拌は
１リットル当シ約０．５から５ワット程度の攪拌力で行
なわれるが、本発明の反応混合物の攪拌入力は、反応の
過程において、平均１リットル当シ約５００ミリワット
未満、好ましくは１リットル当シ約１００ミリワット未
満であるので有利である。例えば、１リツトル当シ約５
ワツトまでのより高い入力が使用できるが、しかしその
ような場合は、攪拌を断続的に、例えば、２時間の間隔
で３０秒混合するようにする。
１リットル当シ約０．５から５ワット程度の攪拌力で行
なわれるが、本発明の反応混合物の攪拌入力は、反応の
過程において、平均１リットル当シ約５００ミリワット
未満、好ましくは１リットル当シ約１００ミリワット未
満であるので有利である。例えば、１リツトル当シ約５
ワツトまでのより高い入力が使用できるが、しかしその
ような場合は、攪拌を断続的に、例えば、２時間の間隔
で３０秒混合するようにする。
攪拌力はまた酵素の安定性にも影響を与える。
低せん断混合が好ましい。この形式の攪拌を窒素のよう
な不活性ガスを反応混合物中に定期的に吹き込むことに
よシ都合、よく行なうことができる。
な不活性ガスを反応混合物中に定期的に吹き込むことに
よシ都合、よく行なうことができる。
さらに、低せん断混合用に設計された機械的攪拌機も使
用できる。この反応の過程において、反応系を実質的に
均一な混合物として維持するのに必要な程度にしか攪拌
を行なわないのが一般的である。
用できる。この反応の過程において、反応系を実質的に
均一な混合物として維持するのに必要な程度にしか攪拌
を行なわないのが一般的である。
かなシのＬ−フェニルアラニンが反応混合物中に蓄積す
るまで生化学反応を続行する。一般的に、Ｌ−フェニル
アラニンの濃度が約３０ ｆ／ｌ 、好ましくは約４５
〜５０ ？／ｌに達した時に回収工程を開始する。Ｌ−
フェニルアラニンはどのような適切な手段によっても反
応混合物から回収できる。
るまで生化学反応を続行する。一般的に、Ｌ−フェニル
アラニンの濃度が約３０ ｆ／ｌ 、好ましくは約４５
〜５０ ？／ｌに達した時に回収工程を開始する。Ｌ−
フェニルアラニンはどのような適切な手段によっても反
応混合物から回収できる。
例えば、固形物をろ過または遠心分離によって除去して
清澄溶液を産出し、セしてＬ−フェニルアラニンはその
溶液のｐＨをＬ−フェニルアラニンの等電点（即ち、約
５．５）に調整することによシ浴液から沈殿させること
ができる。
清澄溶液を産出し、セしてＬ−フェニルアラニンはその
溶液のｐＨをＬ−フェニルアラニンの等電点（即ち、約
５．５）に調整することによシ浴液から沈殿させること
ができる。
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであｐ、Ｐ
ＡＬ酵素の安定性と有用寿命に関して、嫌気性反応条件
を使用し、攪拌を弱めることの有効性を示すものである
。これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈し
てはならない。
ＡＬ酵素の安定性と有用寿命に関して、嫌気性反応条件
を使用し、攪拌を弱めることの有効性を示すものである
。これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈し
てはならない。
実施例１
Ｌ−フェニルアラニン製造におけるｐＨの効果を測定す
るために、１グラム乾燥細胞重量（ｄｅｗ）当た。９５
１ユニツトのＰＡＬ活性を有すると検定したロドトルラ
ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）細胞を
ｔ−ケイ皮酸とアンモニアの実験室規模の反応のために
使用した。この試験は２５℃、４ ｒ／ｌｄｅｗで行な
った。基質は１５ ｔ／ｌのケイ皮酸塩と１００ｙ７ｔ
の（ＮＨｑ）２８（ｈｌとから成り、そのｐＨはＮＨｌ
ＯＨで調整して９．４から１０．６の範囲であった。第
１表に示したこの実験の結果は最大転化速度がｐＨ１０
，６であったことを示している。ｐＨ１０，６およびそ
れ以上でＰＡＬ活性が減少し始めるのもわかった。
るために、１グラム乾燥細胞重量（ｄｅｗ）当た。９５
１ユニツトのＰＡＬ活性を有すると検定したロドトルラ
ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）細胞を
ｔ−ケイ皮酸とアンモニアの実験室規模の反応のために
使用した。この試験は２５℃、４ ｒ／ｌｄｅｗで行な
った。基質は１５ ｔ／ｌのケイ皮酸塩と１００ｙ７ｔ
の（ＮＨｑ）２８（ｈｌとから成り、そのｐＨはＮＨｌ
ＯＨで調整して９．４から１０．６の範囲であった。第
１表に示したこの実験の結果は最大転化速度がｐＨ１０
，６であったことを示している。ｐＨ１０，６およびそ
れ以上でＰＡＬ活性が減少し始めるのもわかった。
実施例２
ＰＡＬ活性に対する攪拌および空気（酸素供給）の影響
を２５℃、ｐＨ１０，３またはｐＨ９，４でロドトルラ
ルブラ細胞を２および４ ？／Ｌ ｄｅｗ使用してＬ−
フェニルアラニンを製造する比較転化反応によって調べ
た。これらの実験結果を第２表に示す。
を２５℃、ｐＨ１０，３またはｐＨ９，４でロドトルラ
ルブラ細胞を２および４ ？／Ｌ ｄｅｗ使用してＬ−
フェニルアラニンを製造する比較転化反応によって調べ
た。これらの実験結果を第２表に示す。
触媒の効率は反応容器を反応物質で完全に充満すること
により、または窒素で置換するかもしくは反応物質中に
窒素を吹き込んで反応容器を不活性雰囲気に維持するこ
とによって酸素を排除した非攪拌反応容器中において強
化された。
により、または窒素で置換するかもしくは反応物質中に
窒素を吹き込んで反応容器を不活性雰囲気に維持するこ
とによって酸素を排除した非攪拌反応容器中において強
化された。
実施例３
ケイ皮酸とアンモニアからのＬ−フェニルアラニンの製
造を高ＰＡＬ酵素活性を有するロドトルラルブラ（Ｒｈ
ｏｄｏす。ｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）の全細胞を使用して
生化学反応器で行なった。３９０ｔの水に１Ｌ２〜のト
ランス型ケイ皮酸を加えた。次に４７０１の２９％アン
モニア水を加えた。ケイ皮酸を溶解した後溶液のＰＨを
３１ Ｋｇの二酸化炭素を加えて１０．６に調整した。
造を高ＰＡＬ酵素活性を有するロドトルラルブラ（Ｒｈ
ｏｄｏす。ｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）の全細胞を使用して
生化学反応器で行なった。３９０ｔの水に１Ｌ２〜のト
ランス型ケイ皮酸を加えた。次に４７０１の２９％アン
モニア水を加えた。ケイ皮酸を溶解した後溶液のＰＨを
３１ Ｋｇの二酸化炭素を加えて１０．６に調整した。
溶液を５分間窒素ガスを吹き込むことにより嫌気性に・
した。５．０６Ｋｖ（乾燥重量）のロドトルラルブラ（
Ｒｈｏｄｏ士ｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）細胞を基質溶液
に加えた。そして反応を１３０時間続行させた。追加の
基質を濃縮ケイ皮酸アンモニウム溶液の形で生化学反応
器に定期的に加えた。
した。５．０６Ｋｖ（乾燥重量）のロドトルラルブラ（
Ｒｈｏｄｏ士ｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）細胞を基質溶液
に加えた。そして反応を１３０時間続行させた。追加の
基質を濃縮ケイ皮酸アンモニウム溶液の形で生化学反応
器に定期的に加えた。
各追加の終了後、生化学反応器の内容物を窒素ガスを吹
き込むことによシ短時間混合した。生化学反応器内の温
度は培養の最初の１７時間の間２９℃に維持した。それ
から１３℃になるまで１３０時間徐々に減少させた。
き込むことによシ短時間混合した。生化学反応器内の温
度は培養の最初の１７時間の間２９℃に維持した。それ
から１３℃になるまで１３０時間徐々に減少させた。
１３０時間の培養の後、基質溶液は４２．７ ｆ／ｚの
Ｌ−フェニルアラニンおよび６．４ ？／ｌのトランス
型ケイ皮酸を含有していた。
Ｌ−フェニルアラニンおよび６．４ ？／ｌのトランス
型ケイ皮酸を含有していた。
細胞をディスク−ボウル（ｄｉｓｃ −ｂｏｗｌ） 型
遠心分離機によって基質溶液から分離した。遠心分離機
からの上澄み液をろ過したのち、アンモニアと炭酸アン
モニウムを留去した。冷却して、Ｌ−フェニルアラニン
結晶を沈殿させた。Ｌ−フェニルアラニン結晶を籠（ｂ
ａｓｋｅｔ） 型遠心分離機で収集し、冷水ですすぎそ
して乾燥した。２２ＫｆのＬ−フェニルアラニンを回収
した。
遠心分離機によって基質溶液から分離した。遠心分離機
からの上澄み液をろ過したのち、アンモニアと炭酸アン
モニウムを留去した。冷却して、Ｌ−フェニルアラニン
結晶を沈殿させた。Ｌ−フェニルアラニン結晶を籠（ｂ
ａｓｋｅｔ） 型遠心分離機で収集し、冷水ですすぎそ
して乾燥した。２２ＫｆのＬ−フェニルアラニンを回収
した。
第１頁の続き
＠発明者 ヒユーエイ・ハスイン
グ・ヤング
庁内整理番号
Claims (9)
- （１）次の工程から成るＬ−フェニルアラニンを製造す
る方法・ （ａ） 好気性生育促進条件下でＰＡＬ生産微生物を培
養する工程； （ｂ） ＰＡＬ生産条件下で工程（ａ）で生産した細胞
を誘発してＰＡＬ金生産する工程； （Ｃ）工程（ｂ）からのＰＡＬ含有細胞を実質的に嫌気
性静止条件下におきＰＡＬ活性を維持する工程；（ｄ）
工程（ｂ）によって生産されたＰＡＬ ｆ、ｔ−ケイ
皮酸乍およびアンモニウムイオンと実質的に嫌気性の静
止Ｌ−フェニルアラニン製造条件下に化合させて、Ｌ−
フェニルアラニンを製造する工程；および （ｅ）そのようにして製造したＬ−フェニルアラニンを
回収する工程。 - （２）前言２下胆（ｃｌ ｂ ］” ｒＫ （Ａ）の１
４？ｉ’Ｌｊ＆ｄ＆４１Ｊ＝−Ａｔ ７：？Ｅ＝性ガス
をＰＡＬ生産細胞を含む培地に吹き込むことによシ少な
くとも部分的に達成される特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - （３） 前記工程（ｃ）および（ｄ）の実質的静止条件
が、不活性ガスをＰＡＬ生産細胞を含む培地に定期的に
吹き込むことによって達成される特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （４） 前記工程（Ｃ）および（ｄ）の実質的静止条件
が、低せん断攪拌機を使用する低度の機械的攪拌によっ
て達成される特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （５） 前記攪拌の入力が、反応の過程において、培地
１リツトル当たシ平均約５００ミリワット未満である特
許請求の範囲第３項または第４項記載の方法。 - （６） 前記攪拌の入力が、反応の過程において、培地
１リツトル当たシ平均約１００ミリワット未満である特
許請求の範囲第５項記載の方法。 - （７）前記工程（ｂ）において、前記細胞が、Ｌ−フェ
ニルアラニン、Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシ
ン、Ｄ、Ｌ−チロシン、およびＬ−フェニルアラニンま
たはＬ−チロシン金相肖量含む加水分解たん白質から成
る群から選ばれるＰＡＬ誘発物質のＰＡＬ誘発量を添加
することによって、誘発してＰＡＬを生産するように誘
導される特許請求の範囲第５項記載の方法。 - （８）前記ＰＡＬ生産条件が１５℃から約２５℃の温度
および約５．５から約７．５のｐＨを含む特許請求の範
囲第７項記載の方法。 - （９）前記ＰＡＬ生産条件がＰＡＬ誘発の間前記細胞培
地中に実質的に異化代謝物質を含まないことをさらに条
件とする特許請求の範囲第８項記載の方法Ｏ α〔前記工程（ｄ）において、前記Ｌ−フェニルアラニ
ン製造条件が濃度約５から約２５ ｆ／ｌの１−ケイ皮
酸および濃度約０．１から約９．０モルのアンモニアを
含む特許請求の範囲第５項記載の方法。 （１１１前記工程（ｄ）において、前記Ｌ−フェニルア
ラニン製造条件が濃度約１０から約２０り／ｌのｔ−ケ
イ皮酸および濃度約５．０から約８．０モルのアンモニ
アを含む特許請求の範囲第５項記載の方法。 （１り 前記ｔ−ケイ皮酸の濃度が、反応の後段を除い
て全工程の間反応混合物中にｔ−ケイ皮酸を定期的また
は連続的に供給することによって約５から約２５ ？／
ｌの濃度範囲に維持される特許請求の範囲第１０項記載
の方法。 （１３１ｉｆｊｌ記Ｌ−フェニルアラニン製造条件が約
１０℃から約３０℃の反応温度および約９から約１１の
ｐＨをさらに含む特許請求の範囲第１０項記載の方法。 ■ 前記Ｌ−フェニルアラニン製造東件が約１４℃から
約２４℃の反応温度および約１０．４から１０．８のｐ
Ｈをさらに含む特許請求の範囲第ｉｏ項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US547258 | 1983-10-31 | ||
| US06/547,258 US4584269A (en) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | Method for stabilizing the enzymatic activity of phenylalanine ammonia lyase during L-phenylalanine production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60133892A true JPS60133892A (ja) | 1985-07-17 |
Family
ID=24183968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59226949A Pending JPS60133892A (ja) | 1983-10-31 | 1984-10-30 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4584269A (ja) |
| EP (1) | EP0143560A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60133892A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6143993A (ja) * | 1984-08-08 | 1986-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | α−アミノ酸の製造法 |
| JPS6291190A (ja) * | 1985-10-17 | 1987-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2010058558A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | アラニン高含有酵母の製造方法 |
| WO2010058551A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | アミノ酸高含有酵母の製造方法 |
| WO2011145525A1 (ja) * | 2010-05-17 | 2011-11-24 | アサヒビール株式会社 | アラニン高含有調味料組成物 |
| US9005683B2 (en) | 2008-11-18 | 2015-04-14 | Asahi Group Holdings, Ltd. | Method for producing yeast with high glutamic acid content |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4584273A (en) * | 1983-10-31 | 1986-04-22 | Genex Corporation | Method for the production of phenylalanine ammonia-lyase by fermentation |
| JPS60133893A (ja) * | 1983-10-31 | 1985-07-17 | ジェネックス・コーポレイション | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| EP0152235A3 (en) * | 1984-02-03 | 1987-05-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-phenylalanine and novel microorganisms therefor |
| EP0165757A3 (en) * | 1984-06-11 | 1987-07-22 | Genex Corporation | Production of l-phenylalanine |
| US4731469A (en) * | 1986-08-06 | 1988-03-15 | Synthetech, Inc. | Process for recovery and purification of L-phenylalanine |
| US4757015A (en) * | 1986-08-11 | 1988-07-12 | Genex Corporation | Phenylalanine ammonia lyase-producing strains |
| JP2931623B2 (ja) * | 1990-04-20 | 1999-08-09 | 三井化学株式会社 | Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 |
| US5981239A (en) * | 1997-09-24 | 1999-11-09 | Great Lakes Chemical Corp. | Synthesis of optically active phenylalanine analogs using Rhodotorula graminis |
| US8003356B2 (en) * | 2004-04-20 | 2011-08-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods for the preparation of para-hydroxycinnamic acid and cinnamic acid at alkaline pH |
| EP2216395A1 (en) * | 2009-02-09 | 2010-08-11 | Lonza Biologics plc. | Bioreactor for the cultivation of mammalian cells |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES433764A1 (es) * | 1974-02-22 | 1976-12-01 | Pfizer | Un procedimiento para preparar 1-fenilalanina. |
| US4584273A (en) * | 1983-10-31 | 1986-04-22 | Genex Corporation | Method for the production of phenylalanine ammonia-lyase by fermentation |
| US4574117A (en) * | 1984-06-06 | 1986-03-04 | Genex Corporation | Stabilization of phenylalanine ammonia-lyase in a bioreactor using reducing agents |
| JPS6143993A (ja) * | 1984-08-08 | 1986-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | α−アミノ酸の製造法 |
-
1983
- 1983-10-31 US US06/547,258 patent/US4584269A/en not_active Expired - Fee Related
-
1984
- 1984-10-30 JP JP59226949A patent/JPS60133892A/ja active Pending
- 1984-10-30 EP EP84307523A patent/EP0143560A3/en not_active Withdrawn
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| JPS6143993A (ja) * | 1984-08-08 | 1986-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | α−アミノ酸の製造法 |
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| JPH0548117B2 (ja) * | 1985-10-17 | 1993-07-20 | Ajinomoto Kk | |
| WO2010058558A1 (ja) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | アサヒビール株式会社 | アラニン高含有酵母の製造方法 |
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| WO2011145525A1 (ja) * | 2010-05-17 | 2011-11-24 | アサヒビール株式会社 | アラニン高含有調味料組成物 |
| CN102905556A (zh) * | 2010-05-17 | 2013-01-30 | 朝日集团控股株式会社 | 高含量含有丙胺酸的调味料组合物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4584269A (en) | 1986-04-22 |
| EP0143560A2 (en) | 1985-06-05 |
| EP0143560A3 (en) | 1987-04-29 |
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